Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ У ПОСТРАДАВШИХ С ТЯЖЕЛОЙ ТРАВМОЙ, КРОВОПОТЕРЕЙ И ГИПОКСИЕЙ

Изобретение относится к медицине, в частности к анестезиологии и реаниматологии, и касается лабораторных способов и средств для прогноза развития инфекционных осложнений у пострадавших с тяжелой травмой и кровопотерей.

Одной из важных отличительных особенностей тяжелой травмы является симультанное повреждение опорно-двигательного аппарата и подлежащих паренхиматозных органов с развитием феномена взаимного отягощения [Инфекционная защита пострадавших с тяжелой сочетанной травмой / Карпун Н.А., Евдокимов Е.А., Чаус Н.И. // Медицинский алфавит. Неотложная медицина. 2013. - №4 - с. 38-41]. При этом происходит выброс миоглобина, продуктов размозжения мягких тканей, разрушения костей, лизиса гематом с массивным выделением медиаторов воспаления, а также нарушением барьерной функции кожи, слизистых оболочек, кишечника. Создаются крайне благоприятные условия для возникновения вторичных инфекционных осложнений. Локальные гнойно-воспалительные осложнения могут быть непосредственно связаны с механизмом повреждения, загрязнением ран (обширные скальпированные раны, открытые переломы и отрывы конечностей, ранения исходно колонизированных тканей, черепно-мозговые травмы с повреждением слизистых полости рта и носа, переломы таза с повреждением стенки кишки и органов мочеполового тракта), перфорацией полых органов. Закрытая черепно-мозговая травма, тупая травма груди и живота, закрытые переломы, синдром длительного сдавления и другие могут иметь очень тяжелое течение с развитием пневмоний, сепсиса [Ранние маркеры инфекционных осложнений у пострадавших с сочетанной травмой / Черневская Е.А., Белобородова Н.В., Шабанов А.К., Налбандян Р.Т., Сергеев А.А. // Медицинский алфавит. Неотложная медицина. 2013 - №4 - с. 33-37].

Развитию инфекционных осложнений способствует целый ряд факторов: множественность очагов инфицирования (первичного, вторичного, ятрогенного); наличие гематом, большого числа ушибленных и размозженных тканей, поздняя хирургическая обработка открытых повреждений; сочетание экзогенного и эндогенного пути инфицирования: эндогенная микрофлора пострадавшего, полирезистентная госпитальная микрофлора, инородные тела в тканях и органах (пуля, дробь, щепки и т.п.), снижение иммунитета прежде всего вследствие механической потери лейкоцитов и иммуноглобулинов во время кровотечения [Ранние маркеры инфекционных осложнений у пострадавших с сочетанной травмой / Черневская Е.А., Белобородова Н.В., Шабанов А.К., Налбандян Р.Т., Сергеев А.А. // Медицинский алфавит. Неотложная медицина. 2013 - №4 - с. 33-37].

Наиболее частыми в структуре инфекционных осложнений у больных с политравмой являются пневмония (35%), трахеобронхит (23%), цистит (20,3%), пролежни (11,9%). Легочные осложнения занимают у пострадавших с травмой первое место в структуре всех инфекционных осложнений.

Пневмония служит основной причиной смерти более чем у 70% больных с тяжелой травмой, умерших через трое суток и более с момента получения травмы [Инфекционная защита пострадавших с тяжелой сочетанной травмой / Карпун Н.А., Евдокимов Е.А., Чаус Н.И. // Медицинский алфавит. Неотложная медицина. 2013. - №4 - с. 38-41. Ранние маркеры инфекционных осложнений у пострадавших с сочетанной травмой / Черневская Е.А., Белобородова Н.В., Шабанов А.К, Налбандян Р.Т., Сергеев А.А. // Медицинский алфавит. Неотложная медицина. 2013 - №4 - с. 33-37].

Тяжелая травма и кровопотеря приводят к компенсаторному выбросу лейкоцитов из костного мозга и кровяных депо в ответ на значительные разрушения тканей в результате травмы и кровопотери. Увеличение количества лейкоцитов в плазме крови пострадавших сразу после травмы направлено на удаление продуктов клеточного распада в поврежденных тканях и профилактику инфекционных осложнений.

