Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОЦЕНКИ ДИСФУНКЦИИ ИММУНИТЕТА У ДЕТЕЙ ДОШКОЛЬНОГО ВОЗРАСТА С РЕЦИДИВИРУЮЩЕЙ РЕСПИРАТОРНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ, ПРОЖИВАЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИЯХ ВОКРУГ ХИМИЧЕСКИ ОПАСНЫХ ПРОИЗВОДСТВ

Изобретение относится к биологическим исследованиям и медицине.

Известно, что неблагоприятное воздействие антропогенной нагрузки, поступающей из среды обитания, влияет на здоровье детского населения. Поэтому диагностика и прогнозирование дисфункции иммунитета у детей дошкольного возраста с рецидивирующей респираторной инфекцией, проживающих на территориях вокруг химически опасных производств, являются актуальными. На примере многих регионов Российской Федерации показано, что сочетанные антропогенные нагрузки на детский организм проявляются увеличением частоты аллергических болезней, высокой частотой повторяющихся респираторных инфекций и иммунопатологических синдромов. Проблема частых респираторных инфекций у детей, непосредственно связанная с состоянием окружающей среды, продолжает оставаться в центре внимания педиатров.

В последние годы ведется интенсивный поиск и разработка объективных и информативных показателей ранних изменений в организме, обусловленных влиянием антропогенных факторов окружающей среды. Опираясь на экспериментальные данные и натурные наблюдения, подтверждено, что одной из наиболее чувствительной к воздействию окружающей среды является иммунная система, так как в основе развития иммунного ответа лежит интенсивная пролиферация антигенспецифических клеток-предшественников. Делящиеся клетки особенно подвержены влиянию различных факторов и агентов. Такая экологическая восприимчивость делает возможным использовать показатели иммунной системы как индикаторы воздействия этих факторов на ребенка.

Аллергические болезни относятся к многофакторным заболеваниям, в развитии которых принимает участие множество генов. Неблагоприятный генетический фон реализуется при взаимодействии с факторами внешней среды и проявляется в формировании патологического фенотипа (см., например, Н.Н. Рамазанова и др. Полиморфизм генов ИЛ4 (590 C>Т) и ИЛ4R (ИЛе50Vаl) у детей, больных бронхиальной астмой, проживающих в республике Башкортостан. Казанский медицинский журнал. 2007; Т. 88; 6:574-576).

В настоящее время известно более 600 генетических маркеров, обусловливающих развитие аллергических заболеваний. Накоплены результаты множества исследований, свидетельствующие об ассоциации аллельных вариантов генов интерлейкинов (ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-13, ФНОα), рецепторов (IgE receptor (MS4A2), ИЛ-4 receptor (иЛ4R), гена адренергических рецепторов (ADRB2)), генов ферментов детоксисикации ксенобиотиков у больных с аллергическими заболеваниями (см., например, Е.Я. Гречанина и др. Иммуногенетические характеристики бронхиальной астмы. АСТМА ТА АЛЕРГIЯ. 2011; 3:23-26; Ю.В. Останкова и др. Ассоциация полиморфизма промоторной области гена ФНОα с развитием атопической бронхиальной астмы. Экологическая генетика. 2005; Т.III; 3:33-37).

Цитокины определяют сложные межклеточные кооперативные взаимоотношения иммунокомпетентных клеток и при этом имеют свой генетический маркер. В свою очередь интерлейкины определяют различный тип Th1 и Th2 иммунного реагирования и формирование различных клинических вариантов аллергических заболеваний. Цитокины играют существенную роль в контроле всех стадий развития и поддержания аллергических реакций и воспаления, поэтому анализ регуляции их активности имеет очень большое значение для понимания молекулярных основ патогенеза аллергии и воспаления. Разнообразие генетических факторов определяет клинический полиморфизм и гетерогенность патологии. Полиморфизм по изучаемым генотипам может значительно отличаться в зависимости от этнической принадлежности и регионального фактора и определяет содержание цитокинов. (см., например, Е.Ю. Брагина и др. Полиморфизм генов биотрансформации ксенобиотиков GSTT1, GSTM1, CYP2E1 и CYP2C19 у больных атопической бронхиальной астмой. Бюллетень СО РАМН. 2005; 3 (117): 121-125; Annunziato F., Romagnani S. The transient nature of the Th17 phenotype. Eur J Immunol. 2010; 40(12): 3312-3316).

