Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФИБРИНОГЕНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИЛЬНОЙ АНИОНООБМЕННОЙ СМОЛЫ И СОДЕРЖАЩИЙ ФИБРИНОГЕН ПРОДУКТ

Уровень техники, к которому относится изобретение

Фибриноген, также известный как фактор свертывания крови I, играет ключевую роль в гемостазе и заживлении ран. Он является гликопротеином, синтезируемом в печени, с приблизительной молекулярной массой 340000 Да, состоит из двух димеров, каждый из которых составляют три пары неидентичных полипептидных цепей, называемых Aα, Bβ и γ, связанных дисульфидными мостиками. Он циркулирует в кровотоке в концентрации приблизительно 150-400 мкг/мл. При повреждении кровеносных сосудов активируются тромбоциты и образуется тромб. Фибриноген участвует в первичном гемостазе, способствуя связыванию активированных тромбоцитов.

Параллельно начинается активация каскада свертывания крови. На завершающем этапе фибриноген преобразуется в фибрин путем протеолитического высвобождения тромбином фибринопептида А и, медленнее, фибринопептида В. Растворимые мономеры фибрина объединяются в двухцепочечные скрученные фибриллы. Далее эти фибриллы организуются вдоль друг друга с образованием более толстых волокон. Затем эти волокна сшиваются FXIIIa в фибриновую сеть, которая стабилизирует тромбоцитарную пробку путем взаимодействий фибрина с активированными тромбоцитами, что приводит к стабильному тромбу.

Расстройства и дефициты

Врожденная афибриногенемия представляет собой редкое нарушение свертываемости крови, при котором пациенты страдают от недостаточного свертывания крови вследствие отсутствия или нарушения функции фибриногена. Это медицинское состояние может приводить к случаям спонтанного кровотечения или обильным кровотечениям после незначительных травм или в ходе хирургических процедур.

Приобретенные дефициты фибриногена встречаются гораздо чаще, чем врожденная афибриногенемия, и могут индуцироваться гемодилюцией или другими событиями, такими как потеря крови во время хирургической операции, травма, диссеминированное внутрисосудистое свертывание или сепсис.

Дефицит фибриногена можно корректировать до нормальных уровней фибриногена в плазме приблизительно 1,5-3 г/л заместительной терапией с помощью внутривенной инфузии свежезамороженной плазмы или криопреципитата. Однако эти способы лечения сопряжены с риском занесения патогенов, например, вирусов или прионов, в организм пациента и, тем самым, возникновения дополнительных расстройств. Таким образом, рекомендуется внутривенно вводить композиции фибриногена, прошедшие вирусную инактивацию, для безопасного восстановления физиологических уровней фибриногена.

Несмотря на то, что существуют содержащие фибриноген препараты, которые называются фибриновым клеем, фибриногеновым адгезивом, тканевым клеем и т.п., эти препараты предназначены для местного применения в виде порошков, паст, пен или в комбинации с тканью в качестве пластыря для ран, они не пригодны для внутривенного применения, так как их консистенция и состав незамедлительно вызовут тромботические явления при инъекции. Эти препараты дополнительно содержат тромбин, соли кальция и относительно высокие количества фактора свертывания крови XIII. Примерами для таких препаратов являются US-A1-2008/003272, WO-A-95/22316 или US-A1-2008/181878.

Способы получения фибриногена описаны в EP-B1-1 240 200, который относится к способу очистки фибриногена из содержащего фибриноген раствора, включающему нанесение содержащего фибриноген раствора на ионообменную матрицу в условиях, при которых фибриноген связывается матрицей, промывание ионообменной матрицы буферным раствором, содержащим по меньшей мере одну ω-аминокислоту, элюирование фибриногена с матрицы буфером, содержащим 10 мМ Трис, 10 мМ цитрат, 45 мМ сахарозу и NaCl в концентрации от 200 мМ до 1,0 М, и необязательно выделение фибриногена из элюата.

Патентная заявка EP-B1-0 771 324 относится к способу получения свободного от вируса концентрата фибриногена, получаемого путем проведения в содержащей фибриноген разбавленной фракции плазмы химической обработки для инактивации вирусов, например, такой как обработка S/D или растворителем-детергентом, проведения осаждения полученной фракции после инактивации вирусов в растворе, содержащем аминокислоту при кислом значении рН, с получением супернатанта, фильтрации супернатанта с получением очищенного концентрата фибриногена и выделения очищенного концентрата фибриногена. Выделенный концентрат фибриногена подвергают обработке ультрафиолетовым излучением в качестве второй инактивации вирусов. Перед третьей инактивацией вирусов продукт стабилизируют и лиофилизируют.

