Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРОГНОЗА ПРОГРЕССИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ (ХОБЛ)

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к диагностике, а также к исследованию биологических жидкостей с помощью физических и химических методов и может быть использовано в пульмонологии для прогнозирования неблагоприятного течения хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) и своевременной корректировки лечения.

Ведущие пульмонологи мира говорят об актуальности данной темы. Уже сегодня в мире насчитывается 210 миллионов пациентов с ХОБЛ, и эта цифра постоянно увеличивается. В настоящее время ХОБЛ - четвертая по распространенности причина смертности в мире. Если не уделить профилактике и лечению заболевания самое пристальное внимание, то, по прогнозам ВОЗ, к 2020 году ХОБЛ может занять третье место в этом печальном списке. Россия не является исключением из общемировой статистики. В нашей стране проблема ХОБЛ стоит особенно остро, что обусловлено широким распространением курения, неблагоприятной экологической обстановкой, климатическими факторами и несвоевременной диагностикой заболевания. Так, уже в 2007 году в России было зарегистрировано 2,4 млн пациентов с диагностированной ХОБЛ. Всего же, предположительно, ХОБЛ страдают около 11 миллионов человек - почти 10% населения. Столь ощутимая разница в цифрах объясняется тем, что, как правило, заболевание диагностируется на поздних стадиях, когда неуклонно прогрессирующий патологический процесс уже не поддается лечению. Этим объясняется и высокая смертность среди больных. Причем тенденция эта характерна не только для России. По данным Европейского респираторного общества только 25% случаев заболевания диагностируется своевременно. Смертность среди больных ХОБЛ после выписки из стационара составляет 43% в течение одного года и 49% в течение двух лет.

Стратегия и тактика ведения больного ХОБЛ определяется клинической ситуацией, включающей многочисленные факторы, учет которых необходим для рационального ведения больного и предусматривает использование как медикаментозных, так и немедикаментозных методов. Ранняя диагностика ХОБЛ крайне затруднительна, так как данная патология характеризуется медленным прогрессированием и длительным бессимптомным периодом. В ситуации, когда развивается типичная клиническая картина, свидетельствующая о наличии у пациента необратимых изменений бронхолегочного аппарата, диагностика ХОБЛ сводится к определению изменений функции внешнего дыхания, наличия или отсутствия воспалительного компонента, а также проведения нагрузочных тестов. Таким образом, в настоящее время вопросы диагностики и прогнозирования при ХОБЛ являются одними из наиболее актуальными.

Известен «Способ прогнозирования течения неспецифических заболеваний легких» (пат. RU №2121675 от 10.11.1998). Исследуют бронхиальный секрет и/или мокроту с помощью микробиологических методов. Определяют количество условно патогенных бактерий, патогенных бактерий и грибов рода Candida, оценивая каждый показатель в баллах. При сумме баллов 0-2 прогнозируют ремиссию неспецифических заболеваний легких, при 3-5 - обострение пневмонии с благоприятным течением, при 6-8 баллах - хроническую пневмонию с бронхоэктазами и абсцедированием или хроническую пневмонию с неблагоприятным течением, при 9-12 баллах - выраженный иммунодефицит и наличие злокачественных новообразований в легких.

По мнению авторов, известный способ повышает возможность и точность прогнозирования течения воспалительных заболеваний легких.

К недостаткам известного способа можно отнести необходимость исследовать бронхиальный секрет, получаемый при бронхоскопии, что является сложной дорогостоящей манипуляцией, травматичной для больного, требующей особой подготовки и нахождения пациента в стационаре.

