Результат интеллектуальной деятельности: Штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15 для получения микробной белковой массы

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к штамму метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15 - продуценту микробной белковой массы, и может быть использован в сельском хозяйстве для кормления животных.

На сегодняшний день общая картина в России по производству кормовых белков не благоприятна. Согласно подписанной президентом России доктрины, для обеспечения собственным продовольствием на 80-90%, дефицит кормовых продуктов может составить не менее 2 млн тонн в год.

Основным источником белкового продукта является соевый шрот. Однако природные условия нашей страны не подходят для выращивания сои в достаточных количествах. Специалистам приходится искать другие способы производства кормового белка.

Известно, что традиционным сырьем для производства кормовых дрожжей были гидролизаты древесины и других растительных отходов, барда гидролизных и спиртовых заводов, щелоки целлюлозобумажных комбинатов, отходы капролактамового производства, молочная сыворотка, свеклосахарная меласса, мелассная и зерновая барда спиртовых заводов, жидкие углеводороды и метан.

Так, разработаны технологии производства кормового белка на основе отходов спиртовой (послеспиртовой барды) и мукомольной (отрубей, муки) промышленностей и смеси барды с отходами зернового сырья (патент РФ №2159287; патент РФ №2140449; авторское свидетельство СССР №1595900; авторское свидетельство СССР №1571061; авторское свидетельство СССР №1532580; авторское свидетельство СССР №1507787; патент РФ №2054881 и др.). В качестве культур-продуцентов в перечисленных изобретениях используют дрожжеподобные несовершенные грибы рода Candida. Недостатком известных штаммов микроорганизмов является отсутствие способности к активному росту в условиях длительного нестерильного процесса культивирования. Кроме того, использование дрожжей рода Candida в качестве культуры продуцента требует усложнения технологии производства путем обязательного введения стадии термообработки получаемой кормовой биомассы для гарантированного обеспечения отсутствия живых клеток в готовом продукте.

Известен штамм дрожжей Candida tropicalis ВСБ-928К - продуцент кормового белка (Патент РФ №2042713.) Недостатком данного известного штамма является использование для получения кормового белка дрожжей рода Candida, которые являются условно патогенным микроорганизмом, что требует выполнения дополнительного процесса термолиза и наличия специального оборудования, сложной системы обезвреживания стоков и воздушных выбросов при значительных объемах используемого воздуха.

Санитарно-эпидемиологическими правилами СанПиН 2.3.2.1078-01 дрожжи рода Candida включены в перечень веществ, которые оказывают вредное воздействие на здоровье человека. Скорость роста клеток известного штамма невысокая, что удлиняет производственный цикл и снижает удельный выход целевого продукта на стадии биосинтеза. Кроме того, при приготовлении кормового белка с использованием данного известного штамма дрожжей требуется большой расход тепло- и энергоресурсов для высушивания биомассы и значительный расход (1,5 г/л) сульфата аммония.

Известен штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ У-760 - источник белка и биологически активных веществ (Авт. св. СССР N 1575570). Недостатком штамма S. cerevisiae ВКПМ У-760 является способность роста при низкой концентрации субстрата в среде, что нетехнологично и снижает экономическую эффективность процесса культивирования. Другой недостаток штамма заключается в низкой продуктивности и высоком расходном коэффициенте (около 2), что снижает производственные показатели штамма. К числу недостатков штамма, исходя из его систематического положения, можно отнести способность к сбраживанию различных сахаров (глюкоза, галактоза, сахароза, мальтоза и раффиноза), что может приводить к вздутию животов при скармливании животным.

Использование бактерий в качестве продуцента белкового корма является более эффективным, так как бактерии образуют до 75% белка по массе, в то время как дрожжи - не более 60%.

Известны различные штаммы бактерий, являющиеся продуцентами белка.

Использование штамма Lactobacillus acidophilus 1660/08 для приготовления белкового корма не требует расхода воздуха и энергозатрат на его подачу, так как данный штамм молочнокислых бактерий является анаэробом.

Штамм Lactobacillus acidophilus ВГНКИ - 03.04.10 - ДЕП - продуцент кормового белка (патент РФ №2244000). Используются отходы производства - мукомольные, крахмальные, плодовые выжимки, измельченное зерно.