В EP-B1-1 519 944 описано использование матрицы аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом в условиях, при которых фибриноген и плазминоген связываются с матрицей, и селективного элюирования фибриногена и 93% плазминогена по отдельности с матрицы.

В EP-B1-0 555 135 описан способ получения фибриногена для внутривенного введения путем очистки раствора фибриногена на анионообменном геле на основе сшитой агарозы, содержащей четвертичные аминогруппы. Утверждается, что полученный фибриноген свободен от фактора VIIIc.

EP-B1-1 457 497 относится к способу удаления вирусов из растворов фибриногена, отличающемуся стабилизацией и замораживанием раствора и последующим его размораживанием. Отделение нерастворенных материалов происходит перед разбавлением белка, и после него следует нанофильтрация полученного раствора с использованием фильтров с размером пор менее 35 нм.

В US-A1-2006/0009376 также описан способ производства фибриногена. Его осуществляют после многократного растворения и осаждения фибриногена для удаления фактора свертываемости крови XIII.

Goheen S. C. et al., Journal of Chromatography A. 816 (1998) 89-96, описывают ВЭЖХ ионообменную хроматографию белков плазмы: альбумина, фибриногена и иммуноглобулина (G) на непористых материалах колонки, содержащих либо функциональные группы четвертичных аминов, либо сульфопропильные функциональные группы.

Сущность изобретения

Одной из задач изобретения является предоставление концентрата фибриногена, произведенного с помощью специализированных стадий устранения и/или инактивации патогенов для устранения побочных реакций или предотвращения развития заболеваний, обусловленных патогеном. Указанные патогены выбраны из групп бактерий, вирусов и прионов, таких как прионный белок скрейпи (PrP^SC). Системное применение такого фибриногенового продукта внутривенным путем позволяет лечить врожденную афибриногенемию и приобретенные дефициты фибриногена. Применение этого стандартизованного концентрата фибриногена обеспечивает быстрое лечение в экстренных ситуациях без требующего времени размораживания свежезамороженной плазмы и снижение объемной нагрузки и надежные показатели свертываемости благодаря по существу постоянному составу.

Следующей задачей настоящей заявки является предоставление способа производства концентрата в промышленных масштабах, т.е. от нескольких сотен до тысяч литров исходного материала, такого как кровь или плазма крови, хотя также возможна мелкомасштабная продукция, т.е. от нескольких 1/10 литра до нескольких литров.

Эти и другие задачи решаются с помощью способа согласно пп.1-14 формулы изобретения и продукта, получаемого способом по настоящему изобретению в соответствии с пп.15-19 формулы изобретения.

В целом способ по изобретению для очистки или производства фибриногена из содержащего фибриноген сырья, включает стадии:

- формирование обогащенного фибриногеном преципитата путем добавления по меньшей мере одного осаждающего агента к содержащему фибриноген сырью;

- необязательно выделение обогащенного фибриногеном преципитата, например, путем центрифугирования указанного преципитата;

- отбор обогащенного фибриногеном преципитата в водную среду с получением содержащего фибриноген раствора, необязательно с последующей фильтрацией и/или ультра/диафильтрацией;

- проведение хроматографии содержащего фибриноген раствора с неподвижной фазой, имеющей сильные анионообменные группы, путем приведения в контакт указанного раствора с указанной фазой в условиях, при которых фибриноген связывается с указанной фазой;

- последующее элюирование фибриногена с неподвижной фазы с помощью водного раствора с более высокой ионной силой по сравнению с ионной силой предыдущей стадии с получением обогащенной фракции, которую собирают;

- необязательно последующие стадии разбавления и/или концентрирования обогащенной фибриногеном фракции;

- и необязательно заполнение обогащенной фибриногеном фракцией подходящих флаконов.

В одном из вариантов осуществления способа производства по изобретению содержащее фибриноген сырье выбрано из группы, состоящей из плазмы крови, фракций плазмы, таких как фракция I, или криопреципитат, культуры клеток, продуцирующих фибриноген, и/или супернатанты указанных культур клеток. Если в качестве исходного материала используется не криопреципитат, то в качестве исходного материала получают содержащий фибриноген промежуточный материал хорошо известными способами, такими как способы, описанные Cohn, Kistler-Nitschmann, и их модификации.