За прототип предлагаемого изобретения выбран известный способ прогноза прогрессирования хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), включающий измерение объема форсированного выдоха за 1 с (ОФВ1, %). (Marina Saetta et all CD8+ T-Lymphocytes in Peripheral Airways of Smokers with Chronic Obstructive Pulmonary Disease / American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, Vol. 157, (1998), p. 822-826)

Известный способ включает:

- определение ОФВ1 за 1 с (у лиц с ОФВ1 <80% от должного проводился бронходилатационный тест - повторное исследование ОФВ1 через 15 мин после ингаляции 200 мкг сальбутамола),

- определение форсированной жизненной емкости легких (ФЖЕЛ),

- гистологический, морфометрический и иммуногистохимический анализы операционного материала (периферические дыхательные пути), полученный от 16 курильщиков, перенесших резекцию легких по поводу локализованного онкологического поражения. Девять пациентов из обследованных имели симптомы хронического бронхита и хронического ограничения скорости воздушного потока, семь - бессимптомное течение с нормальной функцией легких. При этом морфометрический анализ включал измерение внутреннего диаметра и величины стенки дыхательных путей и зоны гладких мышц. В периферических дыхательных путях, полученных при резекции легких, оценивали содержание нейтрофилов, макрофагов, CD4+ и CD8+, Т-лимфоцитов, инфильтрирующих стенку дыхательных путей.

Количество CD8+ Т-лимфоцитов и объем гладких мышц были увеличены у курильщиков с симптомами хронического бронхита и хронической бронхиальной обструкции по сравнению с бессимптомными курильщиками с нормальной функцией легких, в то время как количество нейтрофилов, макрофагов и CD4+ Т-лимфоцитов были одинаковыми в обеих группах испытуемых лиц.

Авторы исследования пришли к выводу, что у курильщиков, у которых развиваются симптомы хронического бронхита и хронического ограничения скорости воздушного потока, увеличено число CD8+ Т-лимфоцитов и увеличена зона гладких мышц в периферических дыхательных путях по сравнению с бессимптомными курильщиками с нормальными показателями функции легких, что, по мнению авторов способа-прототипа, свидетельствует о важной роли CD8+ Т-лимфоцитов и ремоделирования дыхательных путей в патогенезе хронической обструктивной болезни легких.

Однако известный способ был разработан в исследовательских целях для изучения вопроса, отличается ли воспалительный процесс в периферических дыхательных путях у курильщиков, у которых развиваются симптомы хронического бронхита и хроническое ограничение воздушного потока, от бессимптомных курильщиков, у которых не развивается хроническое ограничение скорости воздушного потока. Способ основан на исследовании легочной ткани, полученной во время операции по поводу рака легкого, что делает невозможным его широкое применение в клинической практике, так как требует проведения оперативного вмешательства. Авторы предлагаемого изобретения пришли к выводу, что чрезмерное выделение CD8⁺ Т-лимфоцитами может возникнуть в ответ на повторные вирусные инфекции, что делает известный способ недостаточно точным. Необходимо отметить, что для данной категории больных прогнозирование ХОБЛ не является существенным, поскольку их жизненный прогноз в последующем определяется течением онкопатологии.

К недостаткам способа-прототипа можно отнести следующее:

- инвазивное (хирургическое) получение исследуемого материала, что малодоступно в клинической практике и травматично для больного,

- недостаточная точность прогноза, так как исследование CD8⁺ проводилось у пациентов, оперированных по поводу опухолей легких,

- для данной категории больных значимым является течение основного заболевания (онкопатологии), а не хронической обструктивной болезни легких,

- выполнение способа занимает много времени и не обеспечивает возможность экспресс-прогнозирования тяжелого точения ХОБЛ, равно как и осуществить коррекцию проводимого лечения

Задачей предлагаемого изобретения является создание способа прогноза прогрессирования хронической обструктивной болезни легких, лишенного недостатков прототипа.

Технический результат предлагаемого способа заключается в повышении точности прогноза прогрессирования ХОБЛ, исключении инвазивного вмешательства, обеспечении возможности экспресс-прогнозирования тяжелого течения ХОБЛ, сокращении времени исследования. Способ является неинвазивным, так как содержание растворимых молекул мембранного антигена CD8⁺ осуществляется без забора крови у больного только на основании данных ОФВ1, что значительно облегчает и удешевляет стоимость исследования. Способ может быть использован в качестве скрининга для прогноза прогрессирования ХОБЛ для оптимизации проводимого лечения. Применение способа облегчает проведение контрольного исследования значения растворимых молекул мембранного антигена CD8⁺ на фоне лечения, проведя только лишь повторное исследование ОФВ1, что позволяет также контролировать эффективность иммуномодулирующей терапии.

