ИСКУССТВЕННАЯ КОЖА

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новому способу получения искусственной кожи, предусматривающему использование ингибитора матриксной металлопротеиназы и ингибитора гепараназы, и к новой искусственной коже, полученной указанным способом.

Предшествующий уровень техники

Кожа покрывает все тело различных животных, включая человека, и подвергается образованию морщин, затвердений, пигментных пятен, потемнении и снижению эластичности и т.п., вызываемых старением и внешними факторами, такими как солнечный свет, сухость, окисление, внешние стрессовые воздействия и эмоциональный стресс.

Натуральная (естественная) кожа состоит из двух слоев, включающих эпидермис и дерму, и тонкой небольшой мембраны, называемой эпидермальной базальной мембраной, так как она располагается между эпидермисом и дермой. Эпидермальная базальная мембрана представляет собой чрезвычайно тонкую структуру, имеющую толщину около 0,1 мкм и присутствующую в форме покровного листа на месте соединения эпидермиса и дермы. Помимо эпидермальной базальной мембраны, имеющей основную структуру, состоящую из темной пластинки (lamina densa) и светлой пластинки (lamina lucida), она состоит также из гемидесмосом кератиноцитов, якорных фрагментов, якорных волокон и т.п.; в частности, ее основная структура построена, например, из коллагена типа IV и различных типов ламининов и протеогликанов. Основным компонентом эпидермальных базальных клеток и основной структуры и, в частности, якорных фрагментов, связанных с темной пластинкой (lamina densa), является ламинин-5; основная структура и коллагеновые волокна дермы соединены якорными волокнами, состоящими главным образом из коллагена типа VII. К тому же, якорные фрагменты и якорные волокна взаимосвязаны и образуют комплексы, называемые якорными комплексами. Вследствие такой структуры кожа, которая покрывает наружный слой тела, обладает такой степенью прочности, которая позволяет ей выдерживать внешние механические воздействия (Encyclopedia of Cosmetics, Society of Cosmetic Chemists of Japan, pp.405-406).

Однако отмечается растущий спрос на искусственную кожу, которая может использоваться в качестве заменителя в тех случаях, когда "врожденная" кожа (т.е. натуральная кожа) получила повреждения по каким-то причинам. Кроме того, чрезвычайно важным является также создание искусственной кожи для использования в качестве экспериментального материала для тестирования действия на кожу лекарственных препаратов и косметических средств; в каждой из указанных сфер применения наблюдается сильное стремление к получению искусственной кожи, максимально, насколько это возможно, имитирующей структуру натуральной кожи.

Известный способ получения искусственной кожи предшествующего уровня техники включает культивирование нормальных кератиноцитов эпидермиса человека на подвергнутом усадке коллагеновом геле, содержащем фибробласты человека, с образованием эпидермального слоя. Однако в этом способе в силу того, что образование базальной мембраны между коллагеновым гелем, который имитирует дерму, и эпидермальным слоем, который имитирует эпидермис, происходит неадекватно, в случае использования этой искусственной кожи восстановление кожной базальной мембраны стимулируется введением матриксной металлопротеиназы либо матриксной металлопротеиназы вместе со стимулятором образования матриксного белка (опубликованная без экспертизы патентная заявка Японии №2001-269398). К тому же известно, что вещества, которые ингибируют серинпротеазы, коллаген типа IV или типа VII, являющийся основным компонентом эпидермальной базальной мембраны, или вещества, которые активизируют выработку ламинина-5, оказывают такое же стимулирующее действие на образование базальной мембраны, что и ингибиторы матриксной металлопротеиназы (опубликованная без экспертизы патентная заявка Японии №2004-75661). Однако в случае использования искусственной кожи, полученной согласно предшествующему уровню техники, образование структур высшего порядка эпидермальной базальной мембраны и дермы остается недоразвитым, что препятствует адекватной коммуникации между эпидермальной базальной мембраной и дермой.