Нейтрофильные гранулоцитарные лейкоциты вместе с мононуклеарными макрофагами относят к фагоцитирующим лейкоцитам. Способность нейтрофилов и макрофагов к фагоцитозу определяет их основную защитную функцию - очистка организма от инфекционных агентов и продуктов распада тканей, в частности удаление продуктов клеточного распада после травмы. 60% общего числа гранулоцитов находится в костном мозге, составляя костномозговой резерв, около 40% - в различных тканях и лишь 1% - в периферической крови [Neutrophil kinetics in health and disease / Summers C., Rankin S.M., Condliffe A.M., Singh N., Peters A.M., Chilvers E.R. // Trends Immunol. 2010. - 31 - Vol 8 - P. 318-324. doi: 10.1016 / j.it. 2010.05.006, Homeostatic Regulation of Blood Neutrophil Counts / Vietinghoff S., Ley K. // The Journal of Immunology. 2008. - 181 - Vol 8 - P. 5183-5188, PMID: 18832668 PMCID: PMC2745132].

При травме или длительном воздействии патологических факторов может наступать необратимое повреждение клеток и их гибель. В норме процессы пролиферации и отмирания клеток находятся в динамическом равновесии. В результате травмы и массивной кровопотери происходит сдвиг равновесия в сторону повреждения клеток, что может способствовать развитию критического состояния. Общеизвестными и наиболее распространенными путями гибели клеток являются апоптоз и некроз [Мороз В.В. Обмен холестерина, ДНК-повреждения, апоптоз и некроз клеток в крови при тяжелой сочетанной травме / Мороз В.В., Решетняк В.И., Муравьева М.Ю., Жанатаев А.К., Марченков Ю.В., Дурнев А.Д. // Общая реаниматология. 2008. - 4 - №1. - с. 4-13]. Недостаточный транспорт кислорода, особенно на фоне высоких метаболических потребностей, быстро истощает энергетические системы клетки и запускает механизмы ее гибели. Гипоксия, которая характеризуется снижением напряжения кислорода, нарастанием уровня лактата, изменением pH и BE в крови, является одним из пусковых факторов развития как апоптоза, так и некроза клеток [Боровкова Н.В. Реакция лейкоцитов и апоптоз лимфоцитов периферической венозной крови как маркер тканевой ишемии при острой массивной кровопотере / Боровкова КВ., Валетова В.В., Тимербаев В.Х., Казаков М.Г., Никитина О.В., Хватов В.Б. // Общая реаниматология. 2013. - 9 №4. - с. 18-22]. Пострадавшие с выраженными признаками гипоксии являются наиболее тяжелыми в плане развития осложнений, в том числе и инфекционных.

В некоторых исследованиях была показана корреляция послеоперационных осложнений с повышенным уровнем активации апоптоза лимфоцитов у больных, перенесших оперативное вмешательство [Apoptosis and Surgical Trauma Dysregulated Expression of Death and Survival Factors on Peripheral Lymphocytes / Delogu G., Moretti S., Antonucci A., Marcellini S., Masciangelo R., Famularo G, Signore L., C. De Simone // Arch Surg. 2000. - 135 - P. 1141-1147]. Большое количество исследований было проведено по изучению процессов повреждения клеток у больных с сепсисом. Так, у больных, умерших в результате сепсиса, была повышена активность апоптотических процессов в лимфоцитах, а также в эпителиальных клетках гастроинтестинального тракта. В некоторых работах было показано увеличение апоптотической активности в лимфоидных тканях у пострадавших в раннем послеожоговом периоде [Caspase-3-Dependent Organ Apoptosis Early After Burn Injury / Fukuzuka K., Rosenberg J.J., Gaines G.C., Edwards С.K., Clare-Salzler M., MacKay S.L.D., Lyle L. Moldawer, Copeland E.M., Mozingo D.W. // AnnSurg. 1999. - 229 - Vol 6 - P. 851, Trauma induces apoptosis in human thoracolumbar intervertebral discs / Heyde C-E, Tschoeke S.K., Hellmuth M., Hostmann A., Ertel W., Oberholzer A. // BMC Clinical Pathology. 2006. - Vol 6 - P. 5].

Существует большое количество маркеров инфекционных процессов: динамика изменения уровня прокальцитонина, изменение уровня лейкоцитоза, рентгенологические признаки развития таких инфекционных процессов, как пневмония, гнойный трахеобронхит.

Недостатками данных методов являются поздние сроки диагностики инфекционного процесса, позднее начало антибактериальной терапии, а также данные методы не являются прогностическими.

