ЧИСТЫЙ ТЕТРАГИДРАТ L-АРГИНИНОВОЙ СОЛИ S-(-)-9-ФТОР-6, 7-ДИГИДРО-8-(4-ГИДРОКСИПИПЕРИДИН-1-ИЛ)-5-МЕТИЛ-1-ОКСО-1Н, -5Н-БЕНЗО[i,j]ХИНОЛИЗИН-2-КАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к, по существу, чистому тетрагидрату L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты и к способу его получения.

Уровень техники

Соединение Формулы (I), химически известное как S-(-)-9-фтор-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-6,7-дигидро-1-оксо-1H,5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновая кислота, принадлежит к классу антибактериальных агентов, в целом, известных как фторхинолоны, и является пригодным для использования при лечении широкого спектра бактериальных инфекций.

Формула (I)

Патент США №7164023 описывает кристаллический тетрагидрат L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты и его получение.

Настоящее изобретение направлено на, по существу, чистый тетрагидрат L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты и на способ его получения.

Сущность изобретения

Соответственно, предлагается, по существу, чистый тетрагидрат L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты и способ его получения.

В одном из общих аспектов, предлагается тетрагидрат L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, имеющий чистоту по меньшей мере 99 мас./мас.%, как определено с помощью ВЭЖХ.

В другом общем аспекте, предлагается тетрагидрат L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, имеющий чистоту по меньшей мере 99 мас./мас.%, дополнительно содержащий меньше чем 0,15 мас./мас.% 9-фтор-8-гидрокси-5-метил-6,7-дигидро-1-оксо-1H,5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, как определено с помощью ВЭЖХ.

Еще в одном из общих аспектов, предлагается тетрагидрат L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, имеющий чистоту по меньшей мере 99 мас./мас.%, дополнительно содержащий меньше чем 0,15 мас./мас.% 8-фтор-9-(4-гидрокси-пиперидин-1-ил)-5-метил-6,7-дигидро-1-оксо-1H,5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, как определено с помощью ВЭЖХ.

В другом общем аспекте, предлагается тетрагидрат L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, имеющий чистоту по меньшей мере 99 мас./мас.%, дополнительно содержащий меньше чем 0,15 мас./мас.% 8-(4-гидрокси-1-пиперидинил)-5-метил-6,7-дигидро-1-оксо-1H,5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, как определено с помощью ВЭЖХ.

В другом общем аспекте, предлагается тетрагидрат L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, имеющий чистоту по меньшей мере 99 мас./мас.%, дополнительно содержащий меньше чем 0,15 мас./мас.% 8,9-дифтор-5-метил-6,7-дигидро-1-оксо-1H,5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, как определено с помощью ВЭЖХ.

В другом общем аспекте, предлагается тетрагидрат L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, имеющий чистоту по меньшей мере 99 мас./мас.%, дополнительно содержащий меньше чем 0,5 мас./мас.% R-(+)-9-фтор-8-(4-гидрокси-пиперидин-1-ил)-5-метил-6,7-дигидро-1-оксо-1H,5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, как определено с помощью ВЭЖХ.

В другом общем аспекте, предлагается тетрагидрат L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, имеющий чистоту по меньшей мере 99 мас./мас.%, дополнительно содержащий бактериальные эндотоксины в количестве меньше, чем 0,35 единицы эндотоксина на мг согласно Фармакопее США.

Еще в одном из общих аспектов предлагается фармацевтическая композиция, содержащая тетрагидрат L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты по настоящему изобретению.