Кроме того, хотя известно, что соединения, которые ингибируют гепараназу, улучшают функцию базальной мембраны и ингибируют, тем самым, образование морщин в ходе процесса, в результате которого на коже образуются морщины (опубликованная Международная заявка WO 2009/123215), но неизвестно, что комбинация этих соединений с ингибитором матриксной металлопротеиназы стимулирует восстановление эпидермальной базальной мембраны и дермы в искусственной коже.

Документы предшествующего уровня техники

Патентные документы

Патентный документ 1: опубликованная без экспертизы патентная заявка Японии №2001-269398.

Патентный документ 2: опубликованная без экспертизы патентная заявка Японии №2004-75661.

Патентный документ 3: опубликованная Международная заявка WO 2009/123215.

Краткое изложение сущности изобретения

Проблемы, решаемые изобретением

Целью настоящего изобретения является получение искусственной кожи, в которой коммуникация между эпидермальной базальной мембраной и дермой достигается адекватно и максимально приближена, насколько это возможно, к структуре натуральной кожи.

Средство для решения проблем

Когда изобретатель настоящего изобретения получил искусственную кожу путем добавления ингибитора матриксной металлопротеиназы и ингибитора гепараназы к культуральной среде для образования искусственной кожи, содержащей эпидермальные кератиноциты человека и фибробласты дермы человека, и культивирования клеток в этой культуральной среде, то изобретатель настоящего изобретения преуспел в получении искусственной кожи, в которой структуры высшего порядка эпидермальной базальной мембраны и дермы максимально приближены к таким же структурам натуральной кожи.

Таким образом, настоящая заявка включает изобретения, указанные ниже.

[1] Способ получения искусственной кожи, предусматривающий добавление ингибитора матриксной металлопротеиназы и ингибитора гепараназы к культуральной среде для образования искусственной кожи, содержащей эпидермальные кератиноциты человека и фибробласты дермы человека; культивирование клеток в культуральной среде для образования искусственной кожи и получение искусственной кожи.

[2] Искусственная кожа, включающая эпидермальную базальную мембрану, содержащую непрерывную темную пластинку (lamina densa) и якорные волокна, исходящие из темной пластинки (lamina densa), и дерму, содержащую коллагеновые волокна, в которой эпидермальная базальная мембрана и дерма прочно соединены друг с другом за счет связывания якорных волокон, исходящих из непрерывной темной пластинки (lamina densa), присутствующей в эпидермальной базальной мембране, с коллагеновыми волокнами, присутствующими в дерме.

[3] Искусственная кожа, описанная выше в [2], в которой дерма содержит также fibripositors (лат."построители волокон"; выпячивания на поверхности клеточных

мембран, заставляющие коллагеновые волокна укладываться параллельно, что обеспечивает прочность кожи).

[4] Искусственная кожа, описанная выше в [2] или [3], в дерме которой образуются эластичные волокна.

[5] Искусственная кожа, описанная выше в любом из [2]-[4], полученная способом, описанным выше в [1].

[6] Искусственная кожа, состоящая из искусственных клеток, образовавшихся в культуральной среде, содержащей ингибитор матриксной металлопротеиназы и ингибитор гепараназы, в которой искусственные клетки содержат эпидермальную базальную мембрану, включающую непрерывную темную пластинку (lamina densa), и якорные волокна, исходящие из темной пластинки (lamina densa), и дерму, содержащую коллагеновые волокна, и в которой эпидермальная базальная мембрана и дерма прочно соединены друг с другом за счет связывания якорных волокон, исходящих из непрерывной темной пластинки (lamina densa), присутствующей в эпидермальной базальной мембране, с коллагеновыми волокнами, присутствующими в дерме.

Положительный эффект изобретения

Неожиданно подтвердилось образование непрерывной однородной темной пластинки (lamina densa), не наблюдавшееся в искусственной коже предшествующего уровня техники, и якорных волокон, связанных с темной пластинкой (lamina densa), в эпидермальной базальной мембране искусственной кожи, полученной способом настоящего изобретения. Более того, в дерме искусственной кожи наблюдалось появление fibripositors, о присутствии которых сообщалось ранее, но только в натуральной коже, и подтвердилось также образование эластичных волокон, которые чрезвычайно трудно реконструировать с помощью традиционных способов. Эти структуры высшего порядка эпидермальной базальной мембраны и дермы максимально приближены, насколько это возможно, к таким же структурам натуральной кожи.