Задачей изобретения является прогноз развития инфекционных осложнений у пострадавших с тяжелой травмой, кровопотерей и выраженной гипоксией в ранние сроки после травмы (на 3-и сутки после травмы), обладающий высокой точностью.

Поставленная задача решается способом, заключающимся в том, что у пострадавших с тяжелой травмой, кровопотерей, выраженной гипоксией на 3-и сутки после травмы определяют сумму показателей некротических ДНК-комет и одно-, двунитевых разрывов ДНК в крови пострадавших, и при величине суммарного показателя ниже 29% прогнозируют развитие инфекционных осложнений на 5-7 день после травмы.

При этом на 3-й день после травмы сумма значений показателей некротических ДНК-комет и одно-,двунитевых разрывов ДНК были более высокие [37,1 (35,6; 45,8)%] у пострадавших без признаков инфекционных осложнений (в течение всего периода наблюдения), чем те же значения [20,2 (15,4; 28,7)%] в группе пострадавших с развившимися в дальнейшем инфекционными осложнениями.

Проводят ROC-анализ с целью выявления значимости суммарного (некротические ДНК-кометы+одно-,двунитевые разрывы ДНК) показателя в качестве прогностического признака вероятности развития инфекционных осложнений. ROC-анализ суммарного показателя, полученного на 3-й день после травмы в группе пострадавших с выраженной гипоксией, выявил:

1. Значение площади под ROC кривой, построенной по суммарному показателю на 3-й день после травмы, составило 0.904 (чувствительность - 76,9%, специфичность - 100,0%). Точка отсечения (cut-off point) составила 29% суммарного показателя.

2. Уровень суммарного показателя выше данной точки может служить хорошим прогностическим признаком, позволяющим предположить малую степень вероятности развития инфекционных осложнений у пострадавших с травмой и выраженной гипоксией.

3. Значения суммарного показателя ниже 29% свидетельствуют о высоком риске развития инфекционных осложнений у пострадавших с травмой и выраженной гипоксией.

Уровень некротических ДНК-комет и одно-,двунитевых разрывов оценивали методом гель-электрофореза изолированных клеток (метод «ДНК-комет») [The Comet Assay in Toxicology Developmental Toxicology Division / Dhawan A., Anderson DJ/Indian Institute of Toxicology Research. Lucknow. India. 2009. P. 478].

Метод основан на регистрации различной скорости передвижения в постоянном электрическом поле целой и фрагментированной ДНК изолированных клеток, заключенных в агарозный гель.

Практический способ осуществляли следующим образом, образцы крови (2 мл) пострадавшего с травмой и выраженной гипоксией на третьи сутки смешивали с равным объемом среды RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute medium), содержащей 10% диметилсульфоксида, замораживали и хранили до анализа при -20°C. Образцы крови в объеме 50 мкл вносили в пробирки с 500 мкл 1% раствора агарозы, ресуспендировали и наносили на предварительно покрытые агарозой предметные стекла. После затвердевания агарозы микропрепараты лизировали охлажденным буфером (10 тМ Tris-HCl [pH 10], 2.5 М NaCl, 100 mM EDTA-Na2, 1% Triton X-100, 10% DMSO) не менее 1 часа. После окончании лизиса проводили электрофорез в щелочной и нейтральной версиях. По окончанию этапа электрофореза микропрепараты фиксировали в 70% растворе этилового спирта, высушивали и хранили до анализа при комнатной температуре. Непосредственно перед микроскопированием препараты окрашивали флуоресцирующим красителем SYBR Green I (1:10000 в TE-буфере) в течение 30 мин. Анализ проводили на эпифлуоресцентном микроскопе Микмед-2 12Т («Ломо», Россия), совмещенном с цифровой камерой высокого разрешения (VEC-335, «ЭВС», Россия), при увеличении х400. Полученные с микропрепаратов изображения ДНК-комет анализировали с использованием программного обеспечения CASP 1.2.2 (CASPLab, USA).

