Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ АДАПТАЦИИ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ ЗЕМЛЯНИКИ

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, а именно к садоводству и питомниководству, и может быть использовано для подготовки растений-регенерантов земляники, выращенных в условиях in vitro, для адаптации к условиям ex vitro.

Известно, что одной из наиболее распространенных культур в садоводстве является земляника крупноплодная, также называемая ананасной или садовой (Fragaria х ananassa Duch.), а использование клонального микроразмножения этого растения позволяет получить не только оздоровленный посадочный материал, но и значительно ускорить процесс коммерческого размножения сортов земляники крупноплодной. Условия культивирования in vitro характеризуются постоянной высокой влажностью воздуха (достигающей 100%), пониженной освещенностью и гетеротрофным типом питания. Поэтому период адаптации ex vitro является стрессовым этапом для микрорастений, поскольку им необходимо приспосабливаться к обычным условиям среды, в которых на успешность адаптации растений влияют оптимальные параметры развития надземной части и корневой системы. Для успешного прохождения этого стрессового этапа необходим поиск новых регуляторов роста и развития, обеспечивающих быструю и эффективную приживаемость посадочного материала.

Известно, что на этапе адаптации микрорастения подкармливают раствором минеральных солей по прописи Мурасиге и Скуга (1. Сельскохозяйственная биотехнология: Учебник / В.С. Шевелуха, Е.А. Калашникова, Е.З. Кочиева и др.; под ред. В.С. Шевелухи. - 3-е изд., перераб и доп.- М.: Высш. шк., 2008. - С. 154-155). Данный раствор отличается хорошо сбалансированным составом питательных веществ, однако в нем не учтена необходимость балансировки по необходимому элементу - кремнию.

Согласно современным представлениям питание организмов должно быть сбалансировано по кремнию, и для этой цели разработан механокомпозит на основе рисовой шелухи и зеленого чая, содержащий в качестве источника кремния водорастворимый и биодоступный аморфный диоксид кремния (2. Пат. РФ №2438344, кл. А23K 1/00, А23K 1/16, опубл. 10.01.2012 г.). Продукт - кормовую муку, полученную механохимической обработкой в мельницах-активаторах по указанному патенту (2), будем в дальнейшем для краткости называть механокомпозитом. Данный механокомпозит содержит водорастворимые соединения кремния (в пересчете на кремний) в количестве 9-12 мкг/мл в испытуемой суспензии при испытании качества механокомпозита согласно (2).

Смысл термина «механокомпозит» заключается в подчеркивании фундаментальных отличий в строении и свойствах порошковых материалов - смешанных систем, сформированных при обработке в специальных мельницах-активаторах. Отличительным признаком механокомпозита является наличие развитой, с особыми свойствами, поверхности раздела фаз растительного сырья и реагента и связанная с данным эффектом повышенная реакционная способность (3. Механокомпозиты - прекурсоры для создания материалов с новыми свойствами / [А.И. Анчаров и др.]; отв. ред. О.И. Ломовский; Рос. акад. наук, Сиб. отд-ние, Ин-т химии твердого тела и механохимии [и др.]. -Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2010. - (Интеграционные проекты СО РАН; вып. 26). - С. 5).

Однако указанный механокомпозит на основе рисовой шелухи и зеленого чая был испытан на животных, но не был испытан для подкормки микрорастений земляники крупноплодной. Кроме того, не очевидно, что данный механокомпозит способен дать положительный эффект именно для микрорастений земляники крупноплодной и именно на стадии адаптации как в силу нетрадиционных состава и способа получения композита (состав: целлюлоза и гемицеллюлоза, водорастворимый кремний, катехины зеленого чая; способ получения: механохимический), так и в силу сложности стадии адаптации и множества факторов (температура, влажность, освещенность) и явлений, имеющих значение (например, нарушается или не нарушается деятельность устьичного аппарата, вследствие чего происходит или не происходит потеря большого количества воды и гибель растений; стимулирует или нет механокомпозит рост надземной части растений-регенерантов; стимулирует или нет механокомпозит состояние корневой системы растений-регенерантов; зависит или не зависит результат от генотипа, т.е. сорта земляники крупноплодной). Т.о. без доказательств - результатов специальных исследований - положительный эффект применения данного механокомпозита для целей настоящего изобретения не очевиден для специалистов. Эти доказательства - результаты специальных исследований - приводятся в настоящем изобретении ниже.

