Результат интеллектуальной деятельности: Штамм микромицета Penicillium vulpinum F-1523, обладающий антибактериальной активностью в отношении возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и биотехнологии.

Борьба с возбудителем сибирской язвы в природных очагах ее распространения является важнейшей задачей по профилактике заражения бактериальной инфекцией человека и животных. Одной из задач по обеспечению проведения противоэпидемических мероприятий в отношении возбудителя сибирской язвы является внедрение в практику новых дезинфектологических препаратов и технологий их применения [О мерах совершенствования мероприятий по профилактике сибирской язвы в Российской Федерации. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации Г.Г. Онищенко №41 от 27 июня 2008 г.].

Известно, что до настоящего времени основными средствами деконтаминации зараженной сибиреязвенным микробом почвы продолжают оставаться химические дезинфицирующие средства [Соколова Η.Ф. Современные средства и методы для дезинфекции при сибирской язве // Материалы VIII Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов: Сб. статей. - М.: Росинэкс. - 2002. - С. 56-57].

Известно также, что химические средства имеют ряд недостатков экологического и санитарно-гигиенического характера [Федорова Л.С. Дезинфицирующие свойства хлорактивных соединений и средств на их основе (обзор литературы) / Л.С. Федорова, И.М. Цвирова, А.С. Белова, Н.С. Левчук // Ж. Дезинфекционное дело. - 2011. - №4. - С. 11-19].

Известно что, в перечне дезинфицирующих средств, используемых для обеззараживания почвы, полностью отсутствуют биологические препараты [Дезинфицирующие средства: Справочник. М: Торговая компания «БИНГО ГРАНД». - 2007. - 336 с].

Вместе с тем известно, что почва богата микробными антагонистами, выполняющими заметную роль в элиминации бактериальных патогенов [Черкасский Б.Л. Принципы и перспективы санации почвенных очагов сибирской язвы // Материалы Международ. симпоз. по дезинфекции и стерилизации. - М.: Медицина, 1972. - С. 54-56].

Известно, что в отношении бактерии Bacillus anthracis наибольшим потенциалом антагонистического воздействия обладают культуры Streptomyces roseus, Bacillus subtilis, Escherichia coli [Семенова C.A., Галиуллин А.К. Микробные антагонисты для биологической санации скотомогильников // Ученые записки КГАВМ. - Казань. - 2010. - Т. 204. - С. 246-251].

Известно также, что среди микробов, подавляющих развитие возбудителя сибирской язвы, наиболее изучены актиномицеты [Калюжная Л.Д. Изучение антагонистического действия актиномицетов на бациллы сибирской язвы / Л.Д. Калюжная, А.М. Брянская, А.С. Коротич, В.П. Касавченко // Ж. Антибиотики. - 1975. - №7. - С. 617-623]. Микромицеты как антагонисты возбудителя сибирской язвы еще не известны.

Задачей изобретения является получение нового штамма микромицета Penicillium vulpinum (Cooke et Massee) Seifert et Samson с выраженными антибактериальными свойствами в отношении возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis.

Штамм гриба Penicillium vulpinum АА-74 выделен из почвы, собранной в Тверской области в мае 2011 года. Штамм депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ-Оболенск). Справка о депонировании №468 от 16.10.2012. Штамму присвоен регистрационный номер F-1523. Штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические особенности штамма:

Колонии растут умеренно, через 7 дней при 25°С на среде Чапека достигают размера 12-20 мм, на ММС - 25-30 мм. Краевая зона колонии низкая, светлоокрашенная, в центральной части хорошо развиты коремии 2-3 мм высотой. Ножки коремий плотные, гладкостенные, от белого до телесного или розового цвета, простые или разветвленные; верхушки с булавовидной, лопаточко-видной или состоящей из обособленных асимметрических кисточек конидиеносной структурой. Кисточки иногда скучены в колонки серовато-зеленого цвета с желтоватым оттенком. Обратная сторона колонии от кремовой до красновато-коричневой, при старении темнеет. Пигмент в среду не диффундирует. Капли экссудата прозрачные. Вегетативный мицелий белый или светло-сероватый; гифы обычно несут разбросанные кисточки конидий. Конидиеносцы плохо выражены, гладкие, 3,5-4 мкм в диаметре. Рами цилиндрические, 10-25×3-4 мкм. Метулы цилиндрические 9-12×2-3 мкм. Фиалиды цилиндрические, 8-11×2,2-3 мкм. Конидии эллиптические, гладкостенные, 4-4,5×3-3,5 мкм, в массе зеленовато-серые, в цепочках, сжатых в короткую колонку, обычно сохраняются в цепочках в жидкой среде.