Технический результат достигается тем, что в известном способе прогноза прогрессирования хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), включающем измерение объема форсированного выдоха за 1 с (ОВФ1, %), определяют содержание растворимых молекул мембранного антигена CD8⁺ по формуле:

содержание растворимых молекул мембранного антигена CD8⁺=а+b*ОФВ1:

где а - константа, равная 231,94;

b - нестандартизованный коэффициент, равный 2,0012,

и при значении содержания растворимых молекул мембранного антигена CD8⁺ менее 351 определяют неблагоприятное прогрессирующее течение ХОБЛ.

Предлагаемое изобретение отвечает критерию «новизна», так как при проведении патентно-информационных исследований не выявлено источников, порочащих новизну предлагаемого способа.

Предлагаемое изобретение отвечает критерию «изобретательский уровень», так как в доступной научно-медицинской и патентно-технической литературе не выявлено технических решений с существенными признаками предлагаемого способа.

На сегодняшний день известно, что иммунокомпетентные клетки, участвующие в хроническом воспалении при ХОБЛ, несут на своей поверхности мембранные антигены, которые характеризуют направление их дифференцировки (Мейл Д. Иммунология: Пер. с англ. / - М.: Логосфера, 2007. - 568 с.). Дифференцировочные молекулы могут иметь растворимые формы, которые обнаруживаются в сыворотке крови, и с одной стороны отражают уровень мембранной экспрессии антигена, с другой - способны к модуляции иммунного ответа (Новиков В.В. Растворимые формы мембранных белков клеток иммунной системы / В.В. Новиков, А.В. Караулов, А.Ю. Барышников. - М: МИА, 2008. - 249 с.). CD8⁺ молекула присутствует на мембране цитотоксических Т-лимфоцитов и части натуральных киллеров. Этот антиген является ко-рецептором Т-клеточного рецептора и обеспечивает распознавание антигенов, презентируемых с участием молекул HLA I класса. С одной стороны, растворимый CD8⁺ продуцируется активированными цитотоксическими Т-клетками и служит маркером их активации. С другой, взаимодействуя с HLA I, sCD8⁺ тормозит цитотоксическое действие клеток, препятствует их активации и пролиферации, что позволяют считать растворимый CDS⁺ супрессором иммунного ответа (Meseguer, М.А. Microbiological diagnosis of bacterial lower respiratory tract infections / M.A. Meseguer [et al.] // Enferm Infecc Microbiol Clin. - 2008 (Aug-Sep.). - Vol. 26, N 7. - P. 430-6; Morgan, C.L. Soluble CD8 stabilizes the HLA class I molecule by promoting beta2M exchange: analysis in real-time / C.L. Morgan [et al] // Hum Immunol. - 1999 (May). - Vol. 60, N 5. - P. 442-9).

Проведенные гистопатологические исследования показывают увеличение содержания Т-лимфоцитов, особенно клеток CD8⁺ (цитотоксических) во всех отделах легких при ХОБЛ. В исследованиях отечественных авторов обнаружено нарастание CD8⁺ клеток в индуцированной мокроте больных ХОБЛ в прямой зависимости от тяжести заболевания.

В доступной литературе нами не найдено способов прогнозирования прогрессирования ХОБЛ, основанных на исследовании содержания растворимой молекулы мембранного антигена CD8⁺, полученного опосредованно, без проведения иммунологических исследований, на основании данных объема форсированного выдоха за 1 сек.

Имеются данные о тесных корреляциях между содержанием в сыворотке крови CD8⁺ и значением ОФВ1 (Пазыч С.А. Маркеры активации и гибель клеток индуцированной мокроты при бронхиальной астме и хронической обструктивной болезни легких: автореф. дис. … канд. мед. наук: 14.00.43 / Светлана Анатольевна Пазыч. - Владивосток, 2005.- 23 с.).

Способ осуществляют следующим образом.

