НАТРИЕВАЯ СОЛЬ ДИЭТИЛОВОГО ЭФИРА 4-ОКСО-1,4-ДИГИДРОПИРАЗОЛО[5,1-C]-1,2,4-ТРИАЗИН-3,8-ДИКАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ, МОНОГИДРАТ

1. Область техники, к которой относится изобретение.

Изобретение относится к области биологически активных соединений - натриевой соли диэтилового эфира 4-оксо-1,4-дигидропиразоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-3,8-дикарбоновой кислоты, моногидрату, обладающей антигликирующей активностью, предназначенной для лечения и профилактики последствий сахарного диабета.

Изобретение может быть использовано в лечебных учреждениях и научно-исследовательских лабораториях.

2. Уровень техники

Неферментативное взаимодействие белков с глюкозой (реакция Майяра) приводит к образованию химических соединений - конечных продуктов гликирования (КПГ) (NA Ansari, Z Rasheed, 2010). Именно внутри- и внеклеточное накопление КПГ считают важным фактором патогенеза таких заболеваний, как атеросклероз, сердечная недостаточность, воспаление, ревматоидный артрит [1] и остеоартрит, нейродегенеративные заболевания [2], включая болезни Альцгеймера и Паркинсона.

Особенно интенсивно данный процесс протекает при сахарном диабете и имеет немаловажное значение в развитии его осложнений [3-5] и скорость образования КПГ зависит от уровня и длительности экспозиции глюкозы [6]. Эффекты КПГ могут быть классифицированы как рецептор-независимые и -зависимые, могут действовать внутриклеточно или циркулировать и действуют на рецепторы клеточной поверхности, таких как рецепторы для КПГ (РКПГ). Поскольку гликирование происходит в течение длительного периода времени, КПГ влияют на долгоживущие белки, например, главными мишенями являются структурные компоненты соединительной ткани и, в частности, коллаген типа IV, но и другие долгоживущие белки могут также подвергаться гликированию, в том числе миелин, тубулин, активатор плазминогена 1, фибриноген. Накопление КПГ во внеклеточном матриксе приводит к образованию меж- и внутримолекулярных поперечных сшивок и повышению ригидности кровеносных сосудов. Кроме того, под действием КПГ изменяется состав внеклеточного матрикса, с повышенной экспрессией фибронектина, коллагена типа III, IV, VI и ламинина, возможно, опосредовано через активацию ключевых профибротических цитокинов, таких как трансформирующий фактор роста β и фактор роста соединительной ткани. Рецептор-зависимые эффекты КПГ опосредованы их взаимодействием со специфическими рецепторами, что приводит к активации вторичных передатчиков, таких как протеинкиназа С. Ключевая мишень РКПГ - ядерный фактор NF-кВ, который перемещается в ядро и приводит к повышению транскрипции таких белков, как молекулы межклеточной адгезии-1, Е-селектин, эндотелин-1, сосудистый эндотелиальный фактор роста, провоспалительные цитокины. Все вышеперечисленное лежит в основе патогенеза таких последствий сахарного диабета, как диабетические атеросклероз, нефро-, нейро-, ретино-, кардио-, ангиопатии, которые являются причиной высокого риска инвалидизации и смертности среди пациентов с сахарным диабетом.

На сегодняшний день нет препаратов, специфически угнетающих образование КПГ, применяемых в клинической практике. Интерес к данной проблематике и поиску лекарственных средств, способных тормозить реакцию Майяра, снижать образование конечных продуктов гликирования и предотвращать развитие осложнений сахарного диабета, неуклонно растет. Первым и наиболее изученным веществом, ингибирующим гликирование белков, является аминогуанидин 2 (АГ), выбранным в качестве прототипа. Он предотвращает формирование флюоресцирующих КПГ и глюкозопроизводных поперечносшитых молекул коллагена. Механизм антигликирующего действия аминогуанидина связывают с его способностью захватывать реактивные дикарбонильные интермедиаты. Однако клинические испытания данного препарата были остановлены в связи с его недостаточной эффективностью и наличием побочных эффектов [7, 8].

В ряду азоло-1,2,4-триазинов известны соединения, обладающие противовирусным действием. Противовирусный препарат Триазавирин - 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-он, тригидрат 3 [9] зарегистрирован в реестре лекарственных средств РФ как препарат для лечения гриппозной инфекции (№ гос. регистрации ЛП-002604).

3. Сущность изобретения.