Физиолого-биохимические особенности штамма:

Аэроб. Температурный оптимум роста 25-30°С. Оптимальный рН в пределах от 5,0 до 8,0. Оптимальный рост гриба отмечен на средах, где в качестве источника углерода использовали сахарозу, крахмал, мелассу, в качестве источников азота - хлористый аммоний, азотнокислый висмут, азотнокислый аммоний, кукурузный экстракт, дрожжевой экстракт, глютен. Тиомочевина и мочевина как источник азота грибом не используется

Антагонистические свойства

Штамм гриба Penicillium vulpinum F-1523 обладает антагонистической активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Способ, условия и состав сред для культивирования.

Плотные питательные среды: ММС, агар Чапека, агар Сабуро, сусло-агар.

Оптимальная температура для роста 22-25°С, длительность культивирования до массовой споруляции - 5-7 суток, в зависимости от состава среды и температуры культивирования.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения:

1. В обезвоженном состоянии на ионообменной смоле, хранение при температуре (4-8)°С, перезакладка через 5 лет.

2. Под минеральным маслом на агаре Чапека, хранение при температуре (4-8)°С, перезакладка через 1 год.

3. В жидком азоте, срок хранения не ограничен.

4. В лиофилизированном виде, хранение при температуре (4-8)°С, не менее пяти лет.

Характеристика представленных образцов (упаковка, состав защитной среды, концентрация микробных клеток, условия хранения, периодичность перезакладки и т.п.):

Стеклянные флаконы вместимостью 3,5 см³, содержащие обезвоженную контактно-сорбционным методом суспензию заспорованной культуры микромицета. Исходный объем суспензии - 0,1 см³, исходная концентрация клеток ~ 6,5×10⁸ КОЕ/см³. Хранить при температуре (4-8)°С, перезакладка через 5 лет. Для регидратации культуры использовать охлажденный стерильный физиологический раствор в объеме 5 см³.

Пример 1. Выращивание штамма Penicillium vulpinum F-1523 на твердой питательной среде и оценка его антимикробного спектра действия

Для определения антимикробного спектра действия грибной культуры Penicillium vulpinum F-1523 использовали метод блоков, основанный на способности веществ диффундировать в толщу агара и задерживать рост тест-объектов, находящихся в зоне диффузии. Гриб Penicillium vulpinum F1F-1523 выращивают на плотной питательной микологической модифицированной среде следующего состава (г/л): пептон - 5,0; дрожжевой экстракт - 5,0; агар - 15,0; глюкоза - 10,0; мальтоза - 10, NaNO₃ - 2,0; KCl - 0,5; FeSO₄×7H₂O - 0,01; MgSO₄×7Η₂O - 0,5; Κ₂ΗΡΟ₄ - 1,0; гентамицин - 0,04 мкг/мл.

Штамм выращивают в течение 5-13 дней в термостате при температуре (24±0,5)°С. Затем из агара с исследуемой культурой P. vulpinum F-1523 пробочным сверлом вырезают блоки диаметром 5 мм и помещают на засеянные и подсушенные газоны тест-культур.

Для приготовления газонов тест-объектов используют суточные культуры, полученные из музея ГНЦПМБ, которые выращивают на чашках Петри со средой ГРМ (гидролизат рыбной муки). Опытным путем подбирают концентрацию микроорганизмов для получения на чашках Петри сплошного, но не густого газона. Стандартизацию проводят по шкале McFarlanda, используют стандарты мутности. Суспензии суточных тест-культур плотностью 10⁶ кл/мл высевали на чашки Петри диаметром 90 мм по 0,2 мл, растирали шпателем для получения однородного газона и оставляли на 30 мин для полного впитывания в агар. Параллельно используют метод глубинного посева. В чашки Петри предварительно разливают по 10 мл питательной среды ГРМ и оставляют на сутки в термостате (для проверки на контаминацию). На следующие сутки в расплавленный агар - 100 мл добавляют 2 мл суспензии суточной тест-культуры плотностью 10 кл/мл, тщательно перемешивают и разливали по 10 мл в чашки Петри. Диски с культурой гриба помещают на поверхность второго слоя агара после застывания.

Каждый опыт проводили в трех повторностях. Активность штамма определяли по среднему значению диаметра зоны подавления роста тест-культур. Диаметры зон подавления роста тест-организмов вокруг блочков измеряли линейкой. При этом была принята следующая шкала активности: высокая активность - диаметр зоны подавления 21-30 мм и более; умеренная активность - диаметр зоны 10-20 мм; низкая активность - диаметр зоны 6-9 мм.

Из приведенных данных следует, что штамм гриба Penicillium vulpinum F-1523 оказывает антимикробное воздействие на патогенные микроорганизмы различных таксономических групп. Исходя из шкалы активности, наибольшая антибактериальная активность штамма гриба отмечена в отношении бактерий Francisella tularensis и Bacillus cereus

Пример 2. Выращивание штамма Penicillium vulpinum F-1523 на жидкой питательной среде, получение грибной субстанции и ее испытание на активность в отношении возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis

Культуру гриба P. vulpinum F-1523 предварительно оживляют путем засева пробирок с плотной питательной средой (агар Чапека, агар Сабуро, сусло-агар). Засеянные косяки выращивают в термостате при температуре +22-25°С в течение 5÷7 суток до массовой споруляции в зависимости от состава среды и температуры культивирования.