Известен «Способ получения посадочного материала земляники в культуре ткани» (4. Пат. РФ №2007072, кл. А01Н/00, опубл. 15.02.1994 г.), согласно которому при микроклональном размножении земляники укоренение и адаптацию побегов осуществляют одновременно в культивационных сосудах, которые перед покрытием термоусадочной пленкой дополнительно закрывают пробками, выполненными из автоклавированного перлита.

Недостатком известного технического решения, с точки зрения настоящего изобретения, является то, что на стадии адаптации для подкормки микрорастений не был применен кремнийсодержащий препарат, причем сама стадия адаптации не была выделена, так как укоренение и адаптация побегов осуществлялись одновременно в культивационных сосудах; вследствие этого общая приживаемость растений оказалась невелика (87% в полевых условиях, в теплицах - 75-80 %).

Наиболее близким техническим решением, выбранным за прототип, является «Способ подготовки растений земляники садовой (Fragaria L.), размноженных in vitro, к условиям культивирования ex vitro» (5. Пат. РФ №2302106, кл. А01Н/00, опубл. 10.07.2007 г.), который включает подготовку растений in vitro, то есть этап адаптации со специально подобранными условиями: растения выдерживают в темноте, при температуре от 1 до 10°С, на агаризованной питательной среде с 4-10% сахарозы в течение 20-60 дней, после чего переносят в почвенный субстрат.

В известном техническом решении укоренение и адаптацию побегов осуществляют не одновременно, а последовательно, то есть выделяют стадию адаптации (так что приживаемость высаженных в почву растений становится не ниже 95%), однако недостатком известного технического решения, с точки зрения настоящего изобретения, является то, что на стадии адаптации для подкормки микрорастений не был применен кремнийсодержащий препарат (обеспечивающий приживаемость не ниже 99%).

Задача, решаемая заявляемым техническим решением, заключается в улучшении адаптации растений-регенерантов земляники садовой благодаря подкормке микрорастений на стадии адаптации кремнийсодержащим препаратом.

Поставленная задача решается благодаря заявляемому способу адаптации растений-регенерантов земляники, включающему этап адаптации, в котором растения-регенеранты земляники крупноплодной в период адаптации увлажняют трижды за период через равные промежутки времени свежеприготовленной водной суспензией кремнийсодержащего механокомпозита на основе рисовой шелухи и зеленого чая, приготовленной путем перемешивания механокомпозита и воды комнатной температуры в концентрации 3 г/л и последующего настаивания в течение 1 часа при комнатной температуре, а в промежутках увлажняют дистиллированной водой.

Положительное влияние кремния на рост надземных органов растений можно объяснить усилением фосфорилирования сахаров, что в свою очередь увеличивает поступление энергии для метаболических процессов и синтеза сахаров (6. Adams F. Interaction of phosphorus with other elements in soil and in plants // Proc. Symp. The Role of Phosphorus in Agriculture. Am. Soc. Agron., Madison, WI, 1980. - P. 655). Положительное влияние кремния на развитие корневой системы растений можно объяснить тем, что дефицит кремния служит одним из лимитирующих факторов развития корневой системы растений (7. Колесников М.П. Формы кремния в растениях // Успехи биологической химии, 2001. - Т. 41. - С. 301-332; 8. Savant N.K., Snyder G.H., Datnoff L.E. Silicon management and sustainable rice production //Adv. Agron., 1997. - V. 58. - P. 158-199).

Заявляемый способ и исследования его результатов осуществляли на базе лаборатории биотехнологии ЦСБС СО РАН (г.Новосибирск). Объектом служили растения-регенеранты Fragaria х ananassa Duch. из коллекции ЦСБС СО РАН, полученные методом клонального микроразмножения в возрасте четырех месяцев. Использовались следующие сорта и гибриды: «Солнечная полянка», «Царица», «Улыбка июня», гибрид «5-90-21», «Боровицкая» и «Фестивальная». Выбор данных сортов обусловлен перспективностью их использования в условиях Западной Сибири благодаря повышенной устойчивости к биотическим и абиотическим факторам среды.