Клинический пример 1

Больная С., 32 года, поступила в отделение реаниматологии по каналу скорой медицинской помощи. Механизм травмы: пострадала в дорожно-транспортном происшествии, пешеход. Диагноз после обследования: Тяжелая сочетанная травма. Закрытая черепно-мозговая травма. Ушиб головного мозга тяжелой степени. Закрытый оскольчатый внутрисуставной метадиафизарный перелом правой большеберцовой кости со смещением. Закрытый перелом мыщелков левой большеберцовой кости, шейки малоберцовой кости со смещением. Закрытый оскольчатый перелом костей правого предплечья в нижней трети со смещением. Закрытый перелом локтевого отростка справа со смещением. Закрытый оскольчатый перелом хирургической шейки правой плечевой кости со смещением, переломы лопаточной ости справа. Рвано-ушибленная рана головы, правого и левого бедра. Ссадины лица, туловища, конечностей.

Кровопотеря составила - около 2000 мл (30,7 мл/кг). За выраженную гипоксию свидетельствовали следующие данные: pO₂ капиллярной крови составило 37,7 мм рт.ст., pH - 7,23 и BE - минус 6,7 ммоль/л плазмы крови.

В отделении проводилась многокомпонентная интенсивная терапия, включающая инфузионную, антибактериальную профилактику стресс-язв, тромботических осложнений, респираторная поддержка.

За период наблюдения (15 суток) состояние больной оставалось крайне тяжелым. На 3-и сутки наблюдения уровень лейкоцитов был 7,2×10⁹, п/я 7, по данным рентгенологического исследования органов грудной клетки признаков инфильтрации, снижения прозрачности не было. У больной был определен уровень некротических / ДНК-комет 5,4%, а также уровень одно-,двунитевых разрывов ДНК - 5,6%. Суммарный показатель составил 11%, что было неблагоприятным прогностическим признаком для развития инфекционных осложнений. В дальнейшем состояние больной оставалось крайне тяжелым, нестабильным. По клинико-лабораторным данным на 7-й день наблюдения у больной развилась двусторонняя полисегментарная пневмония, проявляющаяся появлением влажных хрипов в заднебазальных отделах легких, повышением температуры до 38,8 градусов, увеличением уровня лейкоцитов до 14,3×10⁹, п/я 12 и выявлением инфильтративных изменений в легких по данным рентгенологического исследования органов грудной клетки, что потребовало проведения смены антибактериальной терапии.

Клинический пример 2

Больной Т., 40 лет, поступил в отделение реаниматологии по каналу скорой медицинской помощи. Механизм травмы: пострадал в дорожно-транспортном происшествии, пешеход. Диагноз после обследования: Тяжелая сочетанная травма. Закрытая черепно-мозговая травма. Ушиб головного мозга средней степени тяжести. Множественные переломы костей лицевого скелета. Открытый оскольчатый перелом костей левой голени в средней трети со смещением. Закрытый перелом левого бедра в средней трети со смещением. Перелом межмыщелкового возвышения, внутреннего мыщелка бедра и большеберцовой кости, головки малоберцовой кости слева.

Кровопотеря составила - около 1500 мл (20,0 мл/кг). За выраженную гипоксию свидетельствовали следующие данные: pO₂ капиллярной крови составило 32,8 мм рт.ст., pH - 7,26 и BE - минус 6 ммоль/л плазмы крови.

В отделении проводилась многокомпонентная интенсивная терапия, включающая инфузионную, антибактериальную профилактику стресс-язв, тромботических осложнений, респираторная поддержка.

За период наблюдения (15 суток) состояние больного оставалось тяжелым. На 3-и сутки наблюдения уровень лейкоцитов был 5,6×10⁹, п/я 5, по данным рентгенологического исследования органов грудной клетки признаков инфильтрации, снижения прозрачности не было. У больного был определен уровень некротических ДНК-комет 19,7%, а также уровень одно-,двунитевых разрывов ДНК - 11,4%. Суммарный показатель составил 31,1%, что свидетельствовало о низком риске развития инфекционных осложнений. В дальнейшем состояние больного с положительной динамикой в виде стабилизации состояния, снижения уровня респираторной поддержки с последующим отключением от аппарата искусственной вентиляции легких и перевода больного на самостоятельное дыхание на 7-е сутки, уровень лейкоцитов 7,8×10⁹, п/я 5, по данным контрольного рентгенологического исследования органов грудной клетки инфильтративных изменений не выявлено. На 15-е сутки больной был переведен в профильное отделение. Таким образом, у данного пострадавшего за период наблюдения инфекционных осложнений не было.

Предлагаемый способ позволяет с высокой точностью прогнозировать развитие инфекционных осложнений, что дает возможность принять адекватные методы лечения и снизить количество неблагоприятных исходов.