В другом общем аспекте, предлагается способ получения тетрагидрат L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, имеющий чистоту по меньшей мере 99 мас./мас.%, как определено с помощью ВЭЖХ, указанный способ включает:

(a) растворение L-аргинина в смеси ацетона и воды;

(b) добавление S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты к раствору, полученному на стадии (a);

(c) нагрев раствора, полученного на стадии (b), с получением прозрачного раствора;

(d) необязательную обработку теплого раствора, полученного на стадии (c), активированным углем и фильтрование обработанного раствора;

(e) разбавление теплого раствора, полученного на стадии (d), ацетоном и нагрев с обратным холодильником разбавленного раствора;

(f) охлаждение раствора, полученного на стадии (e), с получением твердого тетрагидрата L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты и

(g) сбор тетрагидрата L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, полученного на стадии (f), посредством фильтрования и необязательную промывку его ацетоном.

Подробности одного или нескольких вариантов осуществления настоящего изобретения приводятся ниже в описании. Другие особенности, цели и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего далее описания, включая формулу изобретения.

Подробное описание изобретения

Теперь будут упоминаться иллюстративные варианты осуществления, и в настоящем документе будет использован конкретный язык для их описания. Тем не менее, необходимо понять, что при этом не предполагается никакого ограничения рамок настоящего изобретения. Изменения и дополнительные модификации особенностей настоящего изобретения, иллюстрируемых в настоящем документе, и дополнительные применения принципов изобретения, как иллюстрируется в настоящем документе, которые могли бы быть осуществлены специалистами в данной области, которые имеют информацию настоящего описания, должны рассматриваться в рамках настоящего изобретения. Необходимо отметить, что, как используется в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают упоминание множественного числа, если только контекст не диктует четко иного. Все ссылки, включая патенты, заявки на патент и литературу, цитируемую в описании, в явном виде включаются в настоящий документ в качестве ссылок во всей их полноте.

Настоящее изобретение предлагает, по существу, чистый тетрагидрат L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты и способ его получения.

Термин "по существу, чистый тетрагидрат L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты", как используется в настоящем документе, относится к тетрагидрату L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, имеющему одну или несколько из следующих спецификаций:

(i) тетрагидрат L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, имеющий чистоту по меньшей мере 99 мас./мас.%, как определено с помощью ВЭЖХ;

(ii) тетрагидрат L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, имеющий чистоту по меньшей мере 99 мас./мас.%, дополнительно содержащий меньше чем 0,15 мас./мас.% 9-фтор-8-гидрокси-5-метил-6,7-дигидро-1-оксо-1H,5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, как определено с помощью ВЭЖХ;

(iii) тетрагидрат L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, имеющий чистоту по меньшей мере 99 мас./мас.%, дополнительно содержащий меньше чем 0,15 мас./мас.% 8-фтор-9-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-6,7-дигидро-1-оксо-1H,5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, как определено с помощью ВЭЖХ;

(iv) тетрагидрат L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, имеющий чистоту по меньшей мере 99 мас./мас.%, дополнительно содержащий меньше чем 0,15 мас./мас.% 8-(4-гидрокси-1-пиперидинил)-5-метил-6,7-дигидро-1-оксо-1H,5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, как определено с помощью ВЭЖХ;

(v) тетрагидрат L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, имеющий чистоту по меньшей мере 99 мас./мас.%, дополнительно содержащий меньше чем 0,15 мас./мас.% 8,9-дифтор-5-метил-6,7-дигидро-1-оксо-1H,5H-бензо[i,j] хинолизин-2-карбоновой кислоты, как определено с помощью ВЭЖХ;

(vi) тетрагидрат L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, имеющий чистоту по меньшей мере 99 мас./мас.%, дополнительно содержащий меньше чем 0,5 мас./мас.% R-(+)-9-фтор-8-(4-гидрокси-пиперидин-1-ил)-5-метил-6,7-дигидро-1-оксо-1H,5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, как определено с помощью ВЭЖХ; или

(vii) тетрагидрат L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, имеющий чистоту по меньшей мере 99 мас./мас.%, дополнительно содержащий бактериальные эндотоксины в количестве меньше чем 0,35 Единицы эндотоксина на мг согласно Фармакопее США.

В некоторых вариантах осуществления, предлагается тетрагидрат L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, имеющий чистоту по меньшей мере 99 мас./мас.%, как определено с помощью ВЭЖХ.