Механокомпозит на основе рисовой шелухи и зеленого чая был изготовлен в ИХТТМ СО РАН согласно (2).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью программы Statistica для Windows, версии 6.1 программного обеспечения StatSoft, Inc. Экспериментальные данные были проверены на соответствие нормальному распределению. Для каждого показателя были рассчитаны средние значения и стандартные ошибки среднего. Так как полученные результаты не подчинялись нормальному распределению, для выявления достоверных различий между параметрами в контрольном и опытном вариантах использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Различия считали достоверными при достигнутом уровне значимости р≤0,05.

Осуществление заявляемого способа показано в примерах.

Пример 1 (контроль: без механокомпозита)

При выращивании растений в условиях in vitro применяли стандартные методики культивирования. Использовали среды по прописи Мурасиге и Скуга с рН=5,6-5,8. Культивирование проводили в условиях 16-часового фотопериода, при температуре 23-24°С и освещенности 3-4 клк. Мультипликацию побегов осуществляли методом активации пазушных меристем ростовых побегов. В качестве индуктора побегообразования использовали цитокинин 6-бензиламинопурин в концентрациях 0,25-2,0 мг/л. Субкультивирование проводили через 25-30 суток. Микрорастения укореняли на агаризованной безгормональной питательной среде по прописи Мурасиге и Скуга с половинным содержанием макро- и микроэлементов и пониженным содержанием сахарозы (15 г/л). Для опытов отбирали регенеранты с высотой розетки 3,5-5,0 см, с 5-7 сформированными листьями, 2-6 корнями и корневой системой около 1,5-2,0 см. Растения вынимали из культуральных сосудов, отмывали корни от агара в дистиллированной воде, а затем помещали в вегетационные кассеты со стерильным кварцевым песком объемом 50 мл. Контрольную группу растений увлажняли водным раствором, содержащим концентрации стандартных компонентов среды по прописи Мурасиге и Скуга. Под каждое растение вносили 5 мл рабочего раствора путем полива. Опыты проводили в двухкратной повторности, в каждом варианте было использовано не менее 30 регенерантов. С целью предотвращения обезвоживания первые 10 суток растения находились в микропарнике (влажность 80-90%), затем их выращивали в обычных условиях, опрыскивая водой два раза в сутки. Полив растворами осуществляли трижды за этап через равные промежутки времени, в промежутках субстрат увлажняли дистиллированной водой. Продолжительность данного адаптационного периода составила 4 недели, при 16-часовом фотопериоде, температуре 23-25°С и освещенности 2-3 клк. Приживаемость растений фиксировали при появлении новых листьев в конце периода. Под приживаемостью растений понимали отношение числа укорененных растений-регенерантов к фактически высаженному числу, выраженное в процентах. Через 4 недели растения извлекали из культуральных сосудов и измеряли следующие ростовые параметры: количество листьев, количество корней, высоту розетки, длину корневой системы, определяли величину прироста данных показателей за исследуемый период.

На заключительном этапе адаптации растения извлекали из стерильного песка и пересаживали в стаканы с почвенным субстратом объемом 150 мл, состоящим из смеси торфа с перлитом, перегноя и песка в соотношении 1:1:0,5, не допуская засыпания верхушечной почки землей. Адаптацию осуществляли в условиях теплицы при 16-часовом фотопериоде, температуре 23-25°С, освещенности 15 клк и влажности воздуха 60-70%. Высаженные растения опрыскивали и регулярно поливали.

Полученные результаты приведены в таблице 1.

Пример 2 (опыт: с механокомпозитом)

Заявляемый способ осуществляли по примеру 1 с единственным отличием: растения увлажняли не водным раствором, содержащим концентрации стандартных компонентов среды по прописи Мурасиге и Скуга, а водной суспензией механокомпозита на основе рисовой шелухи и зеленого чая (концентрация 3 г/л). Суспензию механокомпозита для полива готовили свежую, механокомпозит перемешивали с водой комнатной температуры, настаивали 1 час при комнатной температуре, не фильтровали, при поливе постоянно перемешивали.

Полученные результаты приведены в таблице 1.

Примечания: ¹ - Обработка водным раствором 1/4 концентрации среды по прописи Мурасиге и Скуга.

²- Обработка водной суспензией механокомпозита, 3 г/л.

³ - Наличие достоверных различий по U-критерию (при р≤0,05).