При поступлении пациента в стационар после проведения стандартного клинического обследования больного проводят исследование ФВД с измерением объема форсированного выдоха за 1 с (ОФВ1, %). Далее определяют содержание растворимых молекул мембранного антигена CD8⁺ по формуле:

содержание растворимых молекул мембранного антигена CD8⁺=а+b*ОФВ1:

где а - константа, равная 231,94;

b - нестандартизованный коэффициент, равный 2,0012,

и при значении содержания растворимых молекул мембранного антигена CD8⁺ менее 351 определяют неблагоприятное прогрессирующее течение ХОБЛ

Технический результат предлагаемого изобретения подтвержден клиническими испытаниями: обследовано 50 больных ХОБЛ в стадии обострения в возрасте от 35 до 79 лет (средний возраст 60±10), из них 36 мужчин (72%) и 14 женщин (28%). Продолжительность болезни у обследованных больных составила от 1 года до 40 лет (15[7;20]), анамнез курения от 1 года до 66 лет. При обследовании был использован комплекс клинико-функциональных, лабораторных и инструментальных исследований. У пациента уточнялось длительность курения и частота обострения болезни за период 12 месяцев. При оценке сывороточного уровня растворимых дифференцировочных молекул клеток иммунной системы проводился забор крови из локтевой вены (утром натощак). Определение уровня растворимых форм мембранных молекул проводили с помощью иммуноферментных методов с использованием поликлональных антител, специфичных к мембранным антигенам мононуклеарных клеток крови человека, и моноклональных антител (МКА) серии ИКО. Концентрацию растворимых форм мембранных антигенов определяли с помощью прибора для иммуноферментного анализа СТАТ-ФАКС-2100 с длиной волны 450 и 630 нм, полученные данные выражали в условных единицах (U/ml). При оценке сывороточного уровня растворимых дифференцировочных молекул клеток иммунной системы образцы сыворотки крови больных сопоставлялись с результатами обследования контрольной группы, в которую вошли 30 здоровых доноров контрольная группа, лица без ХОБЛ, сопоставимых по полу и возрасту.

Исследование функции внешнего дыхания проводилось с использованием пневмотахометрического датчика, регистрирующего объемную скорость потока воздуха. Последующий автоматический компьютерный анализ инспираторной и экспираторной части петли поток-объем производился с использованием аппарата «Flow screen» (фирма «JAEGER», Германия). Должные величины рассчитывались автоматически с учетом пола, возраста, роста и веса каждого пациента. Оценивались следующие показатели: жизненная емкость легких (ЖЕЛ); объем форсированного выдоха за 1 секунду (ОФВ1); максимальный экспираторный поток на уровне 50% и 25% ФЖЕЛ (МОС 50 и МОС 25), отражающий проходимость на уровне средних и мелких бронхов. Показатели считали сниженными, если их значение было менее 80% от должной величины. Полученные результаты заносились в электронные таблицы «Excel».

Статистический анализ производился с помощью программы «STATISTICA 6.0». Характер распределения данных оценивался критериями Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилкса. В случае если распределение признака принималось приближенно нормальным, результаты представлялись в виде М±σ, где М - среднее; σ - среднее квадратическое отклонение, для анализа использовались параметрические критерии. При распределении результатов, отличном от нормального, данные предоставлялись в виде медианы и 25 и 75-перцентилей (Ме[25р;75р]), анализ проводился с помощью методов непараметрической статистики. Для оценки аналитической зависимости признаков (модели) использовался метод простого регрессионного анализа. За уровень статистической значимости принималась величина р<0,05. (Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA / О.Ю. Реброва. - М.: МедиаСфера, 2006. - 312 с.).

При исследовании функции внешнего дыхания у больных ХОБЛ выявлялась бронхиальная обструкция: умеренно выраженная при среднетяжелом и резко выраженная при тяжелом течении болезни (таблица 1).

При проведении исследования авторами предлагаемого изобретения было изучено содержание сывороточного содержания растворимой формы sCD8⁺ в зависимости от степени тяжести течения ХОБЛ, определенном с учетом «Глобальной» стратегия диагностики, лечения и профилактики хронической обструктивной болезни легких (пересмотр 2008 г.) / Пер. с англ. под ред. Белевского А.С. - М.: Издательский холдинг «Атмосфера», 2009. - 100 с. (таблица 2).

Как видно из таблицы 2, содержание тестируемых молекул на разных стадиях ХОБЛ между собой не различалось, однако были получены достоверные различия по сравнению с контрольной группой.

