СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ НЕАЛКОГОЛЬНОГО СТЕАТОГЕПАТИТА У КРЫС

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине и экспериментальной биологии и ветеринарии, может быть использовано для моделирования неалкогольного стеатогепатита у крыс.

Для моделирования неалкогольного стеатогепатита в течение 90 дней ежесуточно с кормом животным вводят 5,0 г топленого говяжьего сала и тетрациклин внутримышечно из расчета в дозе 100 мг/кг. Способ обеспечивает адекватное воспроизведение модели. Предложенная модель проста в исполнении, отличается хорошей воспроизводимостью, отсутствием летального исхода у экспериментальных животных и комплексностью формирования нарушений в печени и организме в целом, вызванных нарушениями метаболизма, характерных для неалкогольного стеатогепатита.

Уровень техники

Экспериментальные модели жировой болезни печени используются для изучения механизмов формирования, выяснения роли различных факторов внешней и внутренней среды в становлении патологических процессов, а также позволяют детально изучить патогенез и изыскать средства для рациональной терапии и профилактики.

Изучение патогенетических аспектов заболеваний печени, как правило, осуществляется с использованием экспериментальных моделей глубоких структурно-функциональных изменений ткани органа, сходных с таковыми у человека, но формирующимися за более короткий период времени. Однако в каждой из известных моделей гепатита, цирроза печени, жирового гепатоза и др. заболеваний печени за основу зачастую берется токсический фактор инициации повреждения печени, или же моделирование того или иного патологического состояния печени протекает в течение длительного времени [5, 6, 7].

Известен способ создания модели токсического гепатита и цирроза печени у грызунов, включающий помещение животного в клетку с открытым резервуаром, наполненным 70%-ным раствором формалина. В этих условиях лабораторных животных содержат в течение 5-7 месяцев [5]. К недостаткам данного способа можно отнести длительный период моделирования и побочные эффекты токсических доз формалина на дыхательную, сердечно-сосудистую и выделительную системы, способствующие летальному исходу экспериментальных животных.

Известен способ моделирования токсической гепатопатии путем введения химических веществ лабораторному животному, когда в желудок животного однократно вводят 50%-ный раствор совтола-1 на оливковом масле из расчета 150 мг на 100 г массы тела [6].

Известен способ моделирования цирроза печени путем введения химических веществ лабораторному животному, согласно которому в желудок вводят два раза в неделю в течение месяца 50%-ный раствор совтола-1 на оливковом масле из расчета 0,25 мл на 100 г массы тела и 10%-ный раствор этанола вместо воды для питья [7].

Перечисленные выше способы моделирования токсической гепатопатии, жировой дистрофии и цирроза печени способствуют развитию органического поражения печени. Однако недостатком этих способов является то, что способы имеют сугубо специфические пусковые механизмы развития патологий и патологических состояний печени, которые отличаются от реальных причин, способствующих патогенезу этого органа у людей. Кроме того, описанные методы требуют длительного времени.

У людей же основными инициаторами неинфекционных заболеваний печени являются неправильное питание, злоупотребление алкоголем, а также последствия применения лекарственных препаратов [1-5]. Следовательно, существуют трудности в экстраполяции экспериментальных данных по изучению механизмов развития патологии печени на человека. В связи с этим для изучения механизмов формирования заболеваний печени, разработки новых подходов в профилактике и лечения с применением современных достижений науки и техники исследователям требуются экспериментальные модели, наиболее приближенные к реальным условиям.

Проведенные патентные исследования и анализ научной медицинской литературы показал, что конкретных рекомендаций по моделированию неалкогольного стеатогепатита (НАСГ) и цирроза печени, характерных для реальных условий развития данных заболеваний у людей, не существует.