⁴ - Среднее значение показателя ± стандартная ошибка среднего.

Результаты исследований показали, что через 4 недели культивирования земляники крупноплодной в кассетах при поливе водной суспензией механокомпозита на основе рисовой шелухи и зеленого чая все изучаемые сорта продемонстрировали достаточно высокую приживаемость растений-регенерантов (99,0-100%) по сравнению с контрольными вариантами (86,8-100%). При использовании данного препарата выявлено повышение приживаемости растений у сортов «Царица», «Фестивальная» и «Улыбка июня» на 13,2%, 8,3% и 5,9% соответственно (табл. 1).

Успех адаптивности регенерантов в значительной степени определяется биометрическими показателями ростовых параметров растений. В настоящем эксперименте растения отличались хорошо сформированной розеткой листьев в обоих вариантах. При этом морфометрические показатели количества листьев изучаемых образцов, кроме сорта «Улыбка июня», не имели достоверно значимых отличий. В то же время обнаружено стимулирующее влияние механокомпозита на рост надземной части растений-регенерантов. Прирост высоты розетки почти у всех исследованных сортов, обработанных водной суспензией механокомпозита, достоверно превысил контрольный вариант. В зависимости от генотипа высота розетки увеличилась относительно контроля в 1,3-4,1 раза, кроме сорта «Улыбка июня». Возможно, это отклонение от общей тенденции роста надземной части у данного сорта связано с его генетическими особенностями.

В настоящем эксперименте также показано положительное влияние обработки водной суспензией механокомпозита на основе рисовой шелухи и зеленого чая на рост корневой системы растений-регенерантов (табл. 1). Почти у всех исследованных сортов, обработанных водной суспензией механокомпозита, наблюдался более интенсивный прирост корней по сравнению с контрольными вариантами. Длина корневой системы достоверно увеличилась в 1,1-2,0 раза в зависимости от генотипа. У сорта «Царица» увеличение этого показателя оказалось недостоверным, хотя тенденция к увеличению длины корневой системы также наблюдалась. Регенеранты сортов «Боровицкая», «Солнечная полянка» и гибрида «5-90-21», обработанные водной суспензией механокомпозита, сформировали достоверно большее число корней по сравнению с контрольными вариантами. Количество корней увеличилось в 1,3-1,8 раза соответственно по сравнению с контрольной группой.

Для всех сортов зафиксировано достоверное увеличение биометрических показателей хотя бы по одному из ростовых параметров растений (табл. 1).

После адаптации в песке растения переносили в контейнеры с субстратом, состоящим из смеси торфа с перлитом, перегноя и песка (1:1:0,5), а через 4 недели в стаканы с той же смесью. Приживаемость на данном этапе составила 99,9%. Через 6 недель рассада соответствовала требованиям, предъявляемым к посадочному материалу земляники крупноплодной с закрытой корневой системой (9. Национальный стандарт Российской Федерации. ГОСТ Р 53135-2008. Посадочный материал плодовых, ягодных, субтропических, орехоплодных, цитрусовых культур и чая. Технические условия).

Достигаемый технический результат заявляемого технического решения заключается в улучшении адаптации земляники крупноплодной, выражающемся в улучшении роста и приживаемости растений-регенерантов F. ananassa в условиях ex vitro (до уровня не ниже 99%), благодаря подкормке микрорастений на стадии адаптации водной суспензией кремнийсодержащего механокомпозита на основе рисовой шелухи и зеленого чая.

Использование изобретения позволит микрорастениям земляники крупноплодной с помощью механокомпозита на основе рисовой шелухи и зеленого чая успешно пройти стрессовый этап - период адаптации ex vitro - и тем самым обеспечить быструю и эффективную приживаемость посадочного материала земляники крупноплодной.

Общественно-полезный эффект использования изобретения заключается в обеспечении населения плодами земляники крупноплодной.

Дополнительным положительным эффектом, достигаемым изобретением, является возможность развития химической промышленности в русле идеологии «зеленой» химии, требующей существенного увеличения доли возобновляемого сырья в химической промышленности, а это можно осуществить, в частности, за счет новых разработок в области переработки возобновляемого растительного сырья, таких как технология производства кремнийсодержащего механокомпозита на основе рисовой шелухи и зеленого чая.