СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА БОБОВНИКА АНАГИРОВИДНОГО

Изобретение относится к области биотехнологии и репродуктивной биологии растений, а именно для массового получения посадочного материала, и может быть использовано в биотехнологии, декоративном озеленении, интродукции, а также в целях сохранения генетических ресурсов и биологического разнообразия видов. Способ предназначен для регенерации растений семейства Бобовых, семенное размножение которых затруднено вследствие явления твердосемянности (состояния физического покоя).

Известен способ регенерации растений для получения посадочного материала бобовника с помощью культуры in vitro (Timofeeva SN, Elkonin LA, Tyrnov VS Micropropagation of Laburnum anagyroides Medic. through axillary shoot regeneration // In Vitro Cell.Dev.Biol.—Plant, 2014, v.50 , pp. 561–567), заключающийся в активации роста и развития побегов из уже существующих меристем вегетативных почек, включающий в себя несколько последовательных этапов. Для инициации культуры in vitro поверхностно простерилизованные изолированные почки помещали на питательную среду, содержащую минеральные соли и витамины по прописи среды Мурасиге и Скуга (MS), сахарозу (20 г/л) и агар (7 г/л); с добавлением фитогармона 6-БАП (2.2 μМ). Через 2 недели культивирования активно растущие экспланты переносили на среду для пролиферации, отличающуюся от исходной среды сниженной до Ѕ концентрации минеральных солей по MS. Через 6-8 недель культивирования на этой среде из каждой почки развивался пучок из нескольких побегов длиной 3-7 мм. Побеги длиной ≥ 5 мм отделяли от пучка и субкультивировали на свежеприготовленной среде до получения нового пучка побегов. Такой цикл микроразмножения повторяли несколько раз с регулярными пересадками через каждые 6-8 недель. После получения достаточного количества экспериментального материала отбирали побеги длиной ≥ 10 мм, состоящие из 3-4 междоузлий, переносили на среду для укоренения, отличающуюся от среды для пролиферации сниженной концентрацией минеральных солей (¼ MS) и сахарозы (10 г/л). Для стимуляции ризогенеза в среду добавляли ауксин НУК (2.7 μМ). Полученные корнесобственные растения высаживали в стаканчики с почвенным субстратом и помещали в теплицу. Через 1-2 месяца, после адаптации к нестерильным условиям, растения высаживали в полевые условия.

Однако недостатком данного способа является то, что на успешность получения культур in vitro влияет сезон эксплантирования. Кроме того, хотя частота инициации достигала 70-75%, в процессе дальнейшего культивирования не все инициированные экспланты продуцировали интенсивно растущие культуры с высоким регенерационным потенциалом. Ограничивает применение данного способа также длительность процесса получения стабильно пролиферирующих культур (около 6 месяцев) и невысокий коэффициент размножения (каждый эксплант продуцировал не более 1-2 побегов длиной ≥ 10 мм, пригодных для последующего укоренения). Кроме того, при длительном культивировании скорость размножения уменьшалась, появлялись морфологически измененные побеги, усиливался каллусогенез.

Известен также способ получения сеянцев Бобовника ангировидного путем обработки семян концентрированной серной кислотой H₂SO₄ в течение 0,5-1 часов.

Однако работы с серной кислотой требует осторожности, так как она небезопасна для исполнителя работ.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ регенерации древесного растения из сем. Бобовые Albizia odoratissima в культуре in vitro (Rajeswari V., Paliwal K. In vitro adventitious shoot organogenesis and plant regeneration from seedling explants of Albizia odoratissima L.f. (Benth.)// In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant, 2008, v.44, pp. 78-83), в соответствии с которым семена альбиции предварительно выдерживали 15 мин в 1N H₂SO₄, после чего поверхностно стерилизовали и помещали на среду для проращивания, содержавшую Ѕ минеральных солей по MS, сахарозу (30 г/л) и агар (8 г/л), без добавления фитогормонов. Из развившихся сеянцев выделяли эпикотили, которые культивировали на среде MS с добавлением БАП (5-10 μМ) для индукции органогенного каллуса и последующего развития побегов. Полученные побеги индивидуально переносили на среду MS с добавлением НУК (25 μМ), где их выдерживали 24 часа для стимуляции ризогенеза. После этого побеги культивировали на среде того же состава, но без НУК. Полученные корнесобственные растения были акклиматизированы в стерильном вермикулите, после чего высажены в почву.

