Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ ГРИБА Lecanicillium muscarium, ОБЛАДАЮЩИЙ ИНСЕКТОАКАРИЦИДНОЙ И АНТИБИОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ДЛЯ БОРЬБЫ ПРОТИВ СОСУЩИХ ВРЕДИТЕЛЕЙ, ГРИБНЫХ И БАКТЕРИАЛЬНЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности к области защиты растений от вредителей и болезней. Может быть использовано для получения грибного препарата, обладающего инсектоакарицидной активностью против сосущих вредителей из отрядов Homoptera: оранжерейная белокрылка, тли, трипсы и Acariformes - паутинные клещи, а также антибиотической активностью против комплекса фитопатогенных грибов и бактерий. Известно, что наиболее опасными и распространенными вредителями в теплицах и оранжереях является комплекс сосущих насекомых (оранжерейная белокрылка, тли, трипсы) и паутинные клещи. Потери урожая овощных культур от вредителей составляют до 30%. Потери урожая от фузариозов могут достигать 40%, а от бактериальных гнилей от 15% до 70% [1]. Применяемые в теплицах биопрепараты на основе различных штаммов энтомопатогенного гриба Verticillium lecanii (современное название Lecanicillium muscarium (Petch) Zare et W. Gams) недостаточно эффективны из-за узкой специализации используемых штаммов и высокой устойчивости отдельных фаз сосущих вредителей, в частности оранжерейной белокрылки в стадии яиц, отсутствии защитного эффекта от болезней.

Известен штамм гриба Verticillium lecanii РУ-1 - продуцент препарата, эффективного против личинок оранжерейной белокрылки [2] и энтомопатогенный биопрепарат для защиты растений от вредителей на основе гриба Lecanicillium muscarium штамм Р-81 [3]. Известны также смеси штаммов Verticillium lecanii, эффективные против белокрылок, тлей и трипсов: штамм Verticillium lecanii, В-2, и штаммы Verticillium lecanii IMI 179172 или Verticillium lecanii IMI 268317 [4]. Недостатками известных штаммов является узкий спектр инсектицидной активности, ограниченный насекомыми из отряда Homoptera.

Известен также штамм V-5 Lecanicillium muscarium, проявляющий инсектоакарицидную активность против насекомых из различных отрядов и растительноядных клещей [5]. Недостатком этого штамма является его селективная эффективность в отношении табачной белокрылки Bemisia tabaci - вредителя, распространенного преимущественно в субтропических регионах, в то время как в отечественных хозяйствах наиболее распространенным видом является оранжерейная белокрылка Trialeurodes vaporariorum. Известен также штамм гриба Verticillium lecanii F-8, используемый для получения акарицидного и энтомопатогенного препарата [6]. Недостатками данного штамма является невысокая инсектицидная активность против клещей, длительный период ожидания защитного эффекта, а также отсутствие активности против западного цветочного трипса и яиц оранжерейной белокрылки. Не отмечена антибиотическая активность этого штамма против грибов и бактерий - возбудителей болезней растений. В то же время известно, что энтомопатогенный гриб вида Lecanicillium muscarium может проявлять антибиотические свойства [7]. Известны также штаммы этого вида (A1, B2, C2) с инсектицидной активностью, подавляющие развитие грибных болезней растений [8]. Недостатками этих штаммов является узконаправленное проявление фунгицидных свойств в отношении отдельных видов возбудителей болезней растений, отсутствие антибактериальной и акарицидной активности.

Таким образом, не найден ни один из известных аналогов, обладающий комплексной активностью к указанным вредителям и болезням. Штамм гриба Verticillium lecanii F-8, используемый для получения акарицидного и энтомопатогенного препарата [6], принят за прототип.

Задача изобретения - получить штамм энтомопатогенного гриба Lecanicillium muscarium, обладающий комплексной инсектоакарицидной и антибиотической активностью для борьбы против сосущих вредителей, фитопатогенных грибных и бактериальных болезней.

Задача решена путем получения штамма МП-4 Lecanicillium muscarium, который был изолирован из больных особей природной популяции жимолостной белокрылки Aleurodes lonicerae, с дальнейшим многократным пассированием его через восприимчивого хозяина, оранжерейную белокрылку Trialeurodes vaporariorum. Отбор шел по вирулентности штамма в отношении к оранжерейной белокрылке. В результате получен штамм с комплексной инсектоакарицидной и антибиотической активностью для борьбы против сосущих вредителей, фитопатогенных грибных и бактериальных болезней. Штамм проявляет высокую патогенность против паутинного клеща, белокрылки и ее яиц, тлей разных видов, западного цветочного трипса и других сосущих насекомых. Преимуществом штамма является также высокая антибиотическая активность против фитопатогенных грибов и бактерий. Штамм гриба-микромицета Lecanicillium muscarium МП-4 депонирован в ВИЗРе под регистрационным номером Г-033 ВИЗР.

