Результат интеллектуальной деятельности: ПРИМЕНЕНИЕ АДАМАНТАНСОДЕРЖАЩИХ ИНДОЛОВ И ИХ ГИДРОХЛОРИДОВ В КАЧЕСТВЕ ЦИТОПРОТЕКТОРОВ И ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С УВЕЛИЧЕНИЕМ ЦИТОЗОЛЬНОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ КАЛЬЦИЯ, И ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО НА ИХ ОСНОВЕ

Изобретение относится к использованию химических соединений в области медицины в качестве эффективного лекарственного средства при изготовлении фармакологических препаратов для предупреждения и лечения заболеваний, при которых дегенеративные изменения к клетках запускаются увеличением цитозольной концентрации кальция с последующей деполяризацией митохондрий и гибелью клеток. Прежде всего, в эту группу заболеваний можно отнести заболевания возбудимых тканей - нейродегенеративные, нейро-мышечные и неврологические заболевания с неконтролируемой гиперактивностью (судороги, мигрень аноксия, ишемия) с последующей дегенерацией, кардиодегенеративные заболевания, дегенеративные заболевания сетчатки, ишемические повреждения мозга и сердца и т.д.

В настоящее время лечение выше перечисленных заболеваний представляет собой проблему, требующую решений, а в случае

значительного числа вышеперечисленных патологий, в частности заболеваний с нейродегенеративным компонентом, лечение является преимущественно симптоматическим, и до настоящего времени не разработаны эффективные цитопротекторные средства, непосредственно способствующие защите клеток от гибели при увеличении цитозольной концентрации кальция

Для цитопротекции, т.е. предотвращения гибели клеток, связанной с чрезмерным увеличением цитозольной концентрации кальция внутри клеток возможно либо предотвратить это накопление, либо предотвратить дальнейшее развитие токсического эффекта, воздействуя на дальнейшие этапы каскада клеточной гибели, ключевым этапом которого является деполяризация митохондрий. В случае возбудимых клеток и особенно в случае нейронов второй путь, не влияющий на гомеостаз кальция в клетке, является предпочтительным, так как позволяет реализовать цитопротекторный эффект при увеличении цитозольной концентрации кальция, не снижая рецептор-кальций-опосредованную функциональную активность клеток.

Известны соединения различных структур, обладающие свойством цитопротекции в условиях возможного увеличении цитозольной концентрации кальция. (Патент US 5310756 А, МПК Ф61К 31/135, опуб. 05.10.1994 г.)

Однако эти соединения реализуют цитопротекторный эффект именно благодаря способности ингибировать рецепторы, вызывающие вход кальция в клетки или кальциевые каналы, и таким образом предотвращая увеличение цитозольной концентрации кальция и, соответственно, гибель клеток, а поэтому могут нарушать процессы передачи сигналов в возбудимых клетках и, соответственно нарушать функциональную активность нейронов.

Известны соединения, принятые за прототип, содержащие адамантановые фрагменты и обладающие свойством цитопротекции в условиях возможного увеличении цитозольной концентрации кальция. [Yakub Е. Kadernani, Frank Т. Zindo, Erika Kapp, Sarel F. Malana and Jacques Joubert. Adamantane amine derivatives as dual acting NMDA receptor and voltage-gated calcium channel inhibitors for neuroprotection. Med. Chem. Commun., 2014, 5, 1678-1684].

Однако, как и в выше описанном аналоге, эти соединения реализуют цитопротекторный эффект именно благодаря способности ингибировать рецепторы, вызывающие вход кальция в клетки или кальциевые каналы, и таким образом предотвращая увеличение цитозольной концентрации кальция и гибель клеток, а поэтому могут нарушать процессы передачи сигналов в возбудимых клетках и, соответственно нарушать функциональную активность нейронов.

Предлагаемое изобретение решает задачу применения адамантсодержащих индолов в качестве цитопротекторного препарата защищающего от токсических стимулов, связанных с увеличением цитозольной концентрации кальция, но не подавляющего собственно самого увеличения цитозольной концентрации кальция и процессов рецептор-связанного входа кальция в клетки, т.е. не нарушая функциональную активность клеток.