Известен способ формирования алиментарной гиперлипидемии гиперхолестериновым рационом по J. Fan. Согласно этому способу экспериментальных крыс содержат в течение 12 недель на гиперхолестериновом рационе. В результате у крыс происходит отложение избытка жира в печени и формируется стеатоз [12]. Недостатками описанного способа являются низкая вероятность развития глубоких структурных повреждений печени, способствующих формированию стеатогепатита и фиброза.

Наиболее близким техническим решением, принятым за прототип, является способ моделирования неалкогольного стеатогепатита у крыс, путем скармливания экспериментальным животным гепатопатогенного корма, согласно изобретению в течение 6 месяцев ежесуточно с кормом животным вводят 4,25 г топленого говяжьего сала и 0,43 г порошкового холестерина из расчета на 100 г массы тела [8].

При этом по истечении 30 суток от начала вскармливания у животных диагностируется сформировавшийся стеатоз печени, по истечении 90 суток диагностируют явно выраженный стеатогепатит, а по истечении 180 суток от начала вскармливания определяют сформировавшийся фиброз печени.

Учитывая возможность развития жировой болезни печени при несбалансированном гиперкалорийном питании, а также при воздействии лекарственных препаратов, представляет интерес разработка способа моделирования неалкогольного стеатогепатита путем воздействия на экспериментальных животных гиперкалорийным гепатогенным рационом при одновременном воздействии гепатогенным фармакологическим фактором.

Раскрытие изобретения

Задача изобретения состоит в том, чтобы создать более простой и более быстрый способ моделирования неалкогольного стеатогепатита у крыс с повышенной воспроизводимостью и высоким приближением к клиническому течению заболевания печени, воздействуя на животных алиментарными и фармакологическими патогенетическими факторами, способствующими формированию метаболической дисфункции и структурной реорганизации печени, наиболее точно отражающей патогенетические механизмы развития заболеваний печени у людей, с минимальной смертностью животных.

Общими с прототипами признаками являются следующие:

- скармливание экспериментальным животным гепатопатогенного корма (4,25 г топленого говяжьего сала и 0,43 г порошкового холестерина из расчета на 100 г массы тела).

Отличительными признаками являются следующие:

- в течение 90 дней ежесуточно с кормом животным вводят 5,0 г топленого говяжьего сала, а также 100 мг/кг тетрациклина внутримышечно, начиная с 60-х суток моделирования 10 дней.

При использовании изобретения оказывается гепатотропное воздействие животным жиром в виде топленого говяжьего сала (до 20% от общего состава рациона), увеличивается срок воздействия алиментарной гиперкалорийной нагрузки, обеспечивается дополнительная неалкогольная гепатотропная нагрузка на печень, отмечается стабильная прибавка в весе у крыс в течение всего периода эксперимента. Помимо структурной реорганизации печени предложенный способ моделирования НАСГ сопровождается рядом метаболических нарушений, являющимися основополагающими патогенетическими факторами, индуцирующими заболевания печени. За 70-90 суток формируется стеатогепатит, переходящий в фиброз печени. Изобретение дает возможность изучения стадийности формирования неалкогольной жировой болезни печени.

Проведенные анализ научной медицинской литературы и патентные исследования, отражающие современную методологию создания экспериментальных моделей жировой болезни печени с характерными метаболическими нарушениями, не выявили технологий моделирования НАСГ на экспериментальных животных, содержащих всю совокупность существенных признаков заявляемого изобретения. Таким образом, заявленное техническое решение соответствует требуемому критерию «новизна».

Заявляемое изобретение может быть использовано в экспериментальной медицине и биологии согласно своему назначению, и на этом основании оно соответствует критерию «промышленная применимость».

Предложенное решение является непростой модификацией известных способов. Оно дает высокий результат и 100%-ную воспроизводимость у подопытных крыс. Предлагаемый способ моделирования НАСГ не сложен в техническом воспроизведении и создает условия для проведения оригинальных имеющих практическое значение для медицины и биологии исследований, посвященных выяснению патогенеза и течения жировой болезни печени и причин, способствующих запуску процессов фиброгенеза и развития цирроза. Изобретение дает возможность проследить все стадии развития поражения печени вплоть до цирроза. Это позволяет заключить, что заявляемый способ соответствует критерию «изобретательский уровень».