Известен способ оценки нарушений клеточного иммунитета при воздействии фенола (RU 2523418 С1, ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения, 20.07.2014). Производят отбор пробы крови и ее исследование с использованием опытного и контрольного образцов с предварительным введением в опытный образец токсиканта - фенола в концентрации, соответствующей его региональному фоновому уровню, и установление критериальных показателей, по которым судят о нарушении клеточного иммунитета. В качестве метода исследования используют тесты ex vivo влияния токсиканта на продукцию цитокинов клетками иммунной системы, а в качестве критериальных показателей используют индекс специфической чувствительности клеток для цитокина фактора некроза опухолей ФНОα и индекс специфической чувствительности клеток для цитокина Интерлейкина-10 ИЛ-10, которые определяют следующим образом: опытную и контрольную пробу крови вносят во флакон со стерильной питательной средой ДМЕМ с гепарином и гентамицином, осуществляют при 37°С в течение суток инкубацию этих проб, а затем центрифугирование в течение 3 мин при 1000 об/мин и в отобранном супернатанте опытной пробы определяют уровень фенол-индуцированной продукции цитокинов, ИПЦ_ИЛ-10 и ИПЦ_ФНОα, а в отобранном супернатанте контрольной пробы определяют уровень спонтанной продукции цитокинов, а именно уровень СПЦ_ИЛ-10 спонтанной продукции цитокина ИЛ-10 и уровень СПЦ_ФНОα спонтанной продукции цитокина ФНОα, далее рассчитывают индекс ИСЧ_ФНОα специфической чувствительности клеток для цитокина ФНОα, а также рассчитывают индекс ИСЧ_ИЛ-10 специфической чувствительности клеток для цитокина ИЛ-10 и при выполнении одновременного условия ИСЧ_ФНОα более 10 и ИСЧ_ИЛ-10 более 2 судят о нарушении клеточного иммунитета организма под воздействием фенола.

Однако этому способу свойственны недостатки, а именно: а) способ применим только при определенной исходной ситуации - наличии информации о загрязнении среды обитания, то есть первично известном вредном факторе - феноле; б) в исследовании не учтены возрастные особенности дифференцировки лимфоцитов у детей дошкольного возраста и способность последних к продукции ИЛ-10 и ФНОα; в) не определены аллельные варианты генов ИЛ-10 и ФНОα, которые также определяют уровни продукции цитокинов ИЛ-10 и ФНОα.

Описан также способ диагностики аллергических реакций (RU 2011126990 А1, МАССАЧУСЕТС ИНСТИТЬЮТ ОФ ТЕКНОЛОДЖИ, 10.01.2013), включающий отбор минимального объема крови, определение в нем набора цитокиновых характеристик, в частности IFN_γ или ИЛ-2, служащих признаком аутоиммунного заболевания. Увеличение уровня IFN_γ или ИЛ-2 по сравнению с нормальным уровнем IFN_γ или ИЛ-2 служит критерием аутоиммунного или инфекционного заболевания.

Однако данный способ имеет тот недостаток, что ИЛ-2 и IFN_γ являются цитокинами, находящимися в гомеостатическом синергизме. ИЛ-2 усиливает синтез IFN_γ, поэтому при повышении уровня ИЛ-2 неизбежно происходит синергическое повышение уровня IFN_γ, то есть способ недостаточно информативен.

Наиболее близким к изобретению является способ иммунологического мониторинга часто болеющих детей дошкольного возраста с гипертрофией аденоидов и/или аллергией, проживающих на территориях с различными экологическими характеристиками. Рекомендуется повторное иммунологическое обследование с определением содержания регуляторных Т лимфоцитов с фенотипом CD4+CD25+FOXP3+ для ранней диагностики регуляторной иммунологической недостаточности (см. «Характеристика естественных регуляторных Т лимфоцитов и их молекулярного маркера FOXP3 у часто болеющих детей дошкольного возраста, проживающих в условиях воздействия антропогенной нагрузки», Ветрова А.Д., дисс. к.м.н., М., 2013 - прототип).

Однако факторы неспецифической резистентности, показатели клеточного и гуморального (адаптивного) иммунитета не анализируются, что не позволяет в полной мере рассчитывать на достоверность выводов.

Изобретение направлено на решение технической проблемы - оценки дисфункции иммунитета у детей дошкольного возраста, проживающих в условиях повышенной антропогенной нагрузки, с использованием новой совокупности критериев. К настоящему времени создана стандартная и унифицированная методология оценки иммунологического статуса, позволяющая установить нормативные параметры основных компонентов иммунной системы в исследуемом регионе. Однако не разработаны критерии для проведения иммунологического мониторинга у детей с различными клиническими формами рецидивирующих респираторных инфекций, проживающих в условиях антропогенной нагрузки, которым и посвящено изобретение.