Технический эффект при этом заключается в предотвращении деполяризации митохондрий при увеличении цитозольной концентрации кальция.

Настоящее изобретение относится к применению в качестве цитопротекторов адамантансодержащих индолов и их гидрохлоридов, общей формулы 1,

в которой R₁, R₂, R₃, R₄: могут быть одинаковыми или различными и независимо представляют Н, F, Cl, Br, (C₁-C₆) алкил, (C₁-C₆) алкокси;

R₅, R₆ могут быть одинаковыми или различными и независимо представляют Н, (C₁-C₆) алкил, ONO₂;

X представляет СН₂СН(ОН)СН₂ или СН₂СН₂С(O);

Z = нет, Cl;

или или

R₇, R₈, R₉, R₁₀ могут быть одинаковыми или различными и независимо представляют Н, F, Cl, Br, (C₁-C₆) алкил, (C₁-C₆) алкокси;

R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄, R₁₅, R₁₆, R₁₇, R₁₈ могут быть одинаковыми или различными и независимо представляют Н, (C₁-C₆) алкил.

Среди соединений формулы 1 предпочтительными в качестве цитопротекторов являются следующие 2 группы соединений, которые могут быть представлены формулами 1.1 и 1.2, приведенными ниже.

В частности, первой группой предпочтительных соединений формулы 1 являются адамантансодержащие индолы и их гидрохлориды общей формулы 1.1,

в которой R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, Z, Y, имеют значения, определенные выше для формулы 1.

В рамках адамантансодержащих индолов и их гидрохлоридов группы 1.1 наиболее предпочтительными в качестве цитопротекторов являются адамантансодержащие карбазолы и гидрохлориды общей формулы 1.1.1,

в которой R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R, Z, R₇, R₈, R₉, R₁₀ имеют значения, определенные выше для формулы 1.

В рамках подгруппы 1.1.1 наиболее предпочтительными являются

1-(адамантан-1-иламино)-3-карбазол-9-ил-пропан-2-ол - соединение 1;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(3,6-дибром-карбазол-9-ил)-пропан-2-ол - соединение 2;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(3,6-дихлор-карбазол-9-ил)-пропан-2-ол - соединение 3;

3-(3,5-диметиладамантан-1-иламино)-1-карбазол-9-ил)-пропан-2-ол - соединение 4;

1-(3,6-дибромкарбазол-9-ил)-3-(3,5-диметиладамантан-1-иламино)-пропан-2-ол - соединение 5

3-(3,5-диметиладамантан-1-иламино)-1-(3,6-дихлоркарбазол-9-ил)-пропан-2-ол - соединение 6;

1-(адамантан-1-иламино)-3-карбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 7;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(3,6-дибром-карбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 8;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(3,6-дихлор-карбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 9;

3-(3,5-диметиладамантан-1-иламино)-1-карбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 10;

1-(3,6-дибромкарбазол-9-ил)-3-(3,5-диметиладамантан-1-иламино)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 11;

3-(3,5-диметиладамантан-1-иламино)-1-(3,6-дихлоркарбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 12.

Второй подгруппой наиболее предпочтительных в качестве цитопротекторов адамантансодержащих индолов и их гидрохлоридов группы 1.1 являются адамантансодержащие тетрагидрокарбазолы и их гидрохлориды общей формулы 1.1.2,

в которой R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, Z, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄, имеют значения, определенные выше для формулы 1

Предпочтительными соединениями этой подгруппы являются:

1-(адамантан-1-иламино)-3-(1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол - соединение 13;

1-(3,5-диметил-адамантан-1-иламино)-3-(1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол - соединение 14;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(6-метил-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол - соединение 15;

1-(3,6-диметил-адамантан-1-иламино)-3-(6-метил-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол - соединение 16;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(6-фтор-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол - соединение 17;

1-(3,6-диметил-адамантан-1-иламино)-3-(6-фтор-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол - соединение 18;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(3,6-диметил-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол - соединение 19;

1-(3,6-диметил-адамантан-1-иламино)-3-(3,6-диметил-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол - соединение 20;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 21;

1-(3,5-диметил-адамантан-1-иламино)-3-(1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 22;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(6-метил-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 23;