Сущность изобретения составляет натриевая соль диэтилового эфира 4-оксо-1,4-дигидропиразоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-3,8-дикарбоновой кислоты, моногидрат, обладающая антигликирующей активностью, формулы (1).

4. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

4.1. Заявляемое соединение - натриевая соль диэтилового эфира 4-оксо-1,4-дигидропиразоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-3,8-дикарбоновой кислоты, моногидрат 1, получено по следующей схеме: диазотирование этилового эфира 5-аминопиразоло-4-карбоновой кислоты 4 с образованием диазопиразола 4, азосочетание с диэтилмалонатом с последующей циклизацией промежуточно образующегося гидразона в присутствии карбоната натрия.

Пример 1. Синтез натриевой соли диэтилового эфира 4-оксо-1,4-дигидропиразоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-3,8-дикарбоновой кислоты, моногидрата 1:

1.08 (0.007 моль) г этилового эфира 5-аминопиразоло-4-карбоновой кислоты 3 растворяют в 1.4 мл соляной кислоты и 0.7 мл воды. Раствор охлаждают до -10°C и диазотируют раствором 0.5 г NaNO₂ в 0.7 мл воды. Полученный раствор соли диазония приливают к смеси 7 мл 2М раствора Na₂CO₃ и 0.78 мл (0.007 моль) диэтилмалоната, pH должен быть 8-10. Реакционную массу выдерживают 1 час при температуре от -10 до 0°C и 1 час при комнатной температуре. Осадок отфильтровывают, сушат и перекристаллизовывают сначала из 50% уксусной кислоты, затем из 50% этанола. Выход 1.0 г (45%).

Заявляемое соединение - натриевая соль диэтилового эфира 4-оксо-1,4-дигидропиразоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-3,8-дикарбоновой кислоты, моногидрат 1, имеет следующие физико-химические характеристики: Т_пл>250°C. ¹Н ЯМР спектр (DMSO-d₆, м.д., КССВ, Гц): 1.31-1.36 (6Н, м, 2СН₃) 4.23-4.31 (4Н, м, 2СН₂), 8.09 (1Н, с, СН). ¹³C ЯМР спектр (DMSO-d₆, δ, м.д.): 14.28 (CH₃), 14.38 (CH₃), 59.35 (CH₂), 59.80 (CH₂), 99.99 (C=C), 128.86 (C-C=O), 146.13 (C-H), 148.31 (C=O), 150.93 (C-N), 162.19 (O-С=O), 164.93 (O-С=O). Найдено, %: C - 40.97; H - 4.05; N - 17.24; C₁₁H₁₁N₄NaO₅*H₂O; вычислено, %: С - 41.26; H - 4.09; N - 17.50.

Физико-химические характеристики соединения 1 полностью соответствуют приписываемой структуре.

4.2. Пример 2. Определение антигликирующей активности соединения 1 в системе in vitro.

Реакцию гликирования воспроизводили по методу [10]. Конечный объем реакционной смеси составлял 1.5 мл. Реакционная смесь содержала растворы бычьего сывороточного альбумина (1 мг/мл) и глюкозы (500 mM) в фосфатном буфере (pH 7.4). Для предупреждения бактериального роста в буферный раствор вносили азид натрия в конечной концентрации 0.02%. Все вещества растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО). В экспериментальные образцы добавляли 50 мкл раствора изучаемого соединения 1 в различных концентрациях, в контрольные образцы добавляли растворитель в аналогичном объеме. Все экспериментальные образцы инкубировали в течение 24 часов при 60°C. По истечении срока инкубации, проводили определение специфической флуоресценции гликированного бычьего сывороточного альбумина (БСА) на спектрофлуориметре F-7000 (Hitachi, Япония) при длине волны возбуждения 370 нм и испускания 440 нм. В качестве вещества сравнения использовали аминогуанидин. Были изучены концентрационные зависимости антигликирующей активности и рассчитаны показатели концентраций IC₅₀, вызывающих снижение флуоресценции гликированного бычьего сывороточного альбумина на 50%.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни, табличного редактора Microsoft Excel 2007 и программы GraphPad Prism 5.0.

В результате было установлено, что соединение 1 проявило высокую антигликирующую активность, превышающую активность вещества сравнения (Таблица 1). В связи с этим на следующем этапе была изучена зависимость антигликирующего эффекта соединения 1 от концентрации (Таблица 2). Полученные результаты позволили рассчитать показатели концентрации веществ, вызывающие снижение флуоресценции гликированного БСА на 50% (IC₅₀). Показатель IC₅₀ для соединения 1 составил 53.96 μМ, а для аминогуанидина - 765.00 μМ.