Штамм Lecanicillium muscarium Г-033 ВИЗР характеризуется следующими морфолого-культуральными признаками при выращивании при 25°C на агаризованных средах Сабуро и Чапека: колония округлая с ровными четкими краями с выпуклым центром без радиальной складчатости и зональности, белая, пушистая. Воздушный мицелий хорошо развит, пушистый, белого цвета. На среде Чапека диаметр колоний 14 мм (на 7 сутки), титр конидий 6,8×10⁷ (на 14 сутки). Конидиеносцы мутовчато-разветвленные с 1-2 фиалидами. Фиалиды удлиненные, у основания расширены, несут по 1-2 конидии. Конидии одноклеточные, удлиненно-цилиндрические с закругленными концами. Размер конидий 3,48±0,15×1,56±0,05 мкм. Видовая принадлежность штамма определена согласно современной систематике, основанной на морфологических признаках и результатах молекулярного анализа [9].

Физиолого-биохимические показатели:

Из источников углерода штамм хорошо усваивает глюкозу, сахарозу, крахмал, растет на лактозе, рамнозе, арабинозе, глицерине. В качестве источника азота утилизирует нитраты, аммонийный азот, пептон, дрожжевой экстракт, сою, БВК.

Штамм растет при температуре 20-30°C, pH среды 5-7,5, оптимальная температура 24-28°C, pH 6,5. Споры штамма обладают устойчивостью к высушиванию, что позволяет использовать его при промышленном получении биопрепарата в виде спорового порошка.

Штамм Г-033 ВИЗР не патогенен для человека и теплокровных животных, рыб и пчел.

Не является генетически модифицированным штаммом.

Заявляемые свойства: инсектоакарицидная активность против представителей отрядов Homoptera, Thysanoptera, Acariformes, антибиотическая активность против фитопатогенных грибов и бактерий.

Хранение штамма: штамм хранят в криопробирках после замораживания спорово-конидиальной суспензии в 20%-ном глицерине при -80 C и на скошенной агаризованной среде Чапека в пробирках при +4° C.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1-2 иллюстрируют культивирование штамма Г-033 ВИЗР на искусственных питательных средах, примеры 3-9 иллюстрируют инсектицидную активность споровых суспензий, полученных на основе заявляемого штамма в сравнении со штаммом-прототипом гриба Verticillium lecanii F-8 [6].

Пример 1. Культивирование штамма Г-033 ВИЗР на твердых питательных средах.

Штамм Г-033 ВИЗР выращивали в чашках Петри газоном в течение 10 суток при 27-28°C на агаризованной среде Чапека с дрожжевым экстрактом следующего состава: KCl - 0,5 г; KH₂PO₄ - 1,0 г; MgSO₄ - 0,5 г; NaNO₃ - 2,0 г; сахароза - 20,0 г; дрожжевой экстракт - 10 г; агар - 20 г; вода - до 1 л.

Пример 2. Культивирование штамма Г-033 ВИЗР на жидких питательных средах

Штамм Г-033 ВИЗР выращивали в колбах (100 мл на качалке в течение 4-х суток при 28°C на среде следующего состава: KH₂PO₄ - 2,0 г; MgSO₄ - 1,0 г; пептон - 10,0 г; глюкоза - 20,0 г; H₂O - до 1 л. Полученную биомассу гриба отделяли от культуральной жидкости фильтрованием через бумажный фильтр «Красная лента», промывали дистиллированной водой от остатков питательной среды и высушивали при температуре 35°C в сушильном шкафу с вентиляцией. Культуральную жидкость дополнительно отделяли от спор центрифугированием 2000 об/мин 2 мин. использовали для определения антибиотической активности методом лунок. Из сухой биомассы получали экстракты и наносили их бумажные диски для определения антибиотической активности.

Пример 3. Конидии, полученные в результате культивирования заявляемого штамма, описанного в примере 1, смывали водой и определяли титр в камере Горяева. Споровую суспензию доводили до необходимой концентрации и определяли инсектицидную активность на клещах. Срезанные двухлистковые растения фасоли за сутки заселяли самками клеща. Обработку проводили путем погружения листьев фасоли, зараженных подвижными стадиями клеща, в споровую суспензию с различной концентрацией спор на 6 сек (табл. 1).

