БИОАКТИВАТОР ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ХЛОРЕЛЛЫ НА ОСНОВЕ КВАЗИКРИСТАЛЛА СИСТЕМЫ Al-Cu-Fe

Область техники, к которой относится изобретение

Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к биологическому активатору и биореактору на его основе, которые могут быть использованы, например, в промышленном процессе производства биомассы хлореллы. Микроорганизмы хлореллы широко используются в медицинской, фармакологической, микробиологической, пищевой промышленности, при производстве биологически активных веществ (БАВ), а также для очистки сточных и радиоактивных вод.

Уровень техники

Изобретения основаны на объединении уникальных объектов, принадлежащих принципиально различным отраслям знаний - хлорелла как уникальный объект биологии и биотехнологии, с одной стороны, и квазикристалл системы Al-Cu-Fe как уникальный объект металлургии, с другой.

Хлорелла - род одноклеточных растений из отдела зеленых водорослей. Этот род объединяет около 20 видов, причем в странах СНГ встречается около 10 видов. Наиболее известна и широко распространена Chlorella vulgaris, образующая огромные скопления в воде грязных луж, канав и прудов.

Квазикристаллы - это интерметаллические соединения, атомная структура которых характеризуется наличием осей симметрии 5-го (икосаэдрические), 8-го (октагональные), 10-го (декагональные) и 12-го (додекагональные) порядков.

Многие квазикристаллы являются устойчивыми соединениями вплоть до температуры плавления и могут расти практически при равновесных условиях, как и обычные кристаллы. Практически все квазикристаллические сплавы - диамагнетики. По упругим свойствам квазикристаллы гораздо ближе к аморфным металлам, чем к кристаллам. Свойство квазикристаллов, проявляющееся в высокой силе сопротивления движению дислокаций в квазикристалле, определяет их основное использование в качестве эффективных упрочнителей легких сплавов.

Одной из важных задач, решаемых в настоящее время, является изыскание принципиально новых материалов, способствующих активизации штаммов-продуцентов, что выражается в интенсификации микробиологических процессов.

Многочисленные разработки подтверждают не только чрезвычайно широкий спектр подобных поисковых работ, но и высокую актуальность данных исследований (патенты FR №№2031333, 2075788, 2095670, 2209840, GB №№1318828, 1451694, 1466688, US №№3936352, 3951742, 3951743, 4166006, 5085995, DE №2118361, МПК:C12N 1/38).

В упомянутых работах для активизации микроорганизмов применяется целый ряд факторов, стимулирующих увеличение биологической массы штамма-продуцента и тем самым способствующих увеличению выхода БАВ.

В частности, из патента GB№1466688 известно использование в качестве активаторов широкого спектра биологических объектов (от дрожжей до микроводорослей) смеси катионов двухвалентных металлов Fe⁺², Со⁺², Мо⁺², Mn⁺², в конечной концентрации 0,0005-0,1 М. Катионы вводят в питательную смесь в форме солей минеральных кислот.

Недостатком решения по патенту GB№1466688 является использование в многокомпонентной среде Мо в виде простых соединений, что снижает его эффективность, требует использования достаточно высоких концентраций Мо в растворе и, как следствие, повышает его токсическое влияние.

Известно, что молибден в качестве металла-микроэлемента участвует в метаболических процессах в клетках живых организмов. Ферменты, содержащие группировки Fe-Mo-S, играют роль нитрогеназ, отвечающих за метаболические процессы, протекающие в клетках с участием ряда соединений азота, а также в процессе восстановления Н₃О⁺ до H₂O и Н₂. Кроме того, установлено, что в живых клетках присутствуют ферменты, сочетающие в себе молибден и флавин ксантиноксидаза и альдегидоксидаза (Г. Эйхгорн. Неорганическая биохимия, т.2, с.116, 161, М., "МИР", 1978). Таким образом, введение молибдена в биологические жидкости и питательные среды, используемые в микробиологических и биотехнологических процессах, очевидно, интенсифицирует нитрогеназные процессы и снижает дефицит Mo-содержащих ферментов в клетках. Этим может быть объяснена специфика действия молибдена на биологические процессы.