В некоторых других вариантах осуществления, предлагается тетрагидрат L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, имеющий чистоту по меньшей мере 99 мас./мас.%, дополнительно содержащий меньше чем 0,15 мас./мас.% 9-фтор-8-гидрокси-5-метил-6,7-дигидро-1-оксо-1H,5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, как определено с помощью ВЭЖХ.

В некоторых других вариантах осуществления, предлагается тетрагидрат L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, имеющий чистоту по меньшей мере 99 мас./мас.%, дополнительно содержащий меньше, чем 0,15 мас./мас.% 8-фтор-9-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-6,7-дигидро-1-оксо-1H,5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, как определено с помощью ВЭЖХ.

В некоторых других вариантах осуществления, предлагается тетрагидрат L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, имеющий чистоту по меньшей мере 99 мас./мас.%, дополнительно содержащий меньше, чем 0,15 мас./мас.% 8-(4-гидрокси-1-пиперидинил)-5-метил-6,7-дигидро-1-оксо-1H,5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, как определено с помощью ВЭЖХ.

В некоторых вариантах осуществления, предлагается тетрагидрат L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, имеющий чистоту по меньшей мере 99 мас./мас.%, дополнительно содержащий меньше, чем 0,15 мас./мас.% 8,9-дифтор-5-метил-6,7-дигидро-1-оксо-1H,5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, как определено с помощью ВЭЖХ.

В некоторых вариантах осуществления, предлагается тетрагидрат L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, имеющий чистоту, по меньшей мере, 99 мас./мас.%, дополнительно содержащий меньше, чем 0,5 мас./мас.% R-(+)-9-фтор-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-6,7-дигидро-1-оксо-1H,5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, как определено с помощью ВЭЖХ.

В другом общем аспекте, предлагается способ получения тетрагидрата L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, имеющего чистоту по меньшей мере 99 мас./мас.%, как определено с помощью ВЭЖХ, указанный способ включает:

(a) растворение L-аргинина в смеси ацетона и воды;

(b) добавление S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты к раствору, полученному на стадии (a);

(c) нагрев раствора, полученного на стадии (b), с получением прозрачного раствора;

(d) необязательную обработку теплого раствора, полученного на стадии (c), активированным углем и фильтрование обработанного раствора;

(e) разбавление теплого раствора, полученного на стадии (d), ацетоном и нагрев с обратным холодильником разбавленного раствора;

(f) охлаждение раствора, полученного на стадии (e), с получением твердого тетрагидрата L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты; и

(g) сбор тетрагидрата L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, полученного на стадии (f), посредством фильтрования и необязательную промывку его ацетоном.

В некоторых вариантах осуществления, предлагается тетрагидрат L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, имеющий чистоту по меньшей мере 99 мас./мас.%, дополнительно содержащий бактериальные эндотоксины в количестве меньше, чем 0,35 единицы эндотоксина на мг согласно Фармакопее США.

В некоторых вариантах осуществления, предлагается фармацевтическая композиция, содержащая, по существу, чистый тетрагидрат L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты по настоящему изобретению.

В некоторых других вариантах осуществления, фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут дополнительно содержать один или несколько фармацевтически приемлемых наполнителей.

Специалисту в данной области будет очевидно, что могут быть осуществлены различные замены и модификации по отношению к изобретению, описанному в настоящем документе, без отклонения от рамок и духа настоящего изобретения. Например, специалисты в данной области заметят, что изобретение может быть осуществлено с использованием разнообразных различных соединений в рамках приведенных общих описаний.

Примеры

Следующие далее примеры иллюстрируют варианты осуществления настоящего изобретения, которые в настоящее время известны лучше всего. Однако необходимо понять, что следующие далее примеры являются только примерами или иллюстрациями применения принципов настоящего изобретения. Многочисленные модификации и альтернативные композиции, способы и системы могут быть предложены специалистами в данной области без отклонения от духа и рамок настоящего изобретения. Прилагаемая формула изобретения предназначена для перекрывания таких модификаций и систем. Таким образом, хотя настоящее изобретение описано выше в деталях, следующие далее примеры предлагают дополнительные детали в сочетании с тем, что в настоящее время считается наиболее практичными и предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения.