1-(3,6-диметил-адамантан-1-иламино)-3-(6-метил-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 24;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(6-фтор-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 25;

1-(3,6-диметил-адамантан-1-иламино)-3-(6-фтор-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 26;

1-(адамантан-1-иламино)-3-(3,6-диметил-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 27;

1-(3,6-диметил-адамантан-1-иламино)-3-(3,6-диметил-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 28;

Третьей подгруппой наиболее предпочтительных в качестве цитопротекторов адамантансодержащих индолов и их гидрохлоридов группы 1.1 являются адамантансодержащие гамма-карболины и их гидрохлориды общей формулы 1.1.3,

в которой R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, Z, R₁₅, R₁₆, R₁₇, R₁₈, имеют значения, определенные выше для формулы 1.

Предпочтительными соединениями этой подгруппы являются:

1-(адамантан-1-ил)-3-(2,8-диметил-3,4-дигидро-1Н-пиридо[4,5-b]индол-5-ил)-пропан-2-ол - соединение 29;

1-(адамантан-1-ил)-3-(2,8-диметил-3,4-дигидро-1Н-пиридо[4,5-b]индол-5-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 30.

Второй группой предпочтительных соединений формулы 1 являются адамантансодержащие индолы и их гидрохлориды общей формулы 1.2,

в которой R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, Z, Y, имеют значения, определенные выше для формулы 1.

Среди соединений формулы 1.2 предпочтительными в качестве цитопротекторов являются следующие 3 подгруппы соединений, которые могут быть представлены формулами 1.2.1, 1.2.2 и 1.2.3, приведенными ниже.

Первую подгруппу предпочтительных адамантансодержащих индолов группы 1.2 составляют адамантансодержащие карбазолы общей формулы 1.2.1,

в которой R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, R₁₀, имеют значения, определенные выше для формулы 1.

Предпочтительными соединениями этой подгруппы являются:

N-(адамантан-1-ил)-3-карбазол-9-ил-пропионамид - соединение 31;

N-(3,5-диметил-адамантан-1-ил-3-карбазол-9-ил)-пропионамид - соединение 32.

Вторую подгруппу предпочтительных в качестве цитопротекторов адамантансодержащих индолов группы 1.2 составляют адамантансодержащие карбазолы общей формулы 1.2.2,

в которой R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄, имеют значения, определенные выше для формулы 1.

Предпочтительными соединениями в качестве цитопротектора формулы 1.2.2 применяют

N-адамантан-1-ил-3-(3,4-дигидро-1Н-карбазол-9-ил-пропионамид - соединение 33.

Третью подгруппу предпочтительных в качестве цитопротекторов адамантансодержащих индолов группы 1.2 составляют адамантансодержащие карбазолы общей формулы 1.2.3.

в которой R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, Z, R₁₅, R₁₆, R₁₇, R₁₈ имеют значения, определенные выше для формулы 1.

В качестве цитопротектора формулы 1.2.3 предпочтительно применяют одно из следующих соединений

1-(адамантан-1-ил)-3-(2,8-диметил-3,4-дигидро-1Н-пиридо[4,5-b]индол-5-ил)-пропионамид - соединение 34;

1-(адамантан-1-ил)-3-(2,8-диметил-3,4-дигидро-1Н-пиридо[4,5-b]индол-5-ил)-пропионамид гидрохлорид - соединение 35.

Еще одним аспектом изобретения является применение всех соединений вышеуказанной общей формулы 1 для лечения и предупреждения заболеваний, связанных с увеличением цитозольной концентрации кальция.

Также еще одним аспектом изобретения является фармакологическое средство в качестве цитопротектора при лечении и предупреждении

11

заболеваний, связанных с увеличением цитозольной концентрации кальция, содержащее в качестве активного начала эффективное количество соединения формулы 1 и фармацевтически приемлемый носитель.

На Фиг. 1. Показаны глутамат-вызванные изменения во времени внутриклеточной концентрации кальция в нейронах первичной культуры (а) и потенциала митохондрий (б) в контрольных пробах.