Результаты гибели тест-объектов на 3, 5, 7 сутки приведены в табл. 1.

Как следует из результатов, представленных в табл. 1, заявляемый штамм Г-033 ВИЗР по акарицидной активности превосходит прототип. Так, при использовании более низкой концентрации заявляемого штамма (1×10⁶ спор/мл): смертность клещей была выше более чем в 2 раза на 3-й сутки; на 34,4% на 5-е сутки и на 29,6% на 7-е сутки. При концентрации 1×10⁷ спор/мл более высокая активность заявляемого штамма установлена на 7-е сутки после обработки: смертность была выше на 24,5%.

Пример 4. Споровую суспензию получали, как описано в примере 1. Инсектицидную активность штамма Г-033 ВИЗР на оранжерейной белокрылке проверяли путем опрыскивания растений фасоли, зараженных личинками (2-3 возраст) и яйцами оранжерейной белокрылки (табл. 2, 3) по методике [10].

Инсектицидная активность заявляемого штамма сопоставима со штаммом F-8 в отношении личинок оранжерейной белокрылки. При этом 100%-ная смертность вредителя достигается также на 6-е сутки, но при применении заявляемого штамма в концентрации спор, в два раза меньшей (5×10⁶ спор/мл), чем у штамма F-8 (1×10⁷ спор/мл).

Установлена высокая инсектицидная активность заявляемого штамма в отношении яиц оранжерейной белокрылки при использовании относительно низких концентраций (табл. 3). Это особенно важно в производственных условиях, где присутствуют все стадии вредителя.

Пример 5. Споровую суспензию получали, как описано в примере 1. Инсектицидную активность штамма Г-033 ВИЗР в отношении персиковой и виковой тлей проверяли путем опрыскивания проростков фасоли, зараженных личинками тлей 2-3 возраста по методике [9]. Результаты приведены в табл. 4, 5.

Пример 6. Споровую суспензию получали, как описано в примере 1. Инсектицидную активность штамма Г-033 ВИЗР в отношении злаковой тли проверяли путем опрыскивания проростков пшеницы, зараженных личинками 2-3 возраста.

Пример 7. Споровую суспензию получали, как описано в примере 1. Инсектицидную активность штамма Г-033 ВИЗР в отношении западного цветочного трипса проверяли путем опрыскивания листьев фасоли споровой суспензией в концентрации 5×10⁷ спор/мл, предварительно зараженных проростков пшеницы трипсом (имаго и старшие возраста). Патогенность штамма МП-4 в отношении западного цветочного трипса (имаго и старшие возраста).

Инсектицидная активность заявляемого штамма в отношении западного цветочного трипса выше на 13% по сравнению с активностью штамма V-5, рассматриваемого в качестве аналога [4].

Пример 8. Антибиотические свойства штамма Г-033 ВИЗР

Антибиотическая активность штамма Г-033 ВИЗР установлена при тестировании культуральной жидкости и экстрактов из биомассы гриба, полученных в результате культивирования штамма Г-033 ВИЗР на жидкой питательной среде (также как в примере 2), в отношении гриба Alt. solani и в отношении бактерии Bac. subtilis. Антибактериальную активность определяли методом радиальной диффузии [11, с. 159-160]. Культуральную жидкость 50 мкл помещали в лунки диаметром 1 см на чашки Петри, предварительно засеянные тест-культурами на среде СПА для бактерий или на среде Чапека для грибов. Экстракт наносили на фильтровальные диски диаметром 0,6 мм, которые также помещали на поверхность чашек Петри с тест-культурами. Учет зоны подавления роста тест-культур проводили на 3-й сутки после инкубирования при 25°C. В результате было установлено, что культуральная жидкость заявляемого штамма обладает антибиотической активностью: зона подавления роста Alt. solani составила 6 мм (за вычетом диаметра диска). Зона подавления роста Bac. subtilis на 3 сутки составила 2,5 мм. Экстракт показал антибиотическую активность 2,5 мм в отношении Bac. subtilis.