Краткое описание фигур

Фиг.1 представляет электронные микрофотографии, показывающие структуры эпидермальных базальных мембран контрольной группы, модели кожи, культивированной при добавлении только ингибитора матриксной металлопротеиназы (ММР) к культуральной жидкости (группа А), модели кожи, культивированной при добавлении только ингибитора гепараназы к культуральной жидкости (группа В), и модели кожи, культивированной при добавлении как ММР-ингибитора, так и ингибитора гепараназы к культуральной жидкости (группа С).

Фиг.2 представляет электронные микрофотографии, показывающие фибробласты, присутствующие в дерме непосредственно под базальной мембраной контрольной группы, модели кожи, культивированной при добавлении только ингибитора матриксной металлопротеиназы (ММР) к культуральной жидкости (группа А), модели кожи, культивированной при добавлении только ингибитора гепараназы к культуральной жидкости (группа В), и модели кожи, культивированной при добавлении как ММР-ингибитора, так и ингибитора гепараназы к культуральной жидкости (группа С). В отличие от фибробластов, которые представляют собой нормальные фибробласты, в контрольной группе, группе А и группе В, фибробласты в группе С содержат fibripositors.

Фиг.3 представляет электронные микрофотографии, показывающие эластичные волокна, образовавшиеся в дерме модели кожи, культивированной при добавлении как ММР-ингибитора, так и ингибитора гепараназы к культуральной жидкости (группа С).

Варианты осуществления изобретения

Ингибитор матриксной металлопротеиназы (ММР)

На применение ингибитора матриксной металлопротеиназы, который используется в настоящем изобретении, нет никаких конкретных ограничений при условии, что он представляет собой вещество, обладающее ингибиторной активностью по отношению к матриксным металлопротеиназам. Примеры матриксных металлопротеиназ включают желатиназу, коллагеназу, стромелизин и матрилизин. Таким образом, вещество, которое ингибирует желатиназу, коллагеназу, стромелизин или матрилизин и др., может выбираться для использования в качестве ингибитора матриксной металлопротеиназы.

Конкретные примеры ингибиторов матриксных металлопротеиназ включают вещество CGS27023A (N-гидрокси-2-[[(4-метоксифенил)сульфонил](3-пиколил)амино]-3-метилбутанамид гидрохлорид) (J. Med. Chem., 1997, Vol.40, pp.2525-2532) и ММР-ингибитор (p-NH2-Bz-Gly-Pro-D-Leu-Ala-NHOH)(FN-437) (BBRC, 1994, Vol.199, pp.1442-1446). В качестве ингибитора матриксной металлопротеиназы предпочтительно используется вещество CGS27023A.

Ингибитор гепараназы

На применение ингибитора гепараназы, который используется в настоящем изобретении, нет никаких конкретных ограничений при условии, что он представляет собой вещество, обладающее ингибиторной активностью по отношению к гепараназе. Гепараназа - это фермент, который присутствует в различных клетках и который специфически расщепляет гепарансульфатные цепи различных гепарансульфатных протеогликанов. В коже гепараназа продуцируется эпидермальными кератиноцитами, которые содержатся в эпидермисе, фибробластах дермы и внутрисосудистых эндотелиальных клетках.

Конкретным примером ингибитора гепараназы является 1-[4-(1Н-бензимидазол-2-ил)-фенил]-3-[4-(1Н-бензимидазол-2-ил)-фенил]-мочевина.