Для получения фармацевтически применимого продукта является преимущественным, чтобы содержащее фибриноген сырье подвергали способу инактивации вируса, например, способу с растворителем-детергентом.

В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения инактивацию вирусов проводят перед формированием обогащенного фибриногеном преципитата. Однако также инактивацию вирусов можно проводить на другой стадии.

В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения удаление инактивирующих вирусы веществ проводят путем масляной экстракции и/или хроматографии с сильными анионообменниками.

Типичный осаждающий агент для применения в способе производства по изобретению выбирают из группы, состоящей из аминокислот, таких как глицин, солей в высокой концентрации (высаливание) или пропиленгликоля.

В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения отбор представляет собой ресуспендирование пасты в буфере, имеющем рН от 7,5 до 8,5.

В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения неподвижная фаза имеет третичные или четвертичные аминогруппы.

Хроматографические стадии способа производства по изобретению, в частности, можно проводить на колонке.

Как правило, предназначенная для хранения форма заполненной обогащенной фибриногеном фракции находится в жидком состоянии, замороженном состоянии, предпочтительно при <-15°С, более предпочтительно ниже -30°С, или в качестве лиофилизата.

Также объектом настоящего изобретения является обогащенная фибриногеном фракция, полученная способом производства по изобретению. Обогащенная фибриногеном фракция по изобретению содержит, например, 0,01-9,0 нг фибринопептида А на мг фибриногена. Другая обогащенная фибриногеном фракция по изобретению имеет 0,80-1,10 мг антигена фибриногена на мг фибриногена, определенного по методу Клауса; активность vWF:Ag <0,1 МЕ на мг фибриногена; активность фактора свертывания крови XIII ≥0,07 МЕ на мг фибриногена; 0,01-1,00 мкг фибронектина на мг фибриногена и менее 0,03 МЕ тромбина на мг фибриногена.

Концентратом фибриногена заполняют конечные контейнеры после стерилизации фильтрованием, и его можно хранить в форме жидкости, замороженной жидкости или в лиофилизированной форме.

Полученный указанным способом фибриноген характеризуется низким количеством примесей, что гарантирует чистоту продукта и позволяет длительное лечение людей, нуждающихся в этом. FXIII является предпочтительным в содержащейся концентрации, поскольку он поддерживает стабилизацию образовавшегося фибрина, в то время как избыточной нагрузки этой трансглутаминазой избегают.

Термин «включающий», «включают» или «включает» также может быть заменен терминами «состоящий», «состоят» или «состоит» без изменения содержания описания.

Детальное описание изобретения

Хотя в соответствии с изобретением можно использовать практические любое содержащее фибриноген сырье, предпочтительным сырьем является криопреципитат, и далее криопреципитат служит в качестве типичного сырья для получения фибриногена в дальнейшем описании способа производства по изобретению.

Обычно криопреципитат разбавляют или растворяют в условиях подходящего буфера, в частности при приблизительно нейтральном значении рН (6,9-7,0, например, в буфере для растворения, содержащем Na-цитрат или NaCl), подвергают адсорбции, в частности, с помощью Al(OH)₃, и полученный гель удаляют, например, центрифугированием. Далее проводят инактивацию вирусов в супернатанте, например, обработкой растворителем/детергентом (S/D). Этот способ хорошо известен специалисту в данной области и впервые был описан в EP-A-131 740. Соединения S/D, такие как Triton (О-[4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенокси]полиэтоксиэтанол) и TnBP (три-N-бутилфосфат), в частности, удаляют экстракцией касторовым маслом. Для дальнейшей очистки водную фазу можно подвергать хроматографическому способу. Обычно его можно проводить путем приведения в контакт водной фазы с сильным ионообменным гелем, триметиламиноэтилом (TMAE), привитым к материалу матрицы, таким, как Fractogel® EMD-TMAE. Хороших результатов достигают в случае, если хроматографию проводят с буферами, имеющими значение рН 6,9-7,1 и осмоляльность 570-610 мосмоль/л. В этих условиях фибриноген не связывается с неподвижной фазой и, таким образом, обнаруживается в смыве или супернатанте, последний из которых получают при проведении периодической хроматографии.