Пример 9. Антагонистическая активность заявляемого штамма выявлена при совместном культивировании штамма Г-033 ВИЗР и фитопатогенных грибов и бактерий методом агаровых блоков [11, с. 156-158]. Штамм Г-033 ВИЗР выращивали, как описано в примере 1, но длительность культивирования составляла 7 суток. Одновременно выращивали тест-культуры. Фитопатогенные грибы выращивали на среде КГА в течение 7 суток, бактерии выращивали на среде СПА в течение 3 суток при 25°C. Споровую суспензию тест-культур грибов и бактерий, полученных смывом, рассевали газоном в чашки Петри со средой КГА. Затем вносили агаровые блоки со штаммом Г-033 ВИЗР (по 3 блока на чашку) в предварительно сделанные лунки диаметром 1 см. Зону подавления роста тест-культур вокруг штамма Г-033 ВИЗР определяли в мм на 3 сутки роста при 25°С (табл. 8).

Как следует из полученных данных, заявляемый штамм обладает высокой фунгицидной активностью против широкого спектра возбудителей грибных болезней растений, прежде всего против различных гнилей и фузариозов, а также против бактерий Clavibacter michiganensis - возбудителя бактериального рака томата и кольцевой гнили картофеля и Pseudomonas syringae pv. maculicola - возбудителя бактериальной пятнистости капусты.

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о высокой эффективности гриба Lecanicillium muscarium штамма Г-033 ВИЗР, позволяющей применять его против комплекса вредных организмов: паутинного клеща, сосущих насекомых - оранжерейной белокрылки, тлей разных видов, западного цветочного трипса, а также для защиты от болезней, вызываемых фитопатогенными грибами и бактериями. В то время как другие известные штаммы этого вида гриба могут применяться только для защиты от ограниченного набора вредителей или от отдельных видов фитопатогенных грибов - возбудителей болезней растений. Это позволяет применять один штамм Lecanicillium muscarium Г-033 ВИЗР против комплекса сосущих вредителей, грибных и бактериальных болезней, повысив и ускорив смертность сосущих вредителей и клещей, снизить заболеваемость растений, вызываемую фитопатогенными бактериями и грибами. Для предлагаемого штамма Г-033 ВИЗР гриба Lecanicillium muscarium установлена высокая инсектицидная активность против оранжерейной белокрылки и ее яиц, сопоставимая с активностью штамма-прототипа: 94,4-100% и 98,7-100%, соответственно, в концентрации (2,5-5)×10⁶ спор/мл, и многократно превосходящая прототип акарицидная активность в отношении паутинного клеща: 78,2-91% в концентрации (1-5)×10⁷ спор/мл. Антибиотическая активность штамма Г-033 ВИЗР установлена против 9 видов фитопатогенных грибов и 2 видов фитопатогенных бактерий.

Источники информации

1. Будынков Н.И. Защита растений в теплицах. 2009. http://www.greenhouses.ru/Zawita-rastenij-v-teplicah.

2. Патент РФ RU 93028452/13, дата приоритета. 21.06.1993. Опубликовано: 10.05.1995. Третьяков А.П., Щербаков Г.Я., Стирманова Н.И. Штамм микромицета Verticillium lecanii для производства инсектицидного препарата.

3. Патент РФ RU 2487542, дата приоритета 21.10.2011. Опубликовано: 20.07.2013 Бюл. №20 С. 1-12. Митина Г.В., Сокорнова С.В., Павлюшин В.А. (2013). Энтомопатогенный биопрепарат для защиты растений от вредителей и способ его получения.

4. JP 2008061530 (A). 2008-03-21. Insect-pathogenic microorganism and method for controlling harmful organism by using the same.

5. US 8535932 B2. Lecanicillium muscarium strain V-5, pest extermination method using the same, and microorganism pesticide comprising the same.

6. Патент №2120756, 27.10.1998. Андреева И.В., Штерншис M.B., Степанова Е.В., Репин В.Е. Штамм гриба Verticillium lecanii для получения акарицидного и энтомопатогенного препарата.

7. Чоглокова А.А., Первушин А. Л., Митина Г.В. Антибиотическая активность и связь с морфолого-культуральными характеристиками природных изолятов грибов рода Lecanicillium // Современная микология в России. Т. 4. С. 312-314.

8. EP 1774854 A1. 28.04.2004. Microbial pesticide inhibiting the outbreak of plant disease damage.

9. Zare R., Gams W. A revision of Verticillium sect. Prostrata. IV. The genera Lecanicillium and Simplicillium gen. nov. // Nova Hedwigia. 2001. Vol. 73. P. 1-50.

10. Митина Г.В., Сергеев Г.Е., Павлюшин В.А. Влияние биохимических и морфолого-культуральных особенностей природных изолятов Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas на вирулентность в отношении личинок оранжерейной белокрылки // Микол. и фитопатол. 1997. Т. 31, вып. 1. С. 57-64.

11. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. 6-е изд., М.: МГУ, Наука, 2004. 528