Пример 1. Синтез чистого тетрагидрата L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты.

В типичном эксперименте, 0,45 кг L-аргинина растворяют в 7,5 л смеси ацетона и воды (4:3,5). 1 кг S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты загружают в этот раствор и нагревают до 55°C с получением прозрачного раствора. Прозрачный раствор обрабатывают активированным углем при 50°C в течение 0,5 ч и в горячем состоянии фильтруют через 5-мкм фильтр и, наконец, через 0,2-мкм фильтр. Полученный таким образом фильтрат медленно разбавляют 9,8 л ацетона (отфильтрованный через 0,2 мкм) при 50-55°C. Полученную таким образом реакционную массу нагревают с обратным холодильником в течение 0,5 ч и медленно охлаждают примерно до 10-15°C. Полученный таким образом твердый продукт собирают посредством фильтрования и промывают ацетоном. Влажный материал сушат в вакууме при 30-40°C с получением примерно 1,4 кг тетрагидрата L-аргининовой соли S-(-)-9-фтор-6,7-дигидро-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-1-оксо-1H,-5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты, который анализируют на содержание различных компонентов с использованием ВЭЖХ, и результаты описаны в Таблице 1.

Количество R-(+)-9-фтор-8-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-метил-6,7-дигидро-1-оксо-1H,5H-бензо[i,j]хинолизин-2-карбоновой кислоты (или содержание R-(+)-изомеров) определяют с использованием ВЭЖХ (разделительный модуль Waters 2695 или эквивалент). Используют колонку ВЭЖХ, имеющую длину 250 мм и внутренний диаметр 4,6 мм, набитую 10-мкм частицами (S,S) Whelk-O1 10/100. Используемая подвижная фаза представляет собой смесь раствора ацетат аммония (1,52 г в 1000 мл воды качества, пригодного для ВЭЖХ) и этанола при отношении 45:55, об./об. Скорость потока подвижной фазы поддерживают при 1,2 мл/мин. Температуру колонки поддерживают при 40°C. Детектирование осуществляют с использованием УФ-детектора на длине волны 295 нм. Приготавливают стандартный раствор и раствор для исследования в метаноле.

Содержание других веществ (Таблица 1, Компонент N1-5) в продукте определяют с использованием ВЭЖХ (разделительный модуль Waters 2695 или его эквивалент). Используют колонку для ВЭЖХ, имеющую длину 150 мм и внутренний диаметр 4,6 мм, набитую 3,5-мкм частицами X-Terra RP18. Используемая подвижная фаза A представляет собой смесь ацетата аммония (3,0 г) и натрия перхлората моногидрата (8,4 г) в 1000 мл воды качества, пригодного для ВЭЖХ, с конечным pH, доведенным до 2,2 с помощью ортофосфорной кислоты. Подвижная фаза B представляет собой смесь метанола и ацетонитрила при отношении 60:40, об./об. Подвижную фазу запускают в градиентном режиме. Сначала запускают подвижную фазу A и B при отношении 75:25 в течение 15 мин, отношение подвижной фазы B медленно повышают до 50% за 20 мин, выдерживают в течение 10 мин эту концентрацию, и доводят обратно до начального состояния в течение следующих 3 мин и выдерживают в течение 7 мин перед следующим опытом. Скорость потока подвижной фазы поддерживают при 1,2 мл/мин. Температуру колонки поддерживают при 40°C. Детектирование осуществляют с использованием УФ-детектора на длине волны 237 нм. Приготавливают стандартный раствор, и раствор для исследования в смеси воды и подвижной фазы B при отношении 50:50, об./об. при pH, доведенном до 8,5 с помощью разбавленного раствора аммиака.