Раствор не связавшегося фибриногена, содержащий, как правило, приблизительно 40 г/л (турбидометрический метод Клауса) доводят до рН 7,0-8,0, в частности, до 7,3-7,5. После добавления подходящего осаждающего агента, например, глицина, до концентрации 0,8-1,2 М, в частности, 0,9-1,1 М, конечный раствор можно перемешивать в течение 60-120 минут для осаждения фибриногена. Затем содержащий фибриноген преципитат можно далее отделять центрифугированием, и эту промежуточную пасту фибриногена можно хранить при ≤-70°С, предпочтительно при от -100°С до -70°С, в течение вплоть до одного месяца. Уже одно осаждение, например, с глицином, обеспечивает достаточно чистую пасту для дальнейшей переработки.

Полученный таким образом промежуточный материал можно ресуспендировать в 10-30 мМ Трис-буфере (рН=7,5-8,5), в частности, в 15-25 мМ Трис-буфере с рН=7,5-8,5. Затем полученную суспензию можно отфильтровывать и подвергать ультра/диафильтрации, например, против объема того же или другого буфера, равного 5-кратному объему суспензии.

Затем полученный содержащий фибриноген раствор наносят на сильный анионообменный гель, предпочтительно выбранный из группы третичных или четвертичных аминогрупп в качестве лигандов, привитых к матрице. Указанные функциональные группы выбраны из хорошо известных диэтиламиноэтила (DEAE), триметиламиноэтила (TMAE) и других групп, в то время как носитель может состоять из целлюлозы, агарозы, диоксида кремния, полимерного или керамического материала. Хорошие результаты, в частности, в отношении восстановления фибронектина и витронектина, могут быть достигнуты с помощью триметиламиногрупп, привитых к гидроксилированному метакриловому полимеру, такому как GigaCap Q-650®, через связывающую группу. Это является в высокой степени неожиданным, поскольку химически сходный Macro-Prep High Q®, метакриловый сополимер, состоящий из диэтиленгликольдиметакрилата/глицидилметакрилата также с триметиламинолигандами, но без гидроксильной функциональной группы в его полимерной основной цепи, является менее эффективным в отношении восстановления указанных двух белков. Эффективное восстановление вязкого фибронектина является в высокой степени преимущественным для необязательных фильтраций, таких как ультра/диафильтрация или нанофильтрация, так как срок службы фильтров увеличивается благодаря меньшей закупорке. Если предполагается, что способ включает нанофильтрацию, предпочтительным является выполнение способа с разбавленным раствором (концентрация фибриногена приблизительно 2 г/л), в частности, в случае каскадного использования нанофильтров. Хроматографический гель или смолу, в частности, предварительно уравновешивают тем же буфером, который использовался для ресуспендирования промежуточной пасты фибриногена перед нанесением раствора фибриногена. Слабо связавшиеся вещества вымывали уравновешивающим буфером, а затем промывочным буфером (1,5 г/л цитрата натрия, 6,0 г/л хлорида натрия, доведенный до рН=6,8-7,2, предпочтительно 6,9-7,1 и обладающий проводимостью 11,0-13,0 мСм/см при комнатной температуре 20-25°С).

Затем фибриноген можно элюировать с хроматографической колонки элюирующим буфером, содержащим 1,5 г/л цитрата натрия и 10,0 г/л глицина, в частности, доведенным до того же диапазона рН, что и у промывочного буфера, например, с помощью HCl и/или NaOH, и доведенным с помощью приблизительно 7,0 г/л NaCl до проводимости 13,1-15 мСм/см при комнатной температуре 20-25°С. Приблизительно 74% нанесенного на колонку фибриногена выделяется в элюате, в то время как фибронектин практически полностью удаляется из содержащего фибронектин элюата.

Этот отфильтрованный раствор фибриногена можно далее концентрировать ультра/диафильтрацией до 20-26 г/л и подвергать стерилизации фильтрованием через мембраны с номинальным размером пор ≤0,2 мкм. Специалистам в данной области известно, что также достижимы другие концентрации, такие как 1-19,9 г/л или 26,01-30 г/л или даже выше. Концентрат фибриногена по настоящему изобретению также можно изготавливать с адъювантами и стабилизаторами, известными специалисту в данной области, такими как углеводороды, например, сахароза, трегалоза, аминокислоты, например, глицин, гистидин, аланин, аргинин, и детергентами, например, полиоксиэтилен-(20)-сорбитанмоноолеатом (TWEEN 80®). Этот подвергнутый стерилизации фильтрованием совокупный материал либо необязательно хранят в течение вплоть до 5 суток при -70°С или ниже, в частности, при от -70°С до -80°С, до проведения стерилизации фильтрованием во второй раз и заполнения в конечные контейнеры, либо необязательно лиофилизируют без второй стерилизации фильтрованием.