В решении по патенту RU 2037155 для активации микроорганизмов предлагается вводить молибден в регламентные среды в виде комплексонатов и/или комплексов с аминокислотами. Техническим результатом является снижение концентрации молибдена в питательных средах и его токсического воздействия. Другим техническим результатом является расширение спектра стимуляторов (активаторов), содержащих в своем составе молибден. Технический результат достигается за счет использования в способе активации микроорганизмов ряда комплексонатов или/и комплексных соединений молибдена. Изобретение обеспечивает увеличение выхода БАВ, продуцируемых микроорганизмами, и увеличение выхода биомассы микроорганизмов.

Недостатком решения по патенту RU 2037155 является необходимость поддержания и контроля определенного содержания химических веществ в среде обитания и роста микроорганизмов, превышение которого чревато угнетением роста биомассы. Для реализации предложения необходима сложная система отслеживания и регулирования содержания химического продукта.

Из уровня техники также известен способ, описанный в патенте US 6022479, заключающийся в активации воды и жидких субстанций на основе разработанной технологии эффекта молекулярного резонанса (Molecular Resonance Effect Technology MRET). Эта технология меняет структуру воды и других жидкостей, создавая из молекул воды устойчивые динамические многослойные структуры, благоприятно воздействующие на среду обитания, активность, скорость развития и увеличение биологической массы хлореллы. При обработке воды электромагнитным полем, по всей видимости, кластеры воды на границах раздела фаз (жидкость-воздух) выстраиваются в определенном порядке, при этом все кластеры колеблются с одинаковой частотой, приобретая одну общую частоту. При таком движении кластеров, учитывая, что входящие в кластер молекулы воды являются полярными, то есть имеют большой дипольный момент, следует ожидать появления электромагнитного излучения. Таким образом, биологический (биофизический) механизм воздействия электромагнитного излучения на биологические объекты носит очень сложный многофакторный (комплексный) характер и не описывается какой-либо отдельной моделью.

Недостатком решения по патенту US 6022479 является сложность его практической реализации, высокие требования к предварительной подготовке воды, необходимость постоянного контроля значительного количества технологических параметров, связанных с обеспечением постоянства характеристик воздействующего электромагнитного излучения.

Следует отметить, что основу измененной геометрии кластеров и ассоциатов воды составляет пятиугольник. Подобным строением обладают фуллерены и квазикристаллы, основной особенностью которых является наличие оси симметрии пятого характера.

Из уровня техники известно решение WO 2011127285, выбранное в качестве прототипа, согласно которому в качестве стимулирующего агента для биомассы, в т.ч. водорослей, предложено использовать эффективное количество функционализированных фуллеренов, которые обеспечивают увеличение биомассы, стимулируют рост, продолжительность жизни и/или воспроизведение микроорганизмов. При этом в качестве упомянутых фуллеренов могут быть использованы полигидроксифуллерены, которые являются эффективными при низких уровнях содержания, содействуя увеличению биомассы.

Недостатком решения, представленного в WO 2011127285, является высокая стоимость фуллеренов, сложность процесса функционализации, трудность контроля за содержанием фуллеренов, сложность их извлечения для многократного применения, практическая невозможность полной очистки полученной биомассы от этого химического продукта.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящей группы изобретений является создание биоактиватора для выращивания хлореллы, в виде порошков и покрытий, ускоряющих рост хлореллы и подавляющих развитие иных типов микроводорослей (микроорганизмов).