На Фиг. 2. Показано влияние 100 нМ соединения 18 на глутамат-вызванные изменения во времени внутриклеточной концентрации кальция в нейронах первичной культуры (а) и потенциала митохондрий (б).

На Фиг. 3. Показано влияние 100 нМ соединения 26 на глутамат-вызванные изменения во времени внутриклеточной концентрации кальция в нейронах первичной культуры (а) и потенциала митохондрий (б).

На Фиг. 4. Показано влияние 100 нМ соединения 7 на глутамат-вызванные изменения во времени внутриклеточной концентрации кальция в нейронах первичной культуры (а) и потенциала митохондрий (б).

На Фиг. 5. Показано влияние 100 нМ соединения 17 на глутамат-вызванные изменения во времени внутриклеточной концентрации кальция в нейронах первичной культуры (а) и потенциала митохондрий (б).

На Фиг. 6. Показано влияние 100 нМ соединения 20 на глутамат-вызванные изменения во времени внутриклеточной концентрации кальция в нейронах первичной культуры (а) и потенциала митохондрий (б).

На Фиг. 7. Показано влияние 100 нМ соединения 22 на глутамат-вызванные изменения во времени внутриклеточной концентрации кальция в нейронах первичной культуры (а) и потенциала митохондрий (б).

На Фиг. 8. Показано влияние соединений 18 и 26 на выживаемость первичной культуры нейронов коры мозга крыс в условиях иономицин-вызванной перегрузки клеток кальцием.

На Фиг. 9. Показано влияние соединения 22 на выживаемость первичной культуры нейронов коры мозга крыс в условиях иономицин-вызванной перегрузки клеток кальцием.

Приведенные ниже примеры иллюстрируют, но не ограничивают данное изобретение.

Экспериментальная химическая часть.

Производные адамантансодержащих замещенных индолов общей формулы 1, обладающих заявленными свойствами, получали путем конъюгации индольной и аминоадамантановой составляющих, соответствующих заявляемому составу и объединенных через заявляемый молекулярный спейсер X. Синтетические способы для получения соединений формулы 1 представляют две общие группы,

Синтез соединений формулы 1.1 адамантансодержащих индолов (крабазолов, тетрагидрокарбазолов, гамма-карболинов) и их гидрохлоридов осуществляют нагреванием эквимольной смеси соответствующих замещенных индолов и аминоадамантанов в растворителе (этанол, пропанол, изо-пропанол) при температуре 70-90°С в течение 2-6 часов.

Для получения гидрохлоридов адамантансодержащих индолов соответствующие адамантансодержащие индолы растворяют в 10%-ом растворе HCl в изопропаноле.

Получение адамантансодержащих индолов (карбазолов, тетрагидрокарбазолов, гамма-карболинов) формулы 1.2. проводят нагреванием эквимольной смеси карбазолов или тетрагидрокарбазолов и адмантанилакриламидов в диметилсульфоксиде (ДМСО) или диметилформамиде (ДМФА) в присутствии катализатора, выбранного из ряда: метилат натрия (MeONa), третбутилат калия (трет.-BuOK), гидроокись калия (КОН) и фторид цезия (CsF) при температуре 120-160°С в течение 2-12 часов.

Из всей группы соединений 1.2 гидрохлориды можно получать только у подгруппы 1.2.3. Для этого соответствующие адамантансодержащие индолы, растворяют в 10%-ом растворе HCl в изопропаноле.

Структуры полученных соединений подтверждали данными химического, спектрального анализа и других физико-химических характеристик. Спектры ПМР регистрировали на приборе Brucker СХР-200 (200 МГц).

Биологическая активность полученных соединений.

Исследования токсичности заявляемой группы соединений, проведенные согласно руководящему документу ОЭСР Test №420 «Acute Oral Toxicity - Fixed Dose Procedure», показали, что средняя летальная доза LD₅₀ (мыши, орально) превышает 300 мг/кг, что позволяет отнести данные соединения к малотоксичным. При этом они не оказывают заметного нейротоксического действия в интервале активных исследуемых доз, что делает их ценными для применения в медицине, при лечении и профилактике заболеваний.