Известны штамм Lactobacillus plantarum 578/26 - продуцент белкового корма, депонированный в ГНУ ВНИИПБТ Россельхозакадемии (патент РФ 2390554) и штамм Lactobacillus plantarum 578/25 - продуцент кормового белка (патент РФ №2244001).

Общим недостатком данных штаммов является недостаточно высокая концентрация биомассы, накапливаемая в присутствии 2,5% молочной кислоты, а следовательно, недостаточное количество белка, которое могло бы образоваться культурой.

Известны штаммы продуцент кормового белка: Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii ВГНКИ-03.04.12. - ДЕП - (патент РФ №2247149), штамм Propionibacterium acnes ВГНКИ-03.04.11. - ДЕП - продуцент кормового белка (патент РФ №2250258).

Известен штамм ацидофильных метилотрофных бактерий Acetobacter methylicum ВСБ-867 (коллекция Центрального музея промышленных микроорганизмов Института "ВНИИгенетика" N ЦМПМ В-1947) - продуцент белково-витаминной биомассы (авт. св. СССР №925112).

Известен штамм продуцент белка Flammulina velutipes НБК F-112, который выращивают как в глубинной, так и в поверхностной культуре. Получаемая биомасса может быть использована как полноценная по белку кормовая добавка (авт. свид. СССР №727687). Однако недостатком штамма является использование для его выращивания минеральных сред с высоким содержанием глюкозы, а также отходов пищевой промышленности, которые сами по себе являются кормовыми добавками.

Штамм Pleurotus ostreatus Kummer ИМВ F-1330, способный расти как в глубинной, так и в поверхностной культуре, содержит значительное количество белка (авт. св. СССР №427993). Недостатком является необходимость использования сложных многокомпонентных питательных сред и недостаточно высокая продуктивность штамма.

Общим недостатком перечисленных выше бактерий является не стабильный выход биомассы, недостаточно высокая продуктивность штамма.

Одним из перспективных путей получения полноценного белкового кормового продукта являются метанотрофные бактерии, продуцирующие белок. Метанотрофные бактерии в подходящих условиях активно перерабатывают природный газ, быстро размножаются и наращивают свою биомассу, богатую ценным белком, витаминами и иными биологически активными веществами.

Использование метана для получения белка одноклеточных имеет ряд преимуществ по сравнению с жидкими углеводородами: большие запасы природного газа, хорошая его транспортабельность, возможность получения готового продукта без дополнительной очистки от субстрата.

Учитывая, что в России большие газовые запасы недр, по некоторым данным, они составляют до 40% мировых. Внедрение микробиологического производства белка одноклеточных на российских предприятиях сулит не только экономический эффект, но и способно обеспечить продовольственную безопасность страны.

Известны различные штаммы бактерий, продуцирующие кормовой белок, относящиеся к различным видам метанокисляющих бактерий (метанотрофы), например, например штаммы рода Pseudomonas methanica, Methylococcus capsulatus BKM B-2116, Methylocystis parvus BKM B-2129, Methylosinus sporium BKM B-2123, Methylosinus trichospohum BKM B-2117, Methylobacter acidophilus, Methylomonas rubra ВСБ-90, Methylococcus sp. ЧМ-9, Methylococcus capsulatus ВСБ-874, Methylococcus minimus, Methylomonas methanica, Methylomonas agile.

Они являются продуктами микробиального синтеза, получаемыми в результате культивирования метанокислящих бактерий на природном газе. Эти штаммы характеризуются различными скоростями роста и выходом биомассы.

К недостаткам указанных штаммов относится низкая скорость роста и нестабильное содержание белка, которое в большинстве случаев ниже 70%, а также потребность в повышенных количествах биостимулятора, в частности автолизата, которая проявляется при выращивании штамма в асептических лабораторных условиях.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является штамм Methylococcus capsulatus ВСБ-874 - продуцент биомассы. Хранится в музее культур института «ВНИИгенетика» под коллекционным номером ЦМПМ В-1743 (авт. свид. СССР №770200). Используется в качестве источника углерода метан, как чистый, так и в составе природного газа, и метанол. Недостатками прототипа являются недостаточно высокая продуктивность (8-10 г/л ч), невысокое содержание сырого протеина в биомассе (77%), нестабильный выход биомассы (30-60 г/л).