Техническим результатом изобретения является стимулирование увеличения биологической массы штамма-продуцента, способствующего увеличению выхода конечного продукта - хлореллы. Технический результат достигается за счет изменения физико-химических параметров воды в приграничных с поверхностью квазикристалла областях за счет воздействия на воду собственной квазикристаллической структуры с осью симметрии пятого порядка с формированием кластерной структуры воды, аналогичной структуре, описанной в патенте US 6022479. Квазикристалл создает из молекул воды устойчивые динамические многослойные структуры, наследующие в своих элементах симметрию пятого порядка. В отличие от структурирования на основе эффекта молекулярного резонанса, который создает в жидкости большое многообразие вторичных структур, квазикристаллическое структурирование жидкости приводит к формированию однотипных вторичных структур, которые не только благоприятно воздействуют на среду обитания, активность, скорость развития и увеличение биологической массы хлореллы, но, в дополнение, обладают угнетающим действием на большие по размерам биологические объекты, обеспечивая превалирующее развитие хлореллы. По сравнению с техническим результатом изобретения-прототипа воздействие квазикристалла является значительно более сильным, так как он структурно не замкнут сам на себя, как фуллерены. Фуллерены обладают элементами структуры с осью симметрии пятого порядка, но подобное строение не является у них превалирующим. (Каблов Е.Н., Щетанов Б.В., Абузин Ю.А. Квазикристаллические особенности структуры фуллеренов. Теория и практика технологий производства изделий из композиционных материалов и новых металлических сплавов (ТПКММ), труды международной конференции 27-30 августа 2003, Москва, Россия, с. 195.)

Поставленная задача решается тем, что биоактиватор для выращивания хлореллы представляет собой квазикристаллический материал системы Al-Cu-Fe и может быть выполнен в виде порошка, или в виде покрытия толщиной до 5 мкм на функциональных поверхностях биореактора.

Поставленная задача также решается тем, что способ повышения эффективности выращивания хлореллы (за счет активации роста хлореллы и деактивации остальных микроорганизмов) включает размещение в среде инкубации хлореллы квазикристаллического материала системы Al-Cu-Fe в виде порошка в количестве 5-10% от объема биореактора или в виде тонкого слоя на функциональных поверхностях биоактиватора толщиной до 5 мкм. В качестве функциональной поверхности может выступать внутренняя поверхность биореактора и/или внешняя поверхность дополнительных функциональных объектов, размещаемых в объеме биологического реактора, например бисер.

Поставленная задача также решается тем, что полотно биоактиватора сформировано из отрезков нити, расположенных в объеме биореактора, с нанизанными на них бисером, покрытым слоем квазикристаллического материала толщиной до 5 мкм, закрепленных одним концом на подвеске. Закрепление нитей на подвеске может быть выполнено свободным с возможностью перемещения нитей с бисером по подвеске для регулирования плотности (частоты) их размещения. Нити с бисером на подвеске могут быть размещены на расстоянии друг от друга 0,5-5,0 см.

Применение квазикристаллов системы Al-Cu-Fe для активации роста биологических объектов является парадоксальным. Известно, что ионы меди подавляют развитие микроводорослей, однако в составе квазикристалла действие меди существенно отличается. Проведенные сравнительные исследования показали, что при использовании квазикристаллических покрытий на стенках биологического реактора не происходит подавление роста микроводорослей, наблюдается, наоборот, его интенсификация, особенно применительно к хлорелле. Важной особенностью квазикристалла системы Al-Cu-Fe является его нетоксичность и биологическая совместимость с тканями живых существ (Elina Huttunen-Saarivirta /Microstructure, fabrication and properties of quasicrystalline Al-Cu-Fe alloys: a review / Journal of Alloys and Compounds 363 (2004) p. 150-174).

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется чертежами, где на фиг. 1-2 представлена схема выполнения полотна биоактиватора (схема фиксации нитей с бисером на подвеске биоактиватора), фиг. 3-4 - схема размещения полотен биоактиватора в биореакторе.

Позициями на фигурах обозначены: 1 - крышка биореактора, 2 - подвеска полотна, 3 - фиксатор подвески, 4 - полотно биореактора, 5 - силиконовые фиксаторы, 6 - съемные узлы крепления нити с бисером, 7 - поперечные элементы подвески полотна биоактиватора, 8 - пластиковые фиксаторы, 9 - продольные элементы подвески полотна биоактиватора, 10 - поперечные подвески полотна биоактиватора, 11 - продольные подвески полотна биоактиватора, 12 - диагональные подвески полотна биоактиватора.