Возможность осуществления изобретения с реализацией заявляемого назначения подтверждается двумя сериями опытов:

- предотвращением деполяризации митохондрий в условиях перегрузки клеток кальцием, вызываемой глутаматной токсичностью (примеры 1-6);

- увеличением выживаемости нейронов коры мозга крыс при вызванной неспецифическим кальциевым ионофором иономицином перегрузки клеток кальцием (примеры 7-8).

Пример 1. Определение влияния соединения 18 (общей формулы 1.1.) -1-(3,6-диметил-адамантан-1-иламино)-3-(6-фтор-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол на аккумуляцию кальция нейронами и деполяризацию митохондрий в условиях глутаматной токсичности.

Для приготовления культур клеток использовали крысят в возрасте 3 дней. Крысят декапитировали, извлекали мозги, после чего кору головного мозга отмывали в охлажденном на льду коммерческом фосфатном буфере Дульбекко без солей кальция и магния (DPBS, Gibco®) и переносили в раствор 0.05% трипсина, доведенный до 37°С. Инкубировали при 37°С в течение 5-10 минут, после чего суспензию центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 минут (22°С). К полученному осадку добавляли среду, после чего повторяли процедуру центрифугирования. К финальному осадку добавляли среду и помещали по капле получившейся суспензии на покрывные стекла, предварительно покрытые поли-D-лизином (0.05 мг/мл). Инкубировали в течение 2 часов при 37°С, 5% CO₂, после чего добавляли среду роста. Для роста нейронов использовали нейробазальную среду А (Gibco®), содержащую добавку В27, глютамин и антибиотики (пенициллин/стрептомицин). Эксперименты проводили начиная с 12 дня культивирования.

Зрелые культуры инкубировали темноте в течение 20 минут в присутствии низкоаффинного флуоресцентного зонда Fura FF (5 мкМ) и плюроника 127 (0.05%) в растворе Хенкса. Через 15 минут после начала инкубации добавляли родамин 123 (10 мкМ). После инкубации покровные стекла с клетками отмывали и помещали в инвертированный микроскоп, оборудованный CCD-камерой. Эксперимент проводили в растворе Хенкса. Прописывали базовые значения флуоресценции Fura-FF и Rh123, после чего добавляли 100 нМ соединения 18. Через некоторое время к клеткам добавляли 100 мкМ глутамата и прописывали изменение значений флуоресценции обеих меток. В конце добавляли 0.5 мкМ FCCP для полной деполяризации митохондрий.

Как следует из фиг. 1а, добавление глутамата к клеткам вызывает увеличение концентрации внутриклеточного кальция в контрольных клетках без исследуемого вещества, наличие в пробе соединения 1 (фиг. 2а) не влияет

на динамику глутамат-зависимого изменения внутриклеточной концентрации кальция, т.е. в его присутствии динамика изменения внктриклеточной концентрации кальция не отличается от контрольных проб. После добавления глутамата к клеткам, одновременно с повышением внутриклеточного кальция наблюдается увеличение флуоресценции потенциал-зависимого индикатора митохондриального потенциала Родамина 123 (Rh123) (фиг. 1б), что свидетельствует о деполяризации митохондрий. Присутствие в пробе клеток соединения 1 в концентрации 100 нМ (фиг. 2б) полностью предотвращает деполяризацию митохондрий в условиях глутатматной токсичности.

Таким образом, полученные данные позволяют утверждать, что соединение 18 предотвращает деполяризацию митохондрий в условиях увеличения цитозольной концентрации кальция в результате воздействия глутамата.

Пример 2. Определение влияния 1-(3,6-диметил-адамантан-1-иламино)-3-(6-фтор-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорида - соединение 26 на аккумуляцию кальция нейронами и деполяризацию митохондрий в условиях глутаматной токсичности.