Для создания модели неалкогольного стеатогепатита использовались белые крысы линии «Вистар». Для воспроизведения экспериментальной модели использованы 6-месячные особи мужского пола, средней массой 240,0±10,6 г. При разработке модели отрабатывалось воспроизведение нескольких аналогичных экспериментальных состояний, все варианты модификаций воспроизводимых моделей анализировались на основании гистологических исследований ткани печени. Отобраны были те модели, при воспроизведении которых достигались стойкие структурные нарушения печени, сопровождающиеся жировой инфильтрацией, образованием некроза печени, при отсутствии смертности экспериментальных животных.

Способ моделирования неалкогольного стеатогепатита осуществляют следующим образом. Животные в течение 90 суток находятся на специальной гиперкалорийной гепатогенной диете, насыщенной животными жирами (табл. 1), затем получают с 60-го дня исследования инъекции тетрациклина в бедренную мышцу внутримышечно из расчета в дозе 100 мг/кг в дозе 10 дней подряд.

Среди патогенететических факторов основной являлась жировая нагрузка топленым говяжьим салом, составляющая порядка 20% от общего состава рациона, увеличивающая общую калорийность диеты, а также применение тетрациклина в дозе 100 мг/кг в течение 10 дней, начиная с 60-го, также обладающего выраженным гепатотропным эффектом.

Для обоснования заявленного изобретения в лаборатории экспериментальной биологии и биотехнологии Московского государственного областного университета (г. Москва) были проведены экспериментальные работы на крысах линии Вистар.

В эксперименте участвовало 100 крыс-самцов линии Вистар, разделенных на 3 группы:

- контрольная группа - интактные крысы, содержащиеся на стандартном рационе вивария (n=20);

- I опытная группа 1 - крысы, содержащиеся на экспериментальном гиперкалорийном рационе в течение 60 суток (n=40);

- II опытная группа 2 - крысы, содержащиеся на экспериментальном гиперкалорийном рационе в течение 90 суток, получившие с 60-го дня исследования инъекции тетрациклина внутримышечно в бедренную мышцу в дозе 100 мг/кг 10 дней подряд (n=40).

Животные ежедневно осматривались, учитывалась поедаемость корма. За время опыта не было случаев падежа и заболеваний животных. Эвтаназию животных осуществляли путем декапитации под эфирным наркозом в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных 86/609 EEC [11].

Оценивались биометрические показатели: вес крысы, индекс Кетле, относительная и абсолютная масса печени. Уровень липидов, глюкозы и активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в сыворотке крови исследовали с помощью биохимического анализатора StatFax3300 (США) с помощью наборов фирмы «Spinreact», (Испания).

Для проведения гистологического исследования ткани печени небольшие фрагменты центральной части правой доли органа фиксировались в 10%-ном растворе нейтрального формалина. Обезвоживание тканей проводили в этиловом спирте возрастающей концентрации и заливали в парафин. Далее с помощью микротома (МЗП-01 «ТЕХНОМ») готовили срезы исследуемых органов толщиной 4 мкм. Для гистологических исследований срезы тканей печени окрашивали гематоксилин-эозином, пикрофуксином по Ван-Ги-зону на выявление коллагеновых волокон [9]. Препараты исследовали при помощи комплекса визуализации на базе микроскопа фирмы «Nicon Eclipse» (Япония) (ув. об. ×10, ×40 и ×100).

Данные, полученные в результате исследований, приведены таблицах.

Весоростовые параметры крыс с представлены в таблице 2. У всех крыс опытных групп по сравнению с группой интактных животных выявлено увеличение массы тела, индекса Кетле, абсолютной и относительной массы печени.