Недостатками данного способа являются многоэтапность получения корнесобственных растений, что требует большого количества реактивов и увеличивает продолжительность процесса получения растений-регенерантов. В указанном способе присутствует этап каллусообразования, который повышает вероятность самоклональной изменчивости в полученном потомстве. Кроме того, работа с 1N H₂SO₄ требует осторожности, так как она небезопасна для исполнителя работ.

Задача настоящего изобретения является разработка способа получения корнесобственных растений (саженцев/посадочного материала) Бобовника анагировидного.

Технический результат заключается в упрощении, сокращении трудоемкости и длительности процесса получения посадочного материала.

Поставленная задача достигается тем, что в способе регенерации растений семейства Бобовых в культуре in vitro, включающем предварительную обработку сухих семян, поверхностную стерилизацию и культивирование на питательной среде для проращивания, согласно решению, в качестве растения выбирают Бобовник анагировидный, предварительную обработку осуществляют горячей водой при температуре от 90-100^°C, культивирование осуществляют в течение 3-4 недель, после чего развившиеся проростки высаживают в стаканчики с почвенным субстратом и помещают в микропарник для адаптации к нестерильным условиям.

Питательная среда может содержать минеральные соли и витамины по MS, 20 г/л сахарозы, 7 г/л агара, и дополнительно 2.2 μМ БАП. В качестве питательной среды может быть выбрана среда WPM с добавлением 2.2 μМ БАП.

В микропарнике постепенно снижают влажность, после появления новых листочков (через 4-6 недель) сеянцы пригодны для пересадки и выращивания в полевых условиях. Новизна предлагаемого решения заключается в том, что семена обрабатывают горячей водой, а не H₂SO₄ для получения проростков, исключается многоэтапность, присущая прототипу, длительность получения сеянцев снижается до 7-10 недель.

Предлагаемое изобретение поясняется чертежами: на Фиг.1 – представлены проростки Бобовника, развившиеся при культивировании в условиях in vitro; на Фиг.2 – адаптированные к нестерильным условиям сеянцы бобовника,

где: 1 – проростки Бобовника, развившиеся через 3 недели культивирования на среде MS с добавлением 2.2 µМ БАП (слева – предобработка сухих семян кипятком, справа – контроль, без предобработки);

2 – адаптированные к нестерильным условиям сеянцы Бобовника,

слева – через 2 недели после высадки в почву, справа – через 2 месяца после высадки в почву и выращивания в теплице.

Способ получения сеянцев (посадочного материала) бобовника анагировидного заключается в следующем:

Сухие семена бобовника помещают в мерный стакан (200 мл), заливают кипящей водой (100 мл) и оставляют на 20-30 мин до остывания воды. После этого семена раскладывают в марлевые мешочки по 30 штук, помещают в 1% раствор СМС (синтетическое моющее средство, например «Биолан»), где выдерживают 15 мин при постоянном помешивании, после чего промывают от следов СМС проточной водой (15-20 мин). Поверхностную стерилизацию проводят по общепринятой методике: мешочки с растительным материалом погружают на 1 мин в 70%-ный спирт, затем помещают на 15 мин в 0.1%-ный раствор сулемы, после чего трижды промывают стерильной автоклавированной водой. В стерильных условиях ламинара простерилизованные семена помещают на поверхность питательной среды для проращивания, содержавшей минеральные соли и витамины по MS, сахарозу (20 г/л) и агар (7 г/л), с добавлением БАП (2.2 µМ) и выращивают на свету (фотопериод 16 час / 8 час). Через 3-4 недели культивирования, после появления первого настоящего листа, развившиеся проростки высаживают в стаканчики с почвенным субстратом и помещают в микропарник для адаптации к нестерильным условиям. Через 4-6 недель сеянцы пригодны для пересадки в грунт и выращивания в полевых условиях.