Искусственная кожа

Любая культуральная среда произвольного состава, традиционно применяющаяся в получении искусственной кожи, может использоваться в качестве базальной (минимальной) среды для получения искусственной кожи в настоящем изобретении, и примеры этих культуральных сред включают среду Игла в модификации Дульбекко (DMEM), содержащую 10% фетальной телячьей сыворотки; среду DMEM-Ham's F-12 (3:1) [DMEM с субстратом Хэма F-12], содержащую 10% фетальной телячьей сыворотки, 5 мкг/мл трансферрина, 5 мкг/мл инсулина, 2 нМ трийодтиронина, 0,1 нМ холерного токсина и 0,4 мкг/мл гидрокортизона, и культуральную среду, состоящую из смеси (1:1) среды для выращивания кератиноцитов (КОМ) и среды DMEM, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки. Количество ингибитора матриксной металлопротеиназы (хотя и варьирует в зависимости от типа), добавляемое к этим базальным средам, в типичных случаях составляет примерно от 10 мкг/л до 10 г/л, предпочтительно-примерно от 100 мкг/л до 1 г/л и оптимально - примерно от 1 мг/л до 100 мг/л. Кроме того, количество ингибитора гепараназы (хотя также варьирует в зависимости от типа), добавляемое к этим базальным средам, в типичных случаях составляет примерно от 10 мкг/л до 100 г/л, предпочтительно - примерно от 100 мкг/л до 10 г/л и оптимально - примерно от 1 мг/л до 1 г/л.

Для получения искусственной кожи настоящего изобретения подвергнутый усадке коллагеновый гель типа I, содержащий фибробласты человека, сначала выстаивается в покое на металлической сетке. Подвергнутый усадке коллагеновый гель типа I, содержащий фибробласты человека, можно приготовить, как описано ниже. После приготовления раствора коллагена, содержащего суспендированные фибробласты на льду, коллаген желатинируется в чашке Петри до получения геля. После чего гель отделяется от стенок чашки Петри, и коллагеновый гель подвергается усадке в СО₂-инкубаторе.

Затем эпидермальные клетки, такие как нормальные кератиноциты эпидермиса человека, культивируются на коллагеновом геле с образованием эпидермиса. Образование эпидермального слоя путем культивирования клеток кожи может проводиться, как описано ниже. Подвергнутый усадке коллагеновый гель помещается на металлическую сетку, затем поверх геля кладется стеклянное кольцо. Суспензия человеческих препуциальных эпидермальных кератиноцитов помещается в стеклянное кольцо во избежание утечки жидкости. Кольцо удаляется после адгезии кератиноцитов в СО₂-инкубаторе. Вышеупомянутая культуральная среда заливается на границу эпидермального слоя, и культивирование продолжается до тех пор, пока подвергаемый воздействию воздуха эпидермальный слой не образует роговой слой.

В соответствии с этим способом искусственная кожа, максимально приближенная, насколько это возможно, к структуре натуральной кожи, может быть получена за очень короткий период времени - примерно от 1 до 4 недель, в типичных случаях - примерно от 4 суток до 2 недель, после начала культивирования. Более конкретно, образование непрерывной однородной темной пластинки (lamina densa), а также якорных волокон, связанных с lamina densa, которое не наблюдалось в искусственной коже предшествующего уровня техники, наглядно подтвердилось в эпидермальной базальной мембране искусственной кожи настоящего изобретения.

Темная пластинка (lamina densa) служит основной структурой эпидермальной базальной мембраны и состоит из коллагена типа IV, различных типов ламининов и протеогликанов. Якорные волокна, состоящие преимущественно из коллагена типа VII, исходят из этой основной структуры в форме lamina densa, и функция этих волокон заключается в прочном соединении эпидермальной базальной мембраны и дермы путем переплетения с коллагеновыми волокнами дермы. Таким образом, образование непрерывной lamina densa в эпидермальной базальной мембране искусственной кожи настоящего изобретения и образование якорных волокон, исходящих из lamina densa, означает, что искусственная кожа настоящего изобретения обладает такой же чрезвычайно высокой степенью прочности по отношению к внешнему механическому воздействию, что и натуральная кожа.