Пример 3. Определение LD₅₀ при изучении острой токсичности на лабораторных животных.

Изучение острой токсичности заявляемого соединения 1 и вещества сравнения аминогуанидина проводили согласно Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств [11]. Острую суточную токсичность определяли на белых нелинейных мышах-самках массой 21-24 г при внутрибрюшинном введении. Величину токсикологического показателя - LD₅₀ рассчитывали по методу Миллера и Тейтнера [12]. Расчет показателей эффективной концентрации IC₅₀ и LD50 проводили методом регрессионного анализа. В качестве показателя широты терапевтического действия использовали условный терапевтический индекс (УТИ), который рассчитывали как отношение величины LD₅₀ к IC₅₀.

При изучении острой токсичности заявляемого соединения 1 было установлено, что показатель LD₅₀ для данного вещества составил 518.4 мг/кг (Таблица 3). На основании полученных результатов был рассчитан показатель УТИ, по величине которого соединение 1 превосходит аминогуанидин в 4.27 раза.

Таким образом, заявляемое соединение - натриевая соль диэтилового эфира 4-оксо-1,4-дигидропиразоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-3,8-дикарбоновой кислоты, моногидрат - превосходит по антигликирующей активности и условному терапевтическому индексу вещество сравнения (прототип).

Список литературы

[1] Syngle, A. et al. Advanced glycation end-products inhibition improves endothelial dysfunction in rheumatoid arthritis / A. Syngle, K. Vohhra, N. Garg, L. Kaur, P. Chand // International Journal of Rheumatic Diseases. - 2012. - Vol. 15. - P. 45-55.

[2] Li, J., et al. Advanced glycation end products and neurodegenerative diseases: Mechanisms and perspective / J. Li, D. Liu, L. Sun, Y. Lu, Z. Zhang // Journal of the Neurological Sciences. - 2012. - Vol. 317. - P. 1-5.

[3] Ansari, NA. Non-enzymatic glycation of proteins: from diabetes to cancer. / Ansari NA, Rasheed Z. // Biomed Khim. - 2010. - Vol. 56 (2). - P. 168-178.

[4] Goh, S. - Y., Cooper, M.E. The Role of Advanced Glycation End Products in Progression and Complications of Diabetes / S. - Y. Goh, M.E. Cooper // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 2008. - Vol. 93(4). - P. 1143-1152.

[5] Ramasamy, R. et al. Receptor for AGE (RAGE): signaling mechanisms in the pathogenesis of diabetes and its complications. R. Ramasamy, S.F. Yan, A.M. Schmidt. Ann N Y Acad Sci. - 2011.- Vol. 1243. - P. 88-102.

[6] Балаболкин, М.И. Роль гликирования белков, окислительного стресса в патогенезе сосудистых осложнений при сахарном диабете / М.И. Балаболкин // Сахарный диабет. - 2002. - №4. - С. 8-16.

[7] Freedman, B.I. et al. Design and baseline characteristics for the aminoguanidine clinical trial in overt type 2 diabetic nephropathy (ACTION II) / B.I. Freedman, J. - P. Wuerth, K. Cartwright, R.P. Bain, S. Dippe, K. Hershon, A.D. Mooradian, B.S. Spinowitz // Control. Clin. Trials - 1999. - Vol. 20(5). - P. 493-510.

[8] Bolton, W.K. et al. Randomized trial of an inhibitor of formation of advanced glycation end products in diabetic nephropathy / W.K. Bolton, D.C. Cattran, M.E. Williams, S.G. Adler, G.B. Appel, K. Cartwright, P.G. Foiles, B.I. Freedman, P. Raskin, R.E. Ratner, B.S. Spinowitz, F.C. Whittier, J. - P. Wuerth // Am J Nephrol - 2004. - Vol. 24. - P. 32-40.

[9] О.Н. Чупахин, В.Л. Русинов, В.Н. Чарушин, Е.Н. Уломский, А.Ю. Петров, О.И. Киселев, Патент РФ 2294936 от 10.03.2007.

[10] Jedsadayanmata, A. In Vitro Antiglycation Activity of Arbutin / A. Jedsadayanmata // Naresuan University Journal - 2005. - Vol. 13 (2). - P. 35-41.

[11] Миронов, A.H. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая, Гриф и К, Москва, 2012, 944 с.

[12] Беленький, М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта, Медгиз, Ленинград, 1963, 146 с.