Пример практической реализации способа получения сеянцев Бобовника анагировидного.

Для осуществления предлагаемого способа в качестве донорного растения использовали экземпляр Laburnum anagyroides, выращиваемый в полевых условиях дендрария Ботсада СГУ (г. Саратов). В работе использовали семена, собранные в сентябре 2010 и 2011 гг.

Преодоление физического покоя семян при проращивании. Семена бобовника на последних фазах созревания и во время хранения постепенно теряют как собственную влагу, так и способность поглощать водяные пары из воздуха. В результате формируется полная водонепроницаемость семенной кожуры, так называемая «твердосемянность» (или состояние физического покоя), значительно осложняющая прорастание семян. Из литературы известны различные методы преодоления физического покоя семян: скарификация, намачивание семян в кипятке, обработка концентрированной H₂SO₄ или промораживание. Современные методы стимуляции прорастания покоящихся семян - обработка семян физиологически активными веществами или проращивание на питательных средах в стерильных условиях (Николаева М.Г., Разумова М.В., Гладкова В.Н. Справочник по проращиванию покоящихся семян// Ленинград: изд-во «НАУКА», 1985 – 245 с.).

Были исследованы три варианта температурной предобработки семян:

• Промораживание, когда сухие семена помещали в морозильную камеру при температуре -18^°С на 1 месяц, после чего их вводили в стерильную культуру;

• Обработка горящей водой, преимущественно кипятком; введение в стерильную культуру.

• Промороженные семена обрабатывали горячей водой и введение в стерильную культуру. Полученные экспериментальные результаты отражены в Таблице 1.

После выявления факторов, влияющих на преодоление «твердосемянности» были сравнительно изучены условия проращивания семян in vivo (почвенный субстрат) и in vitro (среда MS + 0.5 мг/л 6-БАП). Полученные экспериментальные результаты отражены в Таблице 2.

Таблица 1. Влияние температурной предобработки семян на их приживаемость в стерильной культуре (%) через 4 недели первичного культивирования на средах различного состава

Примечание: изучено 3 повторности по 15-20 штук;* р ≤ 0.05; ns – нет достоверной разницы; варианты, сопровождаемые одинаковыми латинскими буквами, различаются незначимо по критерию Дункана.

Таблица 2. Влияние предобработки и условий проращивания семян на число проростков Бобовника анагировидного (%) через 1 месяц выращивания

Примечание: изучено 3 повторности по 10-15 штук; * р ≤ 0.05; варианты, сопровождаемые одинаковыми латинскими буквами, различаются незначимо по критерию Дункана.

Статистически достоверно было выявлено, что наиболее эффективной предобработкой семян была обработка горячей водой 80.8. Таким образом, согласно предлагаемому способу обработку сухих семян горячей водой необходимо проводить именно кипятком (90-100^°С) с последующей выдержкой их до остывания воды до комнатной температуры (20-30 мин). При кратковременном ошпаривании семян в кипятке (2-3 мин) частота прорастания семян была меньшей по сравнению с выдерживанием семян в горячей воде до остывания. Если уменьшали время выдержки семян в остывающей воде, число проросших семян также уменьшалось. Если замачивание кипятком сопровождалось последующей выдержкой 20-30 мин при постоянной высокой температуре (50-60^°С) наблюдали значительное ухудшение качества проростков.

В этой связи при использовании данного способа процесс тепловой обработки необходимо проводить в указанном температурном и временном диапазоне.

Упрощение способа достигается за счет исключения этапов мультипликации и укоренения микропобегов.