Предлагаемый способ оценки дисфункции иммунитета у детей дошкольного возраста с рецидивирующей респираторной инфекцией, проживающих на территориях вокруг химически опасных производств, состоит в отборе проб периферической крови и проведении иммуноферментного анализа.

Отличие способа состоит в следующем. В лимфоцитах полученных проб методом аллельспецифической полимеразной цепной реакции (ПЦР) определяют аллельные варианты A₁A₁ и А₁А₂ гена цитокина ФНОα и его содержание, а также содержание цитокинов Ил-10, IFN_γ, IgA.

При аллельном варианте A₁A₁ и содержании ФНОα>30 пг/мл, Ил-10<20 пг/мл, IFN_γ<12 пг/мл, IgA<1 г/л прогнозируют развитие дисфункции иммунитета на фоне течения рецидивирующей вирусной респираторной инфекции.

При аллельном варианте А₁А₂, содержании ФНОα<40 пг/мл, Ил-10>26 пг/мл, IFNγ>40 пг/мл, IgA>1,5 г/л прогнозируют благоприятное течение рецидивирующей респираторной вирусной инфекции без развития дисфункции иммунитета.

Технический результат изобретения - повышение достоверности оценки функций иммунитета у детей с рецидивирующей респираторной инфекцией.

Изобретение основано на проведенном большом объеме исследований здоровья детей дошкольного возраста с рецидивирующей респираторной инфекцией, проживающих в условиях повышенной антропогенной нагрузки, а именно на территориях вокруг химически опасных производств. Реакции детского организма на загрязняющие вещества даже в допороговых концентрациях существенно отличаются от таковых у взрослых. При этом наиболее «экологически чувствительными» являются показатели состояния здоровья детей раннего и дошкольного возраста. По мере повышения концентраций загрязняющих веществ в окружающей среде закономерно возрастает число детей в популяции, реагирующих на их присутствие. Экологически неблагополучные территории характеризуются высокой частотой рецидивирующих респираторных инфекций, аллергических заболеваний, хроническими соматическими заболеваниями, соматоформными расстройствами вегетативной нервной систем, отставанием детей в физическом развитии.

Всего было обследовано 187 детей, у каждого из которых были выполнены аллельспецифическая ПЦР и 748 количественных определений уровней цитокинов в периферической крови. В результате этих исследований определена популяционная принадлежность сформированной выборки обследуемых пациентов и показателей гомеостаза иммунной системы, определяющих тип Th1 или Th2 иммунного реагирования - аллельных вариантов A1, А2 гена ФНОα, содержания цитокинов - ФНОα, Ил-10, IFN_γ и IgA, что дало возможность оценить реакции иммунопатогенеза в диагностике развития аллергии или воспаления. При этом установленный тип иммунного ответа - аллергия или воспаление - определяет дальнейшую тактику лечения и профилактики осложнений рецидивирующих респираторных инфекций у детей.

Так, установлено, что моноаллели гена ФНОα (6р21.3-р21.1) контролируют разный уровень продукции данного цитокина: аллель ФНОαА1 обеспечивает относительно низкую продукцию ФНОα; аллель ФНОαА2 - высокую продукцию ФНОα. Установлено, что распределение аллельных вариантов гена ФНОα в анализируемой выборке соответствует европейской популяции. Это позволило при определении содержания ФНОα в качестве параметров сравнения использовать общеевропейские контроли содержания этого цитокина (см. таблицу).

Установлено также, что у обследованных детей-носителей аллельного варианта ФНОαА1А1 содержание цитокина ФНОα ниже, чем у детей-носителей аллельного варианта ФНОαА1А2 (р<0,05). Уровень цитокинов, Ил-10, IFN_γ и иммуноглобулина А (IgA), являющихся одними из основных компонентов формирования адаптивного иммунитета у детей дошкольного возраста с рецидивирующей респираторной инфекцией, носителей аллельного варианта ФНОαА1А2 значительно выше по сравнению с группой детей-носителей аллеля ФНОαА1 А1 (см. чертеж).

Результаты клинического наблюдения за обследуемыми детьми имеют ту же тенденцию, что и лабораторные показатели: заболеваемость респираторными инфекциями в группе детей-носителей аллеля ФНОαА1А2 с возрастом снижается по сравнению с группой детей-носителей аллельного варианта ФНОαА1А1. Обнаруженная резистентность к респираторным инфекциям у детей дошкольного возраста носителей алеля ФНОαА1А2, по-видимому, связана с преобладанием иммунных реакций типа Th 1.