При более детальном анализе полученных данных у пациентов с ХОБЛ обнаружены колебания сывороточного уровня растворимых мембранных молекул: у 40% больных показатели были повышенными или имели тенденцию к повышению (1 подгруппа), у 60% (2 подгруппа) - достоверно снижены в сравнении с донорами (таблица 3).

Сниженный уровень растворимой молекулы мембранного антигена CD⁸ больных ХОБЛ 2 подгруппы может отражать уменьшение мембранной экспрессии этих молекул и угнетение цитотоксического звена иммунитета, тогда как пациенты 1 подгруппы имели тенденцию к повышению растворимой молекулы sCD8⁺, что свидетельствует об активации цитотоксических sCD8⁺ клеток у данной категории больных.

Была обнаружена прямая корреляционная связь между показателями бронхиальной проходимости (ОФВ1) и содержанием растворимых молекул мембранного антигена CD8⁺(r=0,57, р=0,03).

На основании простого линейного регрессионного анализа (программа statistica 6.0) нами был установлен не только факт взаимосвязи ОФВ1 и CD8⁺, но и выявлена аналитическая зависимость между ОФВ1 и уровнем растворимых молекул мембранного антигена CD8⁺. Аналитическое уравнение было представлено в виде:

растворимые молекулы мембранного антигена CD8⁺=a+b*ОФВ1 (в % от должных величин):

где CD8⁺ - уровень растворимой молекулы мембранного антигена CD8⁺;

а - константа, отражающая степень отклонения линии регрессии от начала координат (стандартная ошибка = 39,18, р=0,00001);

b - нестандартизованный коэффициент b (стандартная ошибка = 0,54, p=0,001), являющийся мерой связи между анализируемыми признаками и показывающий степень варьирования между средними значениями зависимого признака (sCD8⁺) с каждой единицей независимого признака (ОФВ1).

ОФВ1 - объем форсированного выдоха за 1 сек (% от должных величин)

а=231,94, b=2,0012

sCD8⁺=231,94+2,0012×ОФВ1%.

Стандартная ошибка оценки модели была равна 64,49 при р=0,002, что свидетельствовало об адекватности данной аналитической модели.

Полученная нами данные о взаимосвязи двух признаков позволяет на практике с учетом значения ОФВ1 определить уровень содержания уровень растворимой молекулы мембранного антигена sCD8⁺, сниженный уровень которого свидетельствует о нарастании тяжести и прогрессировании ХОБЛ.

Примеры конкретного исполнения даны в виде выписок из историй болезни.

Клинический пример 1: в пульмонологическое отделение больницы №10 направлен больной Т., 68 лет. Диагноз при поступлении: Хроническая обструктивная болезнь легких III степени, тяжелого течения, фенотоп с частыми обострениями, в фазе обострения, ДН II ст. ИБС: стабильная стенокардия II КФК, НК I. Гипертоническая болезнь III ст. степень АГ 2 риск 4. При поступлении жалобы на одышку при незначительной нагрузке и в покое, кашель с трудноотделяемой мокротой желто-зеленого цвета, повышение температуры до 38.0°С. Из анамнеза известно, что болеет хроническим бронхитом около 30 лет. Индекс курения 40 пачек/лет. Стационарное лечение по поводу обострений 2 раза в год.

Амбулаторно получает «Серитид» 250/25 мкг в 1 вдохе - 2 инг. 2 раза в сутки, «Спирива» 18 мкг 1 инг. сутки, «Беродуал» - по потребности, теопек 300 мг 2 раза в сутки, веропамил в дозе 80 мг 3 раза в сутки. Ухудшение состояния около 10 дней, в связи с неэффективностью амбулаторного лечения направлен в стационар. Объективно: состояние больного средней степени тяжести, правильного телосложения, повышенного питания, цианоз губ, лица, бочкообразная грудная клетка, перкуторный звук коробочный, в легких по всем полям большие количество сухих хрипов, ЧД 25 в мин. Тоны сердца приглушенные, ритмичные ЧСС - 98 уд. в мин, АД 150/90 мм рт.ст. Живот мягкий, безболезненный. Отеков нет.