Для приготовления культур клеток использовали крысят в возрасте 3 дней. Крысят декапитировали, извлекали мозги, после чего кору головного мозга отмывали в охлажденном на льду коммерческом фосфатном буфере Дульбекко без солей кальция и магния (DPBS, Gibco®) и переносили в раствор 0.05% трипсина, доведенный до 37°С. Инкубировали при 37°С в течение 5-10 минут, после чего суспензию центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 минут (22°С). К полученному осадку добавляли среду, после чего повторяли процедуру центрифугирования. К финальному осадку добавляли среду и помещали по капле получившейся суспензии на покрывные стекла, предварительно покрытые поли-D-лизином (0.05 мг/мл). Инкубировали в течение 2 часов при 37°С, 5% CO₂, после чего добавляли

среду роста. Для роста нейронов использовали нейробазальную среду А (Gibco®), содержащую добавку В27, глютамин и антибиотики (пенициллин/стрептомицин). Эксперименты проводили начиная с 12 дня культивирования.

Зрелые культуры инкубировали темноте в течение 20 минут в присутствии низкоаффинного флуоресцентного зонда Fura FF (5 мкМ) и плюроника 127 (0.05%) в растворе Хенкса. Через 15 минут после начала инкубации добавляли родамин 123 (10 мкМ). После инкубации покровные стекла с клетками отмывали и помещали в инвертированный микроскоп, оборудованный CCD-камерой. Эксперимент проводили в растворе Хенкса. Прописывали базовые значения флуоресценции Fura-FF и Rh123, после чего добавляли 100 нМ соединения 26. Через некоторое время к клеткам добавляли 100 мкМ глутамата и прописывали изменение значений флуоресценции обеих меток. В конце добавляли 0.5 мкМ FCCP для полной деполяризации митохондрий.

Как следует из фиг. 1а, добавление глутамата к клеткам вызывает увеличение концентрации внутриклеточного кальция в контрольных клетках без исследуемого вещества, наличие в пробе соединения 26 (фиг. 3а) не влияет на динамику изменения внутриклеточной концентрации кальция в клетках. После добавления глутамата к клеткам, одновременно с повышением внутриклеточного кальция наблюдается увеличение флуоресценции потенциал-зависимого индикатора митохондриального потенциала Родамина 123 (Rh123) (фиг. 1б), что свидетельствует о деполяризации митохондрий. Присутствие в пробе клеток соединения 26 в концентрации 100 нМ (фиг. 3б) полностью предотвращает деполяризацию митохондрий в условиях глутаматной токсичности.

Таким образом, полученные данные позволяют утверждать, что соединение 26 предотвращает деполяризацию митохондрий в условиях

увеличения цитозольной концентрации кальция в результате воздействия глутамата.

Пример 3. Определение влияния 1-(адамантан-1-иламино)-3-карбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 7 на аккумуляцию кальция нейронами и деполяризацию митохондрий в условиях глутаматной токсичности.

Приготовление, выращивание первичной культуры нейронов коры мозга крыс, инкубация с веществом, индукция глутаматной токсичности и микроскопическая регистрация концентрации внутриклеточного кальция и митохондриального потенциала как в примере 1.

Аналогично примеру 1, из фиг. 4а и 4б видно, что присутствие в среде соединения 7 не влияет на вызванное глутаматом повышение внутриклеточного кальция в нейронах, но полностью предотвращает деполяризацию митохондрий.

Таким образом, полученные данные позволяют утверждать, что соединение 7 предотвращает деполяризацию митохондрий в условиях увеличения цитозольной концентрации кальция в результате воздействия глутамата.

Пример 4. Определение влияния 1-(адамантан-1-иламино)-3-(6-фтор-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол - соединение 17 на аккумуляцию кальция нейронами и деполяризацию митохондрий в условиях глутаматной токсичности.

Приготовление, выращивание первичной культуры нейронов коры мозга крыс, инкубация с веществом, индукция глутаматной токсичности и микроскопическая регистрация концентрации внутриклеточного кальция и митохондриального потенциала как в примере 1.

Аналогично примеру 1, из фиг. 5а и 5б видно, что присутствие в среде соединения 17 не влияет на вызванное глутаматом повышение

внутриклеточного кальция в нейронах, но полностью предотвращает деполяризацию митохондрий.

Таким образом, полученные данные позволяют утверждать, что соединение 17 предотвращает деполяризацию митохондрий в условиях увеличения цитозольной концентрации кальция в результате воздействия глутамата.

Пример 5. Определение влияния 1-(3,6-диметил-адамантан-1-иламино)-3-(3,6-диметил-1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол - соединение 20 на аккумуляцию кальция нейронами и деполяризацию митохондрий в условиях глутаматной токсичности.