Неожиданно подтвердилось образование структур высшего порядка фибробластов, характеризующихся развитым зернистым эндоплазматическим ретикулумом и fibripositors (см. выше), в дерме искусственной кожи настоящего изобретения. Известно, что секретируемые белки синтезируются мембраносвязанными рибосомами, присутствующими внутри зернистого эндоплазматического ретикулума. Известно также, что fibripositors содержат коллагеновые фибриллы и функционируют как богатые актином выпячивания протоплазматических мембран, выступающие из фибробластов, а коллагеновые фибриллы, как сообщалось, укладываются в межклеточные каналы, образуемые соседними фибробластами указанных fibripositors (Elizabeth G. Canty, et al., The Journal of Cell Biology, Vol.165, No. 4, 2004, pp.553-563, Elizabeth G. Canty, et al.. The Journal of Biological Chemistry, Vol.281, No. 50, December 15, 2006, Sally M. Humphries, et al.. The Journal of Biological Chemistry, Vol.283, No. 18, pp.12129-12135, and Zoher Kapacee, et al.. Matrix Biology, Vol.27, 2008, pp.371-375). Таким образом, тот факт, что фибробласты, имеющие развитый зернистый эндоплазматический ретикулум и fibripositors внутри, присутствуют в дерме искусственной кожи настоящего изобретения, указывает на то, что функция фибробластов, присутствующих в регенерированной дерме искусственной кожи, в значительной мере активизируется ингибитором матриксной металлопротеиназы и ингибитором гепараназы, и означает, что продукция клеточного матрикса в виде синтеза секретируемых белков и коллагеновых волокон в искусственной коже настоящего изобретения происходит также активно и таким же образом, как и в натуральной коже.

Более важно то, что образование эластичных волокон, реконструкция которых чрезвычайно затруднена в традиционной искусственной коже, подтвердилось в искусственной коже настоящего изобретения. Эластичные волокна состоят главным образом из микрофибрилл и аморфного эластина, и в натуральной коже зрелые эластичные волокна распределены между сетчатыми слоями коллагеновых волокон. Первичной функцией эластичных волокон является придание упругости коже и поддержание плотности кожи. В дополнение к этому, микрофибриллы, располагающиеся в перпендикулярном направлении непосредственно под базальной мембраной, выполняют важную роль соединения базальной мембраны с дермой. Таким образом, образование эластичных волокон в дерме искусственной кожи настоящего изобретения является чрезвычайно важным доказательством того, что искусственная кожа настоящего изобретения имеет функцию, аналогичную функции натуральной кожи.

Искусственная кожа настоящего изобретения может клинически трансплантироваться как заменитель натуральной кожи в том случае, если натуральная кожа тела по каким-либо причинам подверглась поражениям или повреждению. В дополнение к этому, искусственная кожа настоящего изобретения может применяться в эстетических целях на неровностях кожной поверхности с тем, чтобы устранить келоидные рубцы, причиной которых явились ожоги, шрамы от кожных трансплантатов, хирургические рубцы, глубокие морщины, шрамы от глубоких ран, шрамы от угревой сыпи, расширенные устья волосяных фолликулов или "гусиные лапки" на коже и т.п. Более того, искусственная кожа настоящего изобретения может также использоваться для тестирования повышенной чувствительности кожи и тестирования эффективности или токсичности лекарственных препаратов и косметических средств либо для проведения исследований по заживлению ран, миграции клеток, инвазии раковых клеток, метастазирования раковых клеток или прогрессирования рака и т.п.

Как описывалось выше, поскольку комбинация ингибитора матриксной металлопротеиназы и ингибитора гепараназы реализует структуры высшего порядка эпидермальной базальной мембраны и дермы искусственной кожи, максимально приближенные к таким же структурам натуральной кожи, то эта комбинация пригодна и в качестве культуральной жидкости для образования искусственной кожи настоящего изобретения. Поэтому в другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается культуральная жидкость искусственной кожи, которая содержит ингибитор матриксной металлопротеиназы и ингибитор гепараназы. Кроме того, предполагается, что нанесение ингибитора матриксной металлопротеиназы и ингибитора гепараназы на кожу тела будет стимулировать регенерацию и восстановление эпидермальной базальной мембраны и дермы. Таким образом, в еще одном аспекте настоящего изобретения обеспечивается композиция для активации кожи, стимулирующая регенерацию и восстановление эпидермальной базальной мембраны и/или дермы, которая включает один или множество ингибиторов матриксных металлопротеиназ и ингибиторов гепараназы. В контексте изобретения "активация кожи" относится к предупреждению и улучшению, например, пониженной функции кожи, сопровождающейся структурными изменениями в эпидермальной базальной мембране и/или дерме, характерными для старения и т.п., а более конкретно - к предупреждению (и улучшению) образования морщин и затвердений кожи.