OAK, ОАМ без особенностей.

Общий анализ мокроты - лейкоциты 25-60 в п/з; на рентгенограмме органов грудной клетки без очаговых и инфильтративных изменений. При микробиологическом анализе мокроты выделены 2 культуры микроорганизмов: М. catharralis 3×10² КОЕ/мл, Н. influenzae 2×10⁶ КОЕ/мл.

ЭКГ: отклонение ЭОС влево, синусовая тахикардия 96 уд. в мин, очаговая блокада ПНПГ, нарушение процессов реполяризации миокарда. При исследовании ФВД: ЖЕЛ - 55,2%, ФЖЕЛ - 77,3%, ОФВ1 - 37,6% от должного.

С учетом данных ФВД с целью оценки прогноза прогрессирования ХОБЛ проведена оценка иммунного статуса Для этого определили содержание растворимых молекул мембранного антигена CD8⁺ по предложенной формуле sCD8⁺=231,94+2,0012×37,6%, CD8⁺=306,54, что ниже, чем 351, что свидетельствовало об истощении пула цитотоксических клеток, прогрессирующем неблагоприятном течении ХОБЛ, необходимости включения иммуномодулирующей терапии.

На фоне проведенного лечения отмечалась положительная динамика, уменьшилась одышка, кашель, количество отделяемой мокроты, нормализовалась температура. Объективно: в легких сухие рассеянные хрипы по всем легочным полям ЧД 20 в мин. ЧСС - 90 уд. в мин, АД - 140/90 мм рт ст. При контрольном исследовании ОФВ1 увеличился до 48%, также наблюдалось увеличение sCD8⁺=327.

При выписке пациенту наряду со стандартной бронхолитической и противовоспалительной терапией рекомендован прием иммуномодулирующих препаратов.

Клинический пример 2: в пульмонологическое отделение больницы №10 направлен больной С., 72 г. Диагноз при поступлении: Хроническая обструктивная болезнь легких II степени, среднетяжелого течения, в фазе обострения, ДН II ст. ИБС: стабильная стенокардия II КФК, НК I. При поступлении: жалобы на усиление кашля с мокротой, одышку при физической нагрузке. Из анамнеза известно, что болеет хроническим бронхитом около 20 лет. Индекс курения 20 пачек/лет. Обострения не чаще 1 раза в год, последнее обострение - 2 года назад (лечился стационарно).

Амбулаторно эпизодически принимает флуимуцил (при усилении кашля), при затруднении дыхания - «Беродуал» - до 2-3 ингаляций в сутки. Ухудшение состояния около 1 месяца; в связи с неэффективностью амбулаторного лечения направлен в стационар. Объективно: состояние больного средней степени тяжести, правильного телосложения, умеренного питания, перкуторный звук над легкими коробочный, в легких умеренное количество сухих рассеянных хрипов, ЧД 21 в мин. Тоны сердца приглушенные, ритмичные ЧСС - 72 уд. в мин, единичные экстрасистолы АД 130/90 мм рт.ст. Живот мягкий, безболезненный. Отеков нет.

ОАК, ОАМ без особенностей

Общий анализ мокроты - лейкоциты 20-30 в п/з; на рентгенограмме органов грудной клетки без очаговых и инфильтративных изменений. При микробиологическом анализе мокроты выделены 1 культура микроорганизмов: М. catharralis 5×10² КОЕ.

ЭКГ: ЭОС в норме, ритм синусовый 96 уд. в мин.

ФВД: ЖЕЛ-70%, ОФВ1 - 65,3% от должного.

С учетом данных ФВД определили содержание растворимых молекул мембранного антигена sCD8⁺ - sCD8⁺=231,94+2,0012×65,3%, sCD8⁺=362,6, что свидетельствовало об относительно благоприятном течении ХОБЛ.

На фоне проведенного лечения отмечалась положительная динамика, уменьшилась одышка, кашель. При контрольном исследовании ОФВ 1 увеличился до 69,2%, также наблюдалось увеличение sCD8⁺=370,4.

При выписке пациенту наряду со стандартной бронхолитической и противовоспалительной терапией рекомендован прием иммуномодулирующих препаратов.