Задача предлагаемого изобретения - создание нового метанокисляющего штамма микроорганизмов, обладающего более высоким технологическим потенциалом, в частности:

- повышенной устойчивостью к гомологам метана природного газа, что позволяет использовать природный газ различного состава и расширить сырьевые ресурсы для промышленного проведения процесса;

- способного к гетеротрофной фиксации углекислого газа, что обеспечивает более низкий коэффициент экономического потребления субстрата за счет автотрофного усвоения углерода из углекислого газа при его высоких концентрациях (выше 30% об.) при высокопродуктивных процессах ферментации;

- фагоустойчивостью;

- устойчивостью к кратковременным перепадам температуры и давления.

Поставленная цель достигается использованием нового штамма метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15, регистрационный номер ВКПМ В-12549 во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов для получения микробной белковой массы.

Штамм Methylococcus capsulatus ГБС-15 селекционирован из накопительной культуры облигантных метанокисляющих микроорганизмов штаммов Methylococcus capsulatus АТСС 33009, Methylococcus capsulatus BKM 2116 и образцов ассоциативной культуры метанокисляющих микроорганизмов из коллекций различных лабораторий (в виде высевов на агар, пасты, суспензии), которая сохранялась и поддерживала для специфических исследований (например, исследований отдельных ферментов) с последующей ступенчатой автоселекцией в непрерывном процессе культивирования при повышающейся скорости протока до 0,35-0,36 ч^-1 на минеральной среде без добавления факторов роста и других органических соединений в атмосфере метан: воздух в соотношении от 1:2,5 до 1:3 при температуре 42-45°С и рН среды 5,6-5,9.

В результате проведенной селекции получен штамм, который при культивировании в промышленных условиях на природном газе может быть использован как в составе ассоциации, так и индивидуально.

Культурально-морфологические особенности штамма

Культура грамотрицательна, аэробна. Клетки штамма имеют форму кокка или диплококка, диаметром 0,9-1,4 мкм, неподвижны, образуют микрокапсулу. Клеточная стенка имеет ровные контуры и плотно прилегает к цитоплазматической мембране. Цитоплазма заполнена плотно упакованными стопками внутриплазматических мембран (ВМЦ типа).

По строению клетки и морфологии относится к I группе Х-типу метанокисляющих микроорганизмов (по классификации Whittenbury. R). Слабо растет на агаризованной минеральной среде, образует колонии размером 1-2 мм в диаметре кремовые, полупрозрачные колонии округлые с ровным краем и гладкой поверхностью, выпуклые. Штамм фагоустойчив. Культура способна к росту в широком диапазоне температур 30-55°С и рН 4,0-8,0, способна образовывать микро- и макро капсулы. Оптимальные значения температуры для роста 40-45°С и значении рН 5,5-5,9. В клетках синтезируется убихинон (преимущественно Q₇ и Q₈). Плазмид не обнаружено. Штамм относится к облигантным метанокисляющим бактериям, способен к автотрофии, азотфиксации. Не растет на органических субстратах. Обладает повышенной чувствительностью к органическим соединениям как эндо-, так и экзопроисхождения, что свидетельствует об усилении признака облигантности штамма по отношению к метану. Штамм не нуждается в витаминах и других стимуляторах роста. Устойчив к примесям гомологов метана и сернистых соединений, содержащихся в природном газе.

Генетические манипуляции со штаммом не производились.

Штамм способен образовывать покоящиеся формы типа незрелых цист Azotobacter, однако не развивается и может сохранять жизнеспособность в течение 2-6 месяцев в отсутствии метана.

Селекционированный штамм характеризуется следующими промышленными ценными признаками:

- штамм является термотолерантным (выдерживает температуру до 55°С, оптимальная температура для роста 40-45°С);

- штамм является ацидотолерантным (для бактериальных культур) - рН 5,3-5,9.

- активность штамма определяется высокой скоростью роста в условиях непрерывного культивирования, устойчивостью к гомологам метана в природном газе, способностью расти при высоких скоростях протока;

- штамм является баротолерантным, способен к росту при повышенных давлениях (до 16 атм), что позволяет повысить продуктивность процесса до 15 кг/м³*час.