Осуществление изобретения

Основой заявляемой группы изобретений - биоактиватора и биореактора, является квазикристаллический материал системы Al-Cu-Fe, который может быть представлен в виде порошка с размерами частиц от 20-60 мкм, который размещают в биореакторе (может свободно перемещаться по внутреннему объему биореактора), или в виде покрытия толщиной до 5 мкм, выполняемого на функциональных поверхностях биореактора (рабочих телах), распределенных по внутреннему объему биореактора, во взаимном соотношении, оптимизированном по критерию максимума площади квазикристаллического покрытия по отношению к объему биореактора и объему обрабатываемого продукта. В качестве рабочих тел могут выступать непосредственно внутренние поверхности биореактора, находящиеся в контакте со средой культивирования хлорелл, и поверхности различных объектов, размещаемых в объеме биореактора.

Согласно изобретению, может быть использован квазикристаллический порошок, обладающий следующими техническими характеристиками: твердость 800-1000 кг/мм²; разброс размеров квазикристаллов не более 15%; высокая стойкость к окислению; стоимость использования на единицу объема суспензии (среды активации) ниже, чем при использовании существующих стимуляторов (диоксида углерода в баллонах, питательных растворов на основе минеральных солей) при большей эффективности и подавлении роста нежелательных водорослей.

В настоящее время известно более 240 квазикристаллических сплавов, свойства которых могут изменяться в достаточно широких пределах. В рамках проведенных исследований заявляемый эффект был доказан для квазикристаллического материала системы Al-Cu-Fe, в частности, химического состава Al₆₅Cu₂₀Fe₁₅ (или Al₆₅Cu₂₂Fe₁₃ и др.).

Наиболее информативной характеристикой, интегрально описывающей предлагаемые типы биоактиваторов с технологических позиций, является «активная удельная площадь (Say)» - удельная характеристика, равная отношению площади поверхности, покрытой квазикристаллом, к объему суспензии хлореллы в биореакторе (при условии, что вся эта площадь находится в контакте с суспензией), измеряемая в см²/л. Для замкнутых биореакторов (например, проточных) активная удельная площадь будет обратно пропорциональна характерному размеру геометрической фигуры.

Для биореакторов с заполнением бисером активная удельная площадь не будет зависеть от формы биореактора и будет определяться массой загрузки, а также и диаметром бисера.

Экспериментальные исследования показали, что одинаковый результат достигается или при полностью покрытой внутренней поверхности тысячелитрового биореактора, или при размещении в нем 4 л (10,4 кг) покрытого квазикристаллами бисера размером 4 мм, или 6,89 л (18,3 кг) размером 7 мм. Объем заполнения составляет 10-15% от объема биореактора, что приводит к достижению значений активной удельной площади на уровне 2,0-2,5 тыс. см²/л.

Квазикристаллический материал может быть получен любым известным способом, например по технологии двухступенчатого отжига смеси исходных элементарных порошков (Al, Cu, Fe) в вакууме.

Покрытие из квазикристалла на функциональные поверхности (основу) может быть реализовано с использованием любых известных из уровня техники способов. Для увеличения площади функциональных поверхностей, покрытых квазикристаллическим слоем, предложено использовать в качестве основы стеклянный бисер диаметром от 2 до 5 мм и более с отверстием, который является подложкой для квазикристаллического слоя, а отверстие в бисере позволяет быстро и надежно фиксировать его на нити или леске с последующем формированием полотен биоактиватора.

Полотно биоактиватора 4 может быть сформировано из отрезков нити (или лески) с нанизанными на них бисером, образующих свесы и закрепленных одним концом на подвеске (трубчатом элементе) 2 (фиг. 1, 2). Закрепление нити на подвеске 2 может быть выполнено «свободным» с возможностью перемещения отрезков нитей с бисером по подвеске 2 для регулирования плотности (частоты) их размещения. Наилучший результат достигается при размещении нитей с бисером на трубчатом элементе 2 на расстоянии друг от друга от 0,5 до 5,0 см. При этом бисер равномерно распределен по полотну 4. Места крепления нити к трубчатому элементу (или подвеске) могут быть отделены друг от друга равными отрезками силиконовой трубки 5 (см. фиг. 2). Длина отрезков силиконовой трубки соответствует расчетному расстоянию между нитями. Фиксирующий узел вяжут таким образом, чтобы сдвоенная несущая леска располагалась в зазоре между силиконовыми трубками. Такая конструкция препятствует скольжению нитей вдоль подвески 2 за счет фиксации каждой нити на собственной уникальной позиции относительно соседних нитей. Геометрические размеры полотна 4, характеризующиеся длиной трубчатого элемента и длиной свесов - нитей с бисером, определяются исходя из габаритных размеров биореактора и схемы размещения полотен в биореакторе. Ниже на фиг. 3 и 4 представлены варианты размещения полотен в биореакторе. В одном из вариантов выполнения полотна каждый отрезок нити и подвеска сформированы на основе двух независимых несущих лесок диаметром 0,50 мм каждая, бисер выбран диаметром 4 мм, среднее расстояние между свесами составляет от 1,3 до 1,6 см, на 1 см подвески приходится 0,64-0,76 шт. свесов. При этом в качестве бисера использован стеклянный сферический бисер типоразмера 6 или 12.