Нет необходимости добавлять дополнительные буферы, стабилизаторы, адъюванты или другие добавки, такие как фактор свертывания крови XIII (F XIII). Фактор свертывания крови XIII присутствует в концентрате с активностью ≥0,05 МЕ на мг фибриногена (по методу Клауса), в частности 0,07-0,3 МЕ на мг фибриногена, 0,06-0,5 МЕ на мг фибриногена, или 0,05-1 МЕ на мг фибриногена.

Концентрат фибриногена, полученный способом по настоящему изобретению, проявляет свои биологические свойства через отношение антиген фибриногена/фибриноген по методу Клауса 0,80-1,10, в частности, 0,85-1,05 или 0,90-1,00; содержание фибринопептида А 0,01-9,0 нг на мг фибриногена (по методу Клауса), в частности, 0,05-8,0 нг на мг фибриногена или 0,08-6,0 нг на мг фибриногена; активность vWF:Ag <0,1 МЕ на мг фибриногена (по методу Клауса), в частности, 0,001-0,09 МЕ на мг фибриногена, 0,002-0,07 МЕ на мг фибриногена, 0,002-0,04 МЕ на мг фибриногена; активность фактора XIII ≥0,07 МЕ на мг фибриногена (по методу Клауса), в частности, 0,07-0,3 МЕ на мг фибриногена, в частности, 0,08-0,5 МЕ на мг фибриногена, или 0,07-1 МЕ на мг фибриногена; содержание фибронектина 0,01-1,00 мкг на мг фибриногена (по методу Клауса), в частности, 0,03-0,70 мкг на мг фибриногена или 0,05-0,40 мкг на мг фибриногена; и активность плазминогена 1-11 мМЕ на мг фибриногена. Было определено, что активность тромбина находится ниже порога определения 0,15 МЕ/мл для всех испытаний и при тех концентрациях фибриногена, которые указаны в таблице 1, что эквивалентно менее чем 0,007 МЕ на мг фибриногена или 0,0069-0,0001 МЕ/мг.

Далее изобретение поясняется с помощью следующего неограничивающего примера.

Пример

Криопреципитат, полученный из плазмы крови с использованием общепринятых способов, разбавляли или растворяли при приблизительно нейтральном значении рН, подвергали адсорбции на Al(OH)₃, и полученный гель удаляли центрифугированием. Затем супернатант подвергали инактивации вирусов обработкой растворителем-детергентом (S/D). Соединения растворителя/детергента, Triton и TnBP, экстрагировали растительным маслом и водную фазу приводили в контакт с Fractogel® EMD-TMAE. Использовали условия хроматографии (значение рН 6,9-7,1 и осмоляльность 570-610 мосмоль/л), в которых фибриноген не связывался с гелем и, таким образом, обнаруживался в смыве или супернатанте.

Раствор не связавшегося фибриногена перемешивали в течение приблизительно 90 минут после добавления глицина (конечная концентрация 1 моль/л и рН=7,4) для осаждения фибриногена.

Содержащий фибриноген преципитат далее разделяли центрифугированием с получением промежуточной пасты фибриногена.

Полученный таким образом промежуточный материал ресуспендировали в 20 мМ Трис-буфере (рН=приблизительно 8,0). Затем полученную суспензию фильтровали и подвергали ультра/диафильтрации.

Затем полученный содержащий фибриноген раствор наносили на GigaCap Q-650M® и хроматографический гель или смолу предварительно уравновешивали тем же Трис-буфером, который использовали для ресуспендирования перед нанесением раствора фибриногена. Слабо связавшиеся молекулы вымывали уравновешивающим буфером, а затем промывали промывочным буфером (1,5 г/л цитрата натрия, 6,0 г/л хлорида натрия, значение рН, доведенное до приблизительно 7,0, и проводимость приблизительно 12,0 мСм/см). Затем фибриноген элюировали с хроматографической колонки элюирующим буфером (1,5 г/л цитрата натрия и 10,0 г/л глицина, доведенный до того же рН, что и у промывочного буфера, и доведенный с помощью приблизительно 7,0 г/л NaCl до проводимости 13,1-15 мСм/см).