Систематическое положение штамма подтверждено при использовании не только морфофизиологических, но и генетических методов с помощью анализа 16S РНК.

Обнаружена способность клеток метанокисляющих бактерий ассимилировать углекислоту как источник углерода наряду с метаном. Этот процесс называется гетеротрофной фиксацией углекислоты в рабочей смеси газов в пределах 30-55%. Уровень фиксации углерода СО₂ достигает при этом 10-12% от массы углерода клеток бактерий, что приводит к уменьшению удельного расходного коэффициента по метану и снижению тепловыделения клетками бактерий, которые используют избыточную энергию, образующуюся при окислении молекулы метана на процесс активации молекулы углекислоты и ее включение в метаболизм клеток бактерий.

Штамм непатогенен и конкурентно способен по отношению к другим видам метанокисляющих бактерий.

Продукт, образуемый штаммом, - микробная белковая масса.

Область применения штамма - производство белково-витаминных комплексов для балансирования кормов с/х животных.

Способ определения активности штамма - при культивировании на простой минеральной среде в присутствии метана и воздуха в соотношении 1:3.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма:

Штамм хранится в течение 1,5-3,0 мес. при температуре +2°-+10°С без природного газа на минеральной агаризованной среде.

Допускается хранение в суспензионной культуре с разной плотностью клеток и с высокой плотностью клеток под слоем вазелинового масла в течение 4-8 месяцев.

Способ, условия и состав сред для размножения штамма - на минеральной среде в присутствии газо-воздушной смеси метан: воздуха в соотношении 1:2,5-1:3, рН 5,3-6,2, при термостатировании колб на качалке со скоростью 160-280 об/мин при температуре 40-45°С.

Оптимальные условия и состав среды для культивирования Methylococcus capsulatus ГБС-15 – рН 5,6-5,8, температура 41-44°С.

Состав минеральной среды на 1 л:

Фосфорная кислота Н₃РО₄ (70%) - 0,35 мл

Хлористый калий KCl - 0,125 г

Сульфат магния MgSO₄×7Н₂О - 0,105 г

Сульфат железа FeSO₄×7Н₂О - 10,75 мг

Сульфат меди СuSО₄×5Н₂О - 10 мг

Сульфат марганца MnSO₄×5Н₂О - 9,5 мг

Борная кислота Н₃ВО₃ - 6,25 мг

Сульфат цинка ZnSO₄×7Н₂О -1,5 мг

Сульфат кобальта CoSO₄×7Н₂О - 0,25 мг

Натрий молибденовокислый Na₂MoO₄×2Н₂О - 0,25 мг

Генетические особенности штамма

Штамм не является генетически модифицированным и не содержит генов других организмов; перенесенных генов резистентности; генетических изменений, связанных с использованием генно-технических методик.

1) Мутации, делеции, инверсии - не выявлены

2) Устойчивость к фагам - штамм фагоустойчив

3) Плазмиды - не выявлены

4) Профаги - не выявлены

Сведения о безопасности использования штамма

Штамм не является зоопатогенным, фитопатогенным и не патогенен для человека. Не представляет опасность по каким-либо другим причинам.

ПРИМЕР 1. Осуществляли выращивание культуры Methylococcus capsulatus штамм ГБС-15 в непрерывном режиме в ферментере эжекционного типа объемом 40 л (рабочий объем - 25 л) с непрерывной подачей питательной среды содержащей следующие компоненты (на 1 л среды):

Фосфорная кислота Н₃РО₄ (70%) - 0,35 мл

Хлористый калий KCl - 0,125 г

Сульфат магния MgSO₄×7Н₂О - 0,105 г

Сульфат железа FeSO₄×7Н₂О - 10,75 мг

Сульфат меди CuSO₄×5Н₂О - 10 мг

Сульфат марганца MnSO₄×5Н₂О - 9,5 мг

Борная кислота Н₃ВО₃ - 6,25 мг

Сульфат цинка ZnSO₄×7Н₂О - 1,5 мг

Сульфат кобальта CoSO₄×7Н₂О - 0,25 мг

Натрий молибденовокислый Na₂МоO₄×2Н₂О - 0,25 мг

Процесс выращивания осуществляли при температуре 42°С и рН среды выращивания 5,6-5,8. Значение рН поддерживали 10%-ным раствором аммиачной воды. Регулирование температуры процесса осуществляли подачей охлаждающей воды в теплообменник аппарата.