Для получения ровной поверхности полотна биоактиватора после его «сборки» может быть осуществлена термообработка для удаления остаточной упругости лески. Термообработка собранного полотна включает вывешивание полотна на воздухе, подгрузку нитей временными грузами и нагрев полотна промышленным феном до температур 50-60°C. После нагрева и визуально фиксируемого распрямления нитей всю «сборку» охлаждают и дополнительно выдерживают в подгруженном состоянии 15-20 минут. Далее грузы снимают и определяют на глаз качество выравнивания.

Разработанная конструкция квизикристаллического полотна обеспечивает полную автономность и заменяемость элементов. Каждое полотно биоактиватора является независимым и съемным, позволяющим производить оперативную установку - извлечение полотна, независимо от остальных полотен. При этом на каждом полотне любая нитка с бисером также является независимой и съемной, позволяющей производить на извлеченном полотне оперативную установку - замену, независимо от остальных ниток данного полотна.

Предложенный тип биологического активатора является универсальным и может быть применен как в лабораторных, так и в промышленных условиях без существенного изменения технологического процесса. Использование заявляемого биоактиватора в виде квазикристаллического порошка или объектов с квазикристаллическим покрытием (например, полотен из бисера) может осуществляться посредством их размещения как в биореакторах, так и открытых и закрытых бассейнах.

Возможно нанесение квазикристаллического покрытия на внутреннюю поверхность биореактора. В случае отсутствия возможности подобного изменения биореактора в объем реактора с питательной средой вводят определенное количество стеклянного бисера с квазикристаллическим покрытием, например, сформированное в одно или несколько полотен. Эффективную регулировку площади квазикристаллической поверхности можно проводить, изменяя массу бисера или его диаметр.

Заявляемый биоактиватор был апробирован на установках, включающих емкость из прозрачного материала в виде параллелепипеда, имеющую следующие габаритные размеры: длина 160 см, ширина 20 см, высота 75 см. На верхней крышке 1 биореакторов имелись четыре отверстия диаметром 10 см, расположенные в ряд вдоль длины по центральной оси крышки. Рабочий объем реактора составил 224000 см³ или 224 л. Общая площадь боковой и донной поверхности, омываемая суспензией, составила 28400 см². Таким образом, активная удельная площадь биореактора будет равна 28400/224=127 см²/л.

На фиг. 3 и 4 представлены варианты размещения набора полотен биоактиватора (продольное, поперечное, диагональное, радиальное и др.) в биореакторе. Полотна расположены в объеме биореактора на всю его глубину и разбивают биореактор на одинаковые загрузочные сектора. Полотна 4 могут быть закреплены на подвесках 2, расположенных в отверстиях крышки биореактора. Каждая подвеска имеет собственные размеры, связанные с местом расположения конкретного полотна биоактиватора. Биоактиватор является съемным, для чего каждая подвеска оснащена специальными фиксаторами 3, позволяющими производить оперативную установку - извлечение полотна, независимо от остальных полотен. Для повышения активной удельной площади биоактиватора предусмотрена возможность подвешивания сразу нескольких полотен с бисером на каждой подвеске, что, соответственно, позволяет кратно увеличивать значение активной удельной площади.

