Результат интеллектуальной деятельности: Способ диагностики сахарного диабета по уровню метилглиоксаль-модифицированных липопротеидов низкой плотности с использованием моноклональных антител

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторным методам исследования.

В настоящее время в клинике широко используются способы диагностики и мониторинга сахарного диабета путем оценки содержания гликозилированного гемоглобина в образце, в частности один из запатентованных способов включает стадии: (а) гемолиза образца с целью высвобождения клеточного гемоглобина; (b) контактирования гемоглобина, выделенного из указанного образца согласно стадии (с), описанной ниже, с помощью сигналобразующих молекул, включающих конъюгат из одного или более дигидроксиборильных остатков или их солей, связанных с сигналобразующей меткой; (с) выделения гликозилированного и негликозилированного гемоглобина и любых связанных с ним молекул из образца и их определение электрофоретическим методом.

(Патент РФ №2111494, МПК G01N 33/66, опубл. 20.05.1998)

Недостатком данного способа является сложность проведения исследования и использование дорогостоящего оборудования, кроме того, образцы крови для исследования данным способом не могут храниться длительное время в замороженном виде.

Задачей изобретения является создание альтернативного и эффективного способа диагностики сахарного диабета, повышающего качество и достоверность иммунохимических анализов, точность определения, а также позволяющего осуществлять объективный контроль за эффективностью проводимой лекарственной терапии этого заболевания.

Технический результат изобретения заключается в повышении эффективности и точности диагностики сахарного диабета и осуществлении контроля за эффективностью проводимой терапии данного заболевания.

Это достигается тем, что в заявляемом способе диагностики сахарного диабета, включающем биохимическое исследование крови, согласно изобретению у пациентов в плазме (сыворотке) крови определяют уровень метилглиоксаль-модифицированных липопротеидов низкой плотности путем иммунометрического сэндвич-метода иммуноферментного анализа, затем уровень метилглиоксаль-модифицированных липопротеидов низкой плотности в определяемом образце рассчитывают в условных единицах относительно контрольного образца (cut-off): OD₄₅₀ образца/OD₄₅₀ cut-off и при значении ≥1 судят о наличии сахарного диабета.

Липопротеиды низкой плотности (ЛНП) представляют собой липид-транспортирующие наночастицы плазмы крови. Окислительные превращения глюкозы при диабетической гипергликемии сопровождается накоплением α-оксоальдегида метилглиоксаля. Дикарбонилы, подобные метилглиоксалю, способны вызывать химическую модификацию апопротеина В-100 частиц ЛНП, которая опознается скэвинджер-рецепторами клеток стенки сосуда, что сопровождается усиленным поглощением частиц ЛНП и развитием повреждений сосудистой стенки при сахарном диабете.

Осуществление способа:

У пациента берут кровь для проведения анализа. Для определения содержания метилглиоксаль-модифицированных ЛНП в плазме (сыворотке) крови используют иммунометрический сэндвич-метод иммуноферментного анализа. Лунки планшета для иммуноферментного анализа покрывают моноклональными антителами к апо-В100. При внесении в лунки образцов плазмы (сыворотки) крови или соответствующих контролей происходит связывание иммобилизованных антител с содержащимися в образцах частицами ЛНП, в том числе с метилглиоксаль-модифицированными ЛНП. Не связавшийся материал удаляют из лунок путем отмывки. На следующем этапе реакции моноклональные антитела 6D8 к метилглиоксаль-модифицированным ЛНП, меченые биотином (реагент для анализа), соединяют только с иммобилизованными метилглиоксаль-модифицированными ЛНП. После удаления не связавшегося материала из лунок путем отмывки образовавшийся комплекс выявляют с помощью конъюгата стрептавидина с пероксидазой. Ферментативная активность пероксидазы, определяемая в колориметрической реакции по изменению окраски субстратной смеси с хромогеном тетраметилбензидин, прямо пропорциональна количеству определяемых в образце метилглиоксаль-модифицированных ЛНП. Оптическую плотность OD₄₅₀ субстратной смеси после остановки реакции регистрируют на планшетном спектрофотометре при 450 нм.

Уровень метилглиоксаль-модифицированных ЛНП в определяемом образце рассчитывают в условных единицах относительно контрольного образца (cut-off): OD₄₅₀ образца/OD₄₅₀ cut-off. При отношении ≥1 судят о наличии сахарного диабета.

Уровень нормальных значений содержания метилглиоксаль-модифицированных ЛНП (OD₄₅₀ cut-off) определяли следующим образом.

В образцах плазмы клинически здоровых доноров вышеописанным способом определяли уровень OD₄₅₀. Всего было проанализировано 370 образцов. После этого рассчитывали среднее значение OD₄₅₀ (М) и стандартное отклонение (SD) для определяемой выборки. Значение D₄₅₀ cutoff рассчитывали по формуле: OD₄₅₀ cut-off=M2+SD.

Клинический пример 1.

Пробанд З., 58 лет, участвовала в эпидемиологическом обследовании в ЗАО г. Москвы, проводившемся в ФГБУ «РКНПК» Минздрава РФ. В процессе обследования на основании биохимических и клинических данных были исключены заболевания печени, почек, онкология и значимые заболевания сердечно-сосудистой системы (гипертония, сердечная недостаточность, перенесенный инфаркт миокарда). Гиперлипидемия не выявлена (уровень общего холестерина 4,39 ммоль/л). Провели исследование по заявляемому способу. Содержание метилглиоксаль-модифицированных ЛНП в плазме крови составило 0,56 (в пределах нормальных значений). Для подтверждения данных исследования был определен уровень гликированного гемоглобина, который составил 5,2%. На основании клинических, анамнестических и лабораторных методов исследования диагноз сахарного диабета был исключен.