Формирование НАСГ сопровождалось развитием гипергликемии, доказательством чего явилось повышение уровня глюкозы в крови во всех опытных группах крыс.

Морфофункциональное состояние печени крыс опытных групп оценивали по активности в сыворотке крови ферментов - АЛТ, ACT, ЛДГ (табл. 3). У животных, содержавшихся на экспериментальном рационе, наблюдалось повышение активности ферментов печени, что свидетельствовало о повреждении целостности гепатоцитов, развитии цитолитического синдрома. Понижение коэффициента де Ритиса к концу эксперимента свидетельствует о хроническом течении патологического процесса (табл. 3). Все отмеченные изменения свидетельствуют о формировании заболеваний печени.

Динамику формирования метаболических нарушений и гистологическое строение ткани печени оценивали на 60-е и 90-е сутки воздействия на крыс экспериментальным рационом. Доказательством развития модели неалкогольного стеатогепатита у животных служило исследование гистологических срезов ткани печени, окрашенных гематоксилин-эозином и пикрофуксином по Ван-Гизону на выявление соединительной ткани.

Через 60 суток у крыс, находящихся на экспериментальном рационе, в печени развивался стеатоз, характеризующийся фокальными участками некроза с лимфомакрофагальными элементами, а также жировой дистрофией клеток печени. Отмечены многочисленные участки печени со смешанным типом стеатоза, одиночными некротизированными гепатоцитами и очагами микронекроза.

На 90 сутки воздействия на крыс гепатогенным рационом и тетрациклином гистоструктура печени подверглась значительным изменениям, выразившимся в увеличении площади некротизированных участков (14-17% от общей площади исследуемых участков органа), окруженных лимфомакрофагальным инфильтратом, нарушении балочного строения долек печени. Трабекулярность печени не выражена, гепатоциты располагались беспорядочно, синусоиды не прослеживались. Было отмечено расширение крупных портальных трактов за счет разрастания стромы и заполнения ее воспалительным инфильтратом. Некоторые портальные тракты были с некротическими изменениями сосудов. Стенки таких сосудов слабо различались, в некоторых случаях были нарушены. Выявлялась деструкция желчных протоков, сопровождаемая большими очагами воспалительного инфильтрата.

На препаратах, окрашенных по Ван-Гизону, в препортальной зоне четко обнаруживались коллагеновые волокна, что является доказательством сформировавшегося фиброза печени.

Таким образом, удалось получить модель неалкогольного стеатогепатита, характеризующуюся ожирением, нарушением структурной организации, некрозом ткани, формированием фиброза печени. Разработанная модель неалкогольного стеатогепатита позволяет также изучать стадийность развития жировой болезни печени, характеризующейся формированием стеатогепатита и фиброза. Результаты исследования свидетельствуют о несомненной привлекательности использования данной модели. Предлагаемая модель НАСГ может быть использована в области хронических экспериментов для оценки степени нарушения функционального состояния гепатобилиарной системы и поиска эффективных фармакотерапевтических гепатопротекторных средств.

Кроме того, предлагаемая модель проводится при отсутствии смертности животных, а также используется наиболее доступный биологический вид - крысы, что является важным и соответствует поставленной цели. Создание такой модели делает возможным проведение экспериментов, постановка которых в клинике является неосуществимой. Предлагаемая модель НАСГ может быть использована для проведения поиска и испытания действия гепатопротекторных препаратов.

Таким образом, проведенные исследования позволили получить новую экспериментальную модель неалкогольного стеатогепатита, в основе которой лежит комплексное сочетание патологических факторов, инициирующих каскад повреждений в печени, приводящих к развитию стойких морфофункциональных нарушений органа. Предложенная модель проста в исполнении, отличается высокой степенью воспроизводимости, отсутствием летального исхода экспериментальных животных.

Техническим результатом изобретения является повышение воспроизводимости, упрощение способа и приближение к клиническому течению данной патологии печени.