Установка и фиксация полотен биоактиватора в биореакторе не требует изменений в конструкции биореактора.

Полотна могут быть составными, для этого полотна закреплены на продольных элементах подвески (трубках) полотна биоактиватора 9, выполненных из нержавеющей стали разного диаметра (типоразмеров 10×1 и 8×1, диаметром 8-10 мм) с возможностью их совмещения для обеспечения требуемой итоговой длины под габариты биореактора. Меньшая по диаметру трубка входит с регулируемым натягом в большую по диаметру. Установку полотен биоактиватора производят следующим образом. Продольные элементы подвески полотна биоактиватора 9 с нитями бисера опускают через отверстие внутрь биореактора, располагают по большой диагонали параллепипеда и соединяют, внедряя трубку меньшего диаметра в отверстие трубки с большим диаметром. Собранный из двух трубок элемент подвески поднимают до касания изнутри верхней стороны биореактора. Снаружи верхней стороны биореактора у каждого отверстия располагают поперечные элементы подвески полотна биоактиватора 7 перпендикулярно продольным элементам подвески полотна биоактиватора 9. Пластиковыми фиксаторами 8 скрепляют продольные элементы подвески полотна биоактиватора 9 с поперечными элементами подвески полотна биоактиватора 7. Аналогично монтируют второй продольный элемент подвески.

В варианте расположения полотен биоактиватора, согласно фиг. 4, использованы «диагональные» полотна, «продольные» полотна и «поперечные» полотна. Биореактор в плане разбит на четыре одинаковых загрузочных сектора шириной 20 см и длиной 40 см с отверстием в 10 см посередине. На каждом загрузочном секторе присутствуют четыре «диагональных», два «продольных» и два «поперечных» полотна. С учетом вылета в центральное отверстие на 2 см и отставания от стенок биореактора на 1 см каждое диагональное полотно имеет длину подвески (ширину полотна) 19 см, поперечное - 7 см, продольное - 17 см.

Исследование влияния биологического активатора на основе квазикристалла Al-Cu-Fe, нанесенного на поверхность бисера, на рост хлореллы и других водорослей

Тестовые испытания проводили в сравнительном режиме, сравнивая динамику роста и параметры выросшей хлореллы в непроточных биореакторах с биоактиватором и без него. Два биореактора были оснащены биоактиваторами. Третий биореактор оставался без биоактиватора. Маточная культура хлореллы была залита в четвертый биореактор.

Маточная культура хлореллы Chlorella Vulgaris Bin была распределена равномерно по четырем биореакторам, после чего во все биореакторы была добавлена вода в количестве, соответствующем начальному содержанию маточной культуры, принятой на данном производстве.

Начальная оптическая плотность суспензии во всех четырех биореакторах была одинаковой, соответствующей оптической плотности стандартной начальной суспензии для роста хлореллы.

Рост хлореллы проводили по стандартному режиму в течение трех суток с соответствующим обеспечением режима освещения. После проведения режима роста из каждого биореактора была извлечена проба для исследования качества хлореллы и оптической плотности суспензии. Исследования показали, что качество хлореллы, выращенной в четырех биоактиваторах, не различалось и находилось на стандартном уровне; оптическая плотность суспензии в двух биореакторах без биоактиваторов была одинаковой и соответствовала стандартному уровню; оптическая плотность суспензии из биореактора с биоактиватором повышена на (13-15)% относительно стандартного значения. Сине-зеленых микроводорослей в биореакторах обнаружено не было.

Таким образом, проведенные исследования показали наличие избирательной биологической активности у квазикристалла системы AL-Cu-Fe, проявляющейся в виде подавления роста сине-зеленых водорослей при одновременной активации роста биомассы хлореллы. Применение биоактиватора с квазикристаллом системы Al-Cu-Fe повысило выход биомассы до 15%. На основании проведенных исследований можно сделать вывод, что действие квазикристаллического биоактиватора основано как на каталитическом, так и на структурном воздействии на биологические объекты и среду их обитания.

Заявляемый биоактиватор повышает показатели эффективности существующих технологий производства хлореллы и качества производимого продукта при одновременном снижении удельных показателей их ресурсо- и энергопотребления.