Клинический пример 2.

Пробанд И., 46 лет, участвовал в эпидемиологическом обследовании в ЗАО г. Москвы, проводимом в ФГБУ «РКНПК» Минздрава РФ. В процессе обследования на основании биохимических и клинических данных были исключены заболевания печени, почек, онкология и значимые заболевания сердечно-сосудистой системы (гипертония, сердечная недостаточность, перенесенный инфаркт миокарда). Содержание метилглиоксаль-модифицированных ЛНП в плазме крови, определенное предлагаемым способом, составило 3,82 (превышение нормальных значений почти в 4 раза), что указывает на наличие сахарного диабета. Для подтверждения этих данных определили уровень гликированного гемоглобина, который составил 8,87%. На основании клинических, анамнестических и лабораторных методов исследования был поставлен диагноз: впервые выявленный сахарный диабет 2 типа.

Пример 3 на основе экспериментальных исследований.

Пример поясняется графическими материалами, где показана специфичность антител к нативным ЛНП, МДА- и метилглиоксаль-модифицированным ЛНП:

Фиг. 1 - специфичность антител по заявляемому способу.

Фиг. 2 - специфичность антител известного тест-набора.

Для получения моноклональных антител к метилглиоксаль-модифицированным ЛНП мышей линии BALB/c иммунизировали внутрибрюшинно 4 раза с интервалом в 2 недели, используя в качестве антигена метилглиоксаль-модифицированные ЛНП плазмы крови здоровых доноров (по 100 мкг антигена/ мышь при каждом введении). Для первой инъекции использовали полный адъювант Фрейнда, с которым смешивали раствор антигена до получения устойчивой эмульсии, для второй - неполный адъювант Фрейнда (оба адъюванта - производства фирмы Calbiochem, США). Третья и четвертая иммунизации проводились в фосфатно-солевом буфере без адъюванта. Через неделю после последней иммунизации у мышей брали кровь из хвостовой вены и в сыворотках проверяли иммунный ответ. Для гибридизации была отобрана мышь с наилучшим иммунным ответом. За 3 дня до гибридизации проводили бустирование отобранной мыши путем введения раствора антигена в ФСБ в хвостовую вену (10 мкг). Слияние проводили с использованием миеломной линии X.63.Ag8.653 (субклон Р301) и клеток селезенки, выделенных из иммунизированной мыши. Отбор клеток - продуцентов моноклональных антител нужной специфичности вели с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. Тестирование культуральных сред от выросших популяций проводилось одновременно на 3-х антигенах: ЛНП, МДА-модифицированные ЛНП и метилглиоксаль-модифицированные ЛНП для проверки специфичности связывания получаемых моноклональных антител исключительно с метилглиоксаль-модифицированными ЛНП. Из 700 выросших гибридных популяций при тестировании с метилглиоксаль-модифицированными ЛНП было выявлено 3 популяции с положительным ответом+, но после клонирования и реклонирования одна популяция перестала секретировать антитела. Два оставшихся клона 6D8 и 1D3 были выращены в культуре в количествах, достаточных для получения асцитной жидкости, после чего они были введены мышам линии BALB/c. Получение асцитной жидкости, содержащей моноклональные антитела, проводили с соответствии со стандартной производственной процедурой ООО фирмы «Мона». Моноклональные антитела были выделены из асцитной жидкости с помощью осаждения сульфатом аммония и ионообменной хроматографии на колонке с носителем DEAE-Toyopearl 650М производства фирмы TosoHaas, Япония.

Анализ качества полученных 2 препаратов моноклональных антител был проведен в сертифицированной лаборатории контроля качества ЗАО «Фрамон» - компании, производящей препарат Монафрам, разработанный на основе соответствующих моноклональных антител в ООО фирмы «Мона». Во всех препаратах содержание мышиных моноклональных антител было не менее 95%.

Исследование специфичности связывания полученных моноклональных антител к метилглиоксаль-модифицированным ЛНП проводили с использованием нативных ЛНП, МДА-модифицированных ЛНП и метилглиоксаль-модифицированных ЛНП. Было показано, что полученные моноклональные антитела активно связываются с метилглиоксаль-модифицированными ЛНП, тогда как их связывания с нативными ЛНП и МДА-модифицированными ЛНП не наблюдалось (Фиг. 1). При проведении аналогичного испытания тест-наборов для определения уровня окисленных ЛНП производства фирмы Mercodia (Швеция) было установлено, что наибольшее связывание содержащихся в этом тест-наборе антител происходит с МДА-модифицированными ЛНП, однако при сравнительно высоких уровнях антигенов (1,5-6,5 мкг/мл) было выявлено заметное связывание с нативными ЛНП и в меньшей степени с метилглиоксаль-модифицированными ЛНП (Фиг. 2).

Данные проведенного исследования показали, что полученные моноклональные антитела обладают значительно большей специфичностью, чем подобного рода антитела, входящие в состав широко распространенных коммерческих иммунохимических тест-наборов. Тест-наборы, созданные на основе полученных моноклональных антител, позволят снизить себестоимость и повысить качество иммунохимических анализов, способствующих уточнению диагноза и тяжести течения сахарного диабета, а также позволят осуществлять объективный контроль за эффективностью проводимой лекарственной терапии этого заболевания.

Таким образом, определение уровня метилглиоксаль-модифицированных ЛНП в плазме крови может быть альтернативным способом выявления сахарного диабета, при этом заявляемый способ отличается простотой при минимальных затратах времени проведения анализов, возможностью длительной сохранности образцов для исследования, а также возможностью автоматизации процесса.