Предлагаемый способ моделирования позволяет в большей мере приблизиться к клиническому течению патологического процесса в печени.

Предлагаемым способом моделирования воспроизводится надежная модель стеатогепатита, что подтверждено морфологическим анализом печени, гистохимическими и биохимическими показателями. Кроме того, способ обеспечивает возможность изучения развития стеатогепатита в динамике.

Осуществление изобретения

Моделирование неалкогольного стеатогепатита проводится на половозрелых крысах линии «Вистар». Животные должны содержаться в стандартных виварных условиях с неограниченным доступом к еде и питью.

Моделирование неалкогольного стеатогепатита осуществляется в 2 этапа в течение 90 суток.

На первом этапе животные находятся на специализированной гиперкалорийной диете (Табл. 1).

На втором этапе, с 60-х суток осуществляются инъекции тетрациклина в бедренную мышцу внутримышечно из расчета в дозе 100 мг/кг в дозе 10 дней подряд.

Сочетание жировой нагрузки топленым говяжьим салом, составляющая порядка 20% от общего состава рациона, увеличивающей общую калорийность диеты, а также применение тетрациклина в дозе 100 мг/кг, также обладающего выраженным гепатотропным эффектом в течение 10 дней, начиная с 60-го дня моделирования, приводит к возникновению на 90 сутки воздействия неалкогольного стеатогепатита, характеризующегося ожирением, нарушением структурной организации, некрозом ткани, формированием фиброза печени.

Источники информации

1. Буеверова Е.Л., Драпкина О.М., Ивашкин В.Т. Атерогенная дислипидемия и печень // Рос. мед. вести. 2008. 1:17-23.

2. Григорьев П.Я. Жировой гепатоз (жировая инфильтрация печени): диагностика, лечение и профилактика // Рус. мед. журн. 2002. 1:30-31.

3. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Обмен липидов, липопротеидов и его нарушения. СПб.: Питер Ком, 1999. 512.

4. Лазебник Л.Б., Зеленогородская Л.А., Морозов И.А. и др. Клинико-морфологические изменения печени при атерогенной дислипидемии и при лечении статинами // Терапевт, арх. 2003. 5:8-12.

5. Пат. Ru 94026117. Способ создания модели гепатита и цирроза печени млекопитающих. Бояринов Г.А., Смирнов В.П., Кауров Я.В. и др., опубл. 27.08.1996.

6. Пат. Ru 2188457. Способ моделирования токсической гепатопатии. Мышкин В.А., Ибатуллина Р.Б., Волкова Е.С. и др., опубл. 27.08.2002.

7. Пат. Ru 2197018. Способ моделирования цирроза печени. Мышкин В.А., Ибатуллина Р.Б., Савлуков А.И. и др., опубл. 20.01.2003.

8. Пат. Ru 2394281. Способ моделирования неалкогольного стеатогепатита у крыс. Караман Ю.К., Новгородцева Т.П., Бивалькевич Н.В., Лобанова Е.Г., опубл. 10.07.2010.

9. Пирс Э. Гистохимия. М.: Изд-во Иностр. литературы, 1962. 967.

10. Chitturi S., Farrell G.C. Etiopathogenesis of non-alcoholic steatohepatitis // Semin. Liver. Dis. 2001. 21: 27-41.

11. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for exsperimental and other scientific purposes. Strasburg: Council of Europe, 1986:51.

12. Fan J. Effect of low-calorie diet on steatohepatitis in rats with obesity and hyperlipidemia // World J. of Gastroenterology. 2003. 9(9): 2045-2049.

Способ моделирования неалкогольного стеатогепатита у крыс, включающий в себя введение с кормом животного топленого говяжьего сала в течение 90 суток, отличающийся тем, что ежесуточно с кормом вводят 5 г топленого говяжьего сала и, начиная с 60 суток моделирования, дополнительно осуществляют внутримышечные инъекции тетрациклина в дозировке 100 мг/кг раз в день в течение 10 дней.