Расход природного газа и воздуха на 1 л культуральной среды составляли 15 и 45 л/час соответственно.

Культуру выращивали при атмосферном давлении, температуре 42°С и при перепаде температур от 40° до 45°С, величине рН 5,6 и при коэффициенте скорости протока 0,25 ч^-1, концентрация биомассы в ферментере составляла 10-11 г/л.

При использовании такого режима культивирования в течение длительного времени, с использованием природного газа различного состава (с содержанием метана от 85% об. до 99,9% об.) и воды из разных источников, фаголизиса культуры не наблюдалось.

ПРИМЕР 2. Осуществляли непрерывное культивирование культуры Methylococcus capsulatus штамм ГБС-15 в ферментере эжекционного типа объемом 40 л (рабочий объем - 25 л) при использовании питательной среды и режимов культивирования, как в примере 1.

Выращивание осуществляли при использовании природного газа различного состава с разным содержанием гомологов метана.

1. При использовании природного газа с содержанием метана - 96% об., этана - 2% об, пропана - 3% об. и бутана - 0,1% об. и давлении в ферментере 2 атм была получена концентрация биомассы 12 г/л при скорости протока 0,25 ч^-1. Содержание сырого протеина в биомассе - 79%.

2. При использовании природного газа с содержанием метана - 92% об., этана - 3% об., пропана - 1,5% об., бутана - 0,4% об. и давлении в ферментере 2 атм была получена концентрация биомассы 11,9 г/л при скорости протока -0,25 ч^-1. Содержание сырого протеина в биомассе - 77,9%.

3. При использовании природного газа с содержанием метана - 89% об., этана -4% об., пропана - 2,0% об., бутан -0,8% об. и давлении в ферментере 2 атм, была получена концентрация биомассы 11,5 г/л при скорости протока 0,25 ч^-1. Содержание сырого протеина в биомассе - 78%.

Полученные данные свидетельствуют об устойчивости штамма Methylococcus capsulatus штамм ГБС-15 к низшим гомологам метана в исследованных концентрациях.

ПРИМЕР 3. Осуществляли выращивание культуры Methylococcus capsulatus штамм ГБС-15 в непрерывном режиме в ферментере эжекционного типа объемом 40 л (рабочий объем - 25 л) с непрерывной подачей питательной среды (как в предыдущем примере).

Процесс выращивания осуществляли при температуре 42°С и рН среды 5,6-5,8, значение рН поддерживали 10%-ным раствором аммиачной воды. В ферментер подавали природный газ (с содержанием метана 90% об.) и технический кислород, с содержанием 95% об. кислорода.

Выращивание осуществляли в двух экспериментах - как при атмосферном давлении, так и при давлении 6 атм.

1. Выращивание при атмосферном давлении

При выращивании микроорганизмов Methylococcus capsulatus штамм ГБС-15 при атмосферном давлении концентрация биомассы составила 8 г/л при скорости протока 0,25 ч^-1. При этом расход газов составлял соответственно: природный газ - 240 л/час, кислород (95%) - 280 л/час. Из процесса с отходящим газом выводится 80 л/час углекислого газа.

2. Выращивание при повышенном давлении (6 атм)

При выращивании микроорганизмов Methylococcus capsulatus штамм ГБС-15 при давлении 6 атм концентрация биомассы составила 32 г/л при скорости протока 0,25 ч^-1. При этом расход газов составлял соответственно: природный газ (90%) - 330 л/час, кислород (95%) - 450 л/час. Из процесса с отходящим газом выводится 120 л/час углекислого газа, что свидетельствует об устойчивости культуры к высоким концентрациям углекислого газа. Меньшее удельное количество углекислого газа, выделяемое в отходящем газовом потоке при культивировании штамма при давлении 6 атм, по сравнению с атмосферном давлением, свидетельствует о способности культуры к гетеротрофной фиксации углекислого газа.