Приготовление, выращивание первичной культуры нейронов коры мозга крыс, инкубация с веществом, индукция глутаматной токсичности и микроскопическая регистрация концентрации внутриклеточного кальция и митохондриального потенциала как в примере 1.

Аналогично примеру 1, из фиг. 6а и 6б видно, что присутствие в среде соединения 20 не влияет на вызванное глутаматом повышение внутриклеточного кальция в нейронах, но полностью предотвращает деполяризацию митохондрий.

Таким образом, полученные данные позволяют утверждать, что соединение 20 предотвращает деполяризацию митохондрий в условиях увеличения цитозольной концентрации кальция в результате воздействия глутамата.

Пример 6. Определение влияния 1-(3,5-диметил-адамантан-1-иламино)-3-(1,2,3,4-тетрагидрокарбазол-9-ил)-пропан-2-ол гидрохлорид - соединение 22 на аккумуляцию кальция нейронами и деполяризацию митохондрий в условиях глутаматной токсичности.

Приготовление, выращивание первичной культуры нейронов коры мозга крыс, инкубация с веществом, индукция глутаматной токсичности и

микроскопическая регистрация концентрации внутриклеточного кальция и митохондриального потенциала как в примере 1.

Аналогично примеру 1, из фиг. 7а и 7б видно, что присутствие в среде соединения 22 не влияет на вызванное глутаматом повышение внутриклеточного кальция в нейронах, но полностью предотвращает деполяризацию митохондрий.

Таким образом, полученные данные позволяют утверждать, что соединение 22 предотвращает деполяризацию митохондрий в условиях увеличения цитозольной концентрации кальция в результате воздействия глутамата.

Пример 7. Определение влияния соединения 18 и его гидрохлорида 26 на выживаемость первичной культуры нейронов коры мозга крыс в условиях перегрузки клеток кальцием в результате действия неспецифического ионофора иономицина.

Для приготовления культур клеток использовали крысят в возрасте 3 дней. Крысят декапитировали, извлекали мозги, после чего кору головного мозга отмывали в охлажденном на льду коммерческом фосфатном буфере Дульбекко без солей кальция и магния (DPBS, Gibco®) и переносили в раствор 0.05% трипсина, доведенный до 37°С. Инкубировали при 37°С в течение 5-10 минут, после чего суспензию центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 минут (22°С). К полученному осадку добавляли среду, после чего повторяли процедуру центрифугирования. К финальному осадку добавляли среду и помещали по капле получившейся суспензии на покрывные стекла, предварительно покрытые поли-D-лизином (0.05 мг/мл). Инкубировали в течение 2 часов при 37°С, 5% CO₂, после чего добавляли среду роста. Для роста нейронов использовали нейробазальную среду А (Gibco®), содержащую добавку В27, глютамин и антибиотики (пенициллин/стрептомицин). Эксперименты проводили начиная с 8 дня культивирования.

К клеткам добавляли 100 нМ соединения 18 или 26 или равный объем растворителя ДМСО и 3 μМ иономицина (ионофора, вызывающего вход кальция в клетку). Инкубировали в течении 24 часов. Гибель нейронов в культуре определяли через 24 часа после действия иономицина и соединений 18 или 26.

Гибель оценивали стандартным биохимическим МТТ тестом. [МТТ - 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide]. МТТ добавляли в культуральную среду до конечной концентрации 1 мг/мл и инкубировали клетки 3 часа при 37°С. Затем среду отбирали и добавляли ДМСО для растворения формазанов. Оптическую плотность измеряли спектрофотометрически (590 нм) на универсальном микропланшетном ридере Victor (Perkin Elmer).

Как следует из фиг. 8, добавление иономицина к клеткам вызывает значительное снижение выживаемости нейронов коры мозга крыс, наличие в пробе как соединения 18, так и соединения 26 концентрационно-зависимо увеличивает выживаемость нейронов коры мозга крыс.

Таким образом, полученные данные позволяют утверждать, что соединение 18 и его гидрохлорид 26 обладает свойством защиты клеток от гибели в условиях увеличения цитозольной концентрации кальция.