Полученный раствор фибриногена концентрировали, составляли и подвергали стерилизации фильтрованием. Подвергнутый стерилизации фильтрованием совокупный материал хранили в течение 5 суток при температуре -80°С, а затем подвергали стерилизации фильтрованием во второй раз и заполняли в конечные контейнеры. Одну часть конечных контейнеров лиофилизировали, а другую часть хранили в качестве жидкого состава.

Продукты четырех разных серий получения анализировали после восстановления лиофилизированного продукта. Восстановление лиофилизатов проводили добавлением воды для инъекций вплоть до концентрации до лиофилизации. Все серии получения проводили, по существу так, как представлено в примере. Результаты представлены в Таблице 1.

В таблице 2 представлена нормализация измеренных значений путем вычисления содержания или активности на мг фибриногена при определении по методу Клауса.

Сравнение с коммерчески доступными продуктами.

В таблице 3 представлены измеренные значения для коммерчески доступных концентратов фибриногена. Все продукты представляли собой лиофилизированные продукты и их восстанавливали в соответствии с рекомендациями изготовителя. Также показан диапазон значений серий 1-4 согласно настоящему изобретению, как уже показано в Таблице 1.

В Таблице 4 представлена нормализация измеренных значений для коммерчески доступных продуктов путем вычисления содержания или активности на мг фибриногена при определении способом Клауса. Также показан диапазон значений для серий 1-4 в соответствии с настоящим изобретением, как уже показано в Таблице 2.

Сравнение с предпочтительным вариантом осуществления WO 01/48016.

1 г пасты фракции I экстрагировали с помощью 8,33 г экстрагирующего буфера (0,8 М NaCl, 5 мМ ε-АСА (эпсилон-аминокапроновая кислота), 20 мМ Na-цитрат, 60 МЕ/мл гепарина и рН=7,3, т.е. усовершенствованный буфер согласно разделу 1.1.19) при 37°С в течение 2 часов. К супернатанту после выделения добавляли 50 г 2% раствора гидроксида алюминия (алгидрогеля). Смесь перемешивали в течение 15 минут при комнатной температуре, центрифугировали при 5000g в течение 10 минут и осадок выбрасывали. Супернатант алгидрогеля и буфер глицина/NaCl (2,1 М глицин, 20 мМ Na-цитрат, 3,6 М NaCl и 2,4 мМ CaCl₂) доводили до 30,2°С и 29,7°С, соответственно, и супернатант добавляли к буферу в течение 4,5 минут. Смесь 1 части супернатанта и 2,05 частей буфера перемешивали в течение 20 минут при 30,2°С-31,1°С, после чего центрифугировали в течение 10 минут при 5000g. Преципитат Gly/NaCl повторно растворяли в буфере D, соответствующем 1/3 объема супернатанта после экстракции пасты фракции I, при 21°С при постоянном перемешивании в течение 2 часов. После этого повторно растворенный преципитат обрабатывали S/D с помощью полисорбата-80 и TnBP в течение 1 часа в концентрациях 1% (полисорбат-80) и 0,3% (TnBP) при приблизительно 23°С. Анионообменную хроматографию проводили на смоле MacroPrep® HQ в колонке XK26 и при высоте слоя приблизительно 20 см, что соответствовало приблизительно объему колонки приблизительно 100 мл при скорости потока 10 мл/мин. Уравновешивание проводили 2 объемами колонки усовершенствованного буфера MQ (50 мМ ТРИС, 100 мМ NaCl, 20 мМ ε-АСА при рН=8,0, раздел 2.2.3) и проводимость (после колонки), достигала указанных границ проводимости буфера MQ ±10%. После промывки колонки шестью объемами буфера MQ, фибриноген элюировался в виде одиночного пика с помощью усовершенствованного буфера ME (500 мМ NaCl, 1,1 мМ CaCl₂, 10 мМ Na-цитрат, 10 мМ Трис и 45 мМ сахароза при рН=7,0, т.е., буфер D+2×200 мМ NaCl). Аналитические результаты представлены в Таблице 5.