Способ осуществляют следующим образом. Материалом для исследования были образцы периферической крови. У ребенка осуществляли взятие проб крови методом венепункции, которую проводили в лежачем положении обследуемого, использовали подкожные вены локтевого сгиба с соблюдением правил асептики и антисептики при максимальном разгибании локтевого сгиба путем подкладывания под него валика. Жгут выше места венепункции накладывали за несколько минут до ее выполнения.

Проведение молекулярно-генетических исследований выполнялось в Федеральном Государственном Бюджетном Научном Учреждении Медико-генетический научный центр.

Анализировали полиморфизм генов ФНОα с помощью тест-систем ООО НТП «Литех» (г. Москва) методом аллельспецифической полимеразной цепной реакции (ПЦР) (G-308A) в режиме «real-time». Количественное определение уровней цитокинов ФНОα, Ил-10 и IFN_γ выполняли с помощью иммуноферментных тест-систем «Цитокин» (г. Санкт-Петербург). IgA определяли с помощью иммуноферментной тест-системы «Вектор-Бест» (Россия).

Далее, в лимфоцитах полученных проб определили аллельные варианты A₁A₁ и А₁А₂ гена цитокина ФНОα и его количественное содержание, а также показатели количественного содержания цитокинов Ил-10, IFN_γ, IgA. Затем по установленным критериям при аллельном варианте А₁А₁, содержании ФНОα>30 пг/мл, Ил-10<20 пг/мл, IFN_γ<12 пг/мл, IgA<1 мг/мл прогнозировали дисфункцию иммунитета на фоне течения рецидивирующей респираторной инфекции. И напротив, при аллельном варианте А₁А₂, уровнях цитокинов ФНОα<40 пг/мл, Ил-10>26 пг/мл, IFN_γ>40 пг/мл, IgA>1,5 мг/мл прогнозируют благоприятное течение рецидивирующей респираторной вирусной инфекции без развития дисфункции иммунитета.

Всего было обследовано 187 детей: у каждого из них выполнено 187 молекулярно-генетических исследований и 748 количественных определений уровней цитокинов в периферической крови. При этом достоверность прогноза составила Р<0,05.

Достижение технического результата иллюстрируется примерами.

Клинический пример 1. Ребенок от 3 беременности, 3 срочных физиологических родов, доношенный, зрелый. Течение периода новорожденности - без особенностей. В первые 3 года жизни рос и развивался в соответствие с возрастными параметрами. Направлен впервые к аллергологу-иммунологу в связи с оформлением в детское дошкольное учреждение. Проведено иммунологическое обследование: аллельный вариант гена ФНОα A₁A₁, концентрация ФНОα - 48 пг/мл, Ил 10-18 пг/мл, IFN_γ - 9 пг/мл, IgA -0,6 г/л. Прогноз: дисфункция иммунитета.

Ребенок до 5 лет повторно наблюдался через 6-8 мес.Отмечалось развитие клинических признаков дисфункции иммунитета: эпизоды респираторной инфекции >8 раз в год (выше возрастной нормы), гипертрофия аденоидов II степени, гипертрофия миндалин II-III степени. Прогноз подтвержден.

Клинический пример 2. Ребенок 3 лет, от первой беременности, первых срочных физиологических родов, доношенный, незрелый. Течение периода новорожденности в пределах возрастных параметров. До 2 лет рос и развивался в соответствии с возрастом. По социально-бытовым причинам детское дошкольное учреждение начал посещать с 2,5 лет. На фоне посещения детского дошкольного учреждения за 6 месяцев у ребенка отмечалось 4 эпизода острого респираторного заболевания. Направлен к аллергологу-иммунологу. Проведено иммунологическое обследование: аллельный вариант гена ФНОα А₁А₂, концентрация ФНОα - 31 пг/мл, Ил 10-38 пг/мл, IFN_γ - 62 пг/мл, IgA - 2,1 г/л.

Прогноз: дисфункции иммунной системы не обнаружено.

При наблюдении в течение 1,5 лет клинических признаков иммунологической недостаточности не выявлено. Частота эпизодов острой респираторной инфекции соответствовала возрастным параметрам - 4-5 раз в год в период сезонных подъемов заболеваемости респираторными инфекциями.

Прогноз подтвержден.

Таким образом, патентуемый способ целесообразно применять при проведении иммунологического мониторинга у детей с различными клиническими формами рецидивирующих респираторных инфекций, проживающих в условиях антропогенной нагрузки, что позволит с большей достоверностью оценить функции иммунитета у детей дошкольного возраста.