Пример 8. Определение влияния соединения 22 на выживаемость первичной культуры нейронов коры мозга крыс в условиях перегрузки клеток кальцием.

Приготовление, выращивание первичной культуры нейронов коры мозга крыс, инкубация с веществом, индукция иономицин-вызванной токсичности и определение выживаемости клеток как в примере 7.

Аналогично примеру 7, как следует из фиг. 9 добавление иономицина к клеткам вызывает значительное снижение выживаемости нейронов коры мозга крыс, наличие в пробе соединения 22 концентрационно-зависимо увеличивает выживаемость нейронов коры мозга крыс.

Таким образом, полученные данные позволяют утверждать, что соединение 22 обладает свойством защиты клеток от гибели в условиях увеличения цитозольной концентрации кальция.

Приведенные выше примеры подтверждают, что заявляемые нами соединения являются цитопротекторными препаратами, обладающими свойством защиты от токсических стимулов, связанных с увеличением цитозольной концентрации кальция, но не подавляющего собственно самого увеличения цитозольной концентрации кальция и процессов рецептор-связанного входа кальция в клетки, т.е. не нарушая функциональную активность клеток. Этот эффект реализуется благодаря предотвращению деполяризации митохондрий.

Также еще одним аспектом изобретения является предназначение соединения общей формулы 1 лечить и предупреждать заболевания, связанные с увеличением цитозольной концентрации кальция, в частности, заболевания возбудимых тканей - нейродегенеративные, нейро-мышечные и неврологические заболевания с неконтролируемой гиперактивностью (судороги, мигрень аноксия, ишемия) с последующей дегенерацией, кардиодегенеративные заболевания, дегенеративные заболевания сетчатки, ишемические повреждения мозга и сердца и т.д.

Назначаемая для приема доза активного компонента (соединения формулы 1 или его фармацевтически приемлемых солей) варьирует в зависимости от многих факторов, таких как возраст, пол, вес пациента, симптомы и тяжесть заболевания, конкретно назначаемое соединение, способ приема, форма препарата, в виде которой назначается активное соединение.

Обычно, общая назначаемая доза составляет от 1 до 200 мг в день. Общая доза может быть разделена на несколько доз, например, для приема от 1 до 4 раз в день. При оральном назначении интервал общих доз активного вещества составляет от 10 до 200 мг в день, предпочтительно, от 15 до 150 мг. При парентеральном приеме интервал назначаемых доз составляет от 5 до 100 мг в день, предпочтительно, от 5 до 50 мг, а при внутривенных инъекциях от 1 до 50 мг в день, предпочтительно, от 1 до 25 мг. Точная доза может быть выбрана лечащим врачом.

Как это обычно принято в медицине, соединения формулы 1 согласно настоящему изобретению рекомендуется применять в виде фармакологических средств, составляющих соответственно следующий аспект изобретения.

Фармакологическое средство в качестве цитопротектора при лечении и предупреждении заболеваний, связанных с увеличением цитозольной концентрации кальция, содержит в качестве активного начала эффективное количество соединения формулы 1, составляющее обычно от 1 до 20 вес. %, или от 1 мг до 20 мг в дозируемой форме, в сочетании с одной или более фармацевтически приемлемыми вспомогательными добавками, такими как разбавители, связующие, разрыхляющие агенты, адсорбенты, ароматизирующие вещества, вкусовые агенты. В соответствии с известными методами фармацевтические композиции могут быть представлены различными жидкими или твердыми формами. Примеры твердых лекарственных форм включают, например, таблетки, пилюли, желатиновые капсулы и др.

Композиции, как правило, получают с помощью стандартных процедур, предусматривающих смешение активного начала с жидким или тонко измельченным твердым носителем.

Как видно из приведенных примеров, применением соединений формулы 1 предлагаемое изобретение решает задачу получения цитопротекторного препарата, защищающего от токсических стимулов, связанных с увеличением цитозольной концентрации кальция, но не подавляющего собственно самого увеличения цитозольной концентрации кальция и процессов рецептор-связанного входа кальция в клетки, т.е. не нарушая функциональную активность клеток.

3