Для культивирования штамма в колбах используют питательную среду следующего состава (г/л):

Для засева питательной среды готовят 3-суточный инокулят. Для получения инокулята в среду помещали агаровый блок с газоном гриба, выращенного на среде Чапека+.

Для засева питательной среды используют инокулюм в количестве 5 мл. Культивирование осуществляют в качалочных колбах V=750 мл, содержащих 100 мл среды при температуре 25°С на подвесной качалке со скоростью вращения 220 об/мин в течение 72 часов.

Культуральную жидкость каждой пробы центрифугировали при скорости вращения ротора 6000 об/мин в течение 20 мин. В результате центрифугирования получали фугат культуральной жидкости (ФКЖ), который использовали для определения бактерицидной активности в отношении возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis (вакцинный штамм СТИ-1). Грибная субстанция в форме ФКЖ может служить источником получения грибных метаболитов посредством ее экстрагирования и фракционирования.

Для определения активности ФКЖ использовали метод лунок, в которые закапывали по 0,01 мл (10 мкл) и 0,1 мл (100 мкл) ФКЖ. Повторность опытов 4-кратная. При этом применяли ту же шкалу активности, что и при определении спектра антимикробного действия штамма P. vulpinum F-1523. Полученные результаты представлены в таблице 2. Вакцинный штамм В. anthracis СТИ-1 выращивали на твердой агаризованной среде по специальной методике [Маринин Л.И., Дятлов И.А., Мокриевич А.Н. и др. Методы изучения биологических свойств возбудителя сибирской язвы // Учебно-методическое пособие. Оболенск, 2009. - 304 стр.].

Установлено, что высокая активность ФКЖ штамма P. vulpinum F-1523 наиболее показательно проявляется при дозе 100 мкл. Причем высокая активность ФКЖ штамма отмечается уже по прошествии суток (35 мм) и достигает максимума на вторые сутки (45 мм). Высокая активность ФКЖ штамма P. vulpinum F-1523 при дозе 10 мкл наблюдается только по прошествии 2-х суток культивирования (25±3 мм).

Таким образом, штамм микромицета Penicillium vulpinum F-1523 обладает антибактериальной активностью в отношении возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis и может быть рекомендован в качестве продуцента биологического препарата.

Пример 3. Получение экспериментальных образцов препарата на основе штамма гриба Penicillium vulpinum F-1523 и их испытание на активность в отношении возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis

Для получения экспериментальных образцов грибного препарата культуру Penicillium vulpinum F-1523 выращивали на плотной питательной среде Чапека+. Культуру гриба выращивали в чашках Петри при температуре 27°С и относительной влажности 85-90% в течение 7-10 дней до образования сплошного воздушного мицелия со зрелыми конидиями.

Наработку культуральной жидкости (КЖ) штамма гриба Penicillium vulpinum F-1523 проводили в качалочных колбах на среде следующего состава (г/л):

Для засева питательной среды использовали 3-суточный инокулят. Инокулят готовили на жидкой питательной среде, куда помещали агаровый блок с газоном гриба. Культивирование проводили при 27°С, рН среды - 6.0-6.5 на микробиологической качалке - 180 об/мин в течение 72 часов. На основе проведенных опытов по оценке влияния различных консервантов, стабилизаторов и эмульгаторов на жизнеспособность культуры P. vulpinum F-1523 составлена рецептура товарной формы грибного препарата. Состав препарата: уксусная кислоты в качестве консерванта; олеиновая кислота в качестве стабилизатора; твин 80 в качестве эмульгатора. Для этой цели из экспериментальных образцов (КЖ, фугат КЖ, паста), полученных путем культивирования штамма Р. vulpinum F-1523, приготовили рецептурные формы препаратов следующего состава (по объему):

- образец КЖ, пасты, фугата КЖ - 97,4%

- олеиновая кислота (стабилизатор) - 2,5%

- твин 80 (эмульгатор) - 0,1%

- уксусная кислота 20% (консервант) - доведение рН до 3-4 ед. рН

Активность экспериментальных образцов определяли путем закапывания в лунки культурой В. anthracis СТИ-1 по 100 мкл исследуемого образца в 4-кратной повторности.

Результаты представлены в таблице 3.

Анализ данных таблицы 3 показывает, что все экспериментальные образцы препарата, созданные на основе штамма P. vulpinum F-1523, показали высокую активность в отношении В. anthracis СТИ-1, сопоставимую с активностью экспериментальных образцов без ингредиентов. Полученные данные могут быть использованы для разработки товарных форм биопрепаратов с антибактериальными свойствами в отношении возбудителя сибирской язвы.