Вышеупомянутая культуральная жидкость искусственной кожи или композиция для активации кожи содержит в качестве активных ингредиентов ингибитор матриксной металлопротеиназы и ингибитор гепараназы в концентрациях, достаточных для стимулирования регенерации и восстановления эпидермальной базальной мембраны и дермы, и эти активные ингредиенты в типичных случаях содержатся в концентрациях соответственно от 0,0000001% масс.до 10% масс., предпочтительно - от 0,000001% масс. до 10% масс., в пересчете на массу культуральной жидкости или композиции.

Кроме того, в культуральную жидкость искусственной кожи или композицию для активации кожи может также соответствующим образом вводиться носитель из тех, какие традиционно используются для приготовления вышеупомянутой культуральной жидкости искусственной кожи или композиции для активации кожи, а также ароматы, масла, поверхностно-активные вещества, антисептики, секвестранты ионов металлов, водорастворимые полимеры, загустители, порошкообразные ингредиенты, поглотители ультрафиолетового излучения, увлажнители, фармацевтические ингредиенты, антиоксиданты, регуляторы рН, очистители, осушители или эмульсии и др. При введении каждого из этих ингредиентов в культуральную жидкость искусственной кожи или композицию для активации кожи согласно настоящему изобретению необходимо вводить указанные ингредиенты в таком количестве, какое не ухудшит желательный результат настоящего изобретения.

Примеры

1. Способ культивирования модели кожи

Модель кожи (EFT-400, MatTeK) культивировали в специализированной среде (EFT-400-ASY, MatTeK). Диметилсульфоксид (DMSO) и этанол добавляли к специализированной среде до конечной концентрации 0,1% (контрольная группа); 50 мМ 1-[[4-(1Н-бензимидазол-2-ил)-фенил]-3-[4-(1Н-бензимидазол-2-ил)-фенил]-мочевины (растворитель DMSO) добавляли к специализированной среде до конечной концентрации 50 мкМ (группа ингибитора гепараназы); 10 мМ N-гидрокси-2-[(4-метоксифенил)сульфонил] (3-пиколил)амино]-3-метилбутанамид гидрохлорида (CGS27023A, растворитель этанол) добавляли к специализированной среде до конечной концентрации 10 мкМ (группа ММР-ингибитора); 50 мМ 1-[4-(1Н-бензимидазол-2-ил)-фенил]-3-[4-(1Н-бензимидазол-2-ил)-фенил]-мочевины (растворитель DMSO) и 10 мМ CGS27023A (растворитель этанол) добавляли к специализированной среде до конечной концентрации соответственно 50 мкМ и 10 мкМ (группа ингибитора гепараназы+ММР-ингибитора), после чего проводили культивирование.

2. Электронно-микроскопические наблюдения

Вышеупомянутую модель кожи разрезали после культивирования пополам, закрепляли фиксатором Замбони с последующей фиксацией осмиевой кислотой, после чего заливали смолой в соответствии с установленными методами. Для изучения тканей под электронным микроскопом (JEM-1230, JEOL) готовили их ультратонкие срезы и окрашивали уранилацетатом. Затем проводили сравнительную оценку морфологии модели кожи, культивированной с добавлением растворителей к исходной культуральной жидкости (контрольная группа); модели кожи, культивированной с добавлением только ММР-ингибитора в форме N-гидрокси-2-[[(4-метоксифенил) сульфонил](3-пиколил)амино]-3-метилбутанамид гидрохлорида (CGS27023A) к культуральной жидкости (группа А); модели кожи, культивированной с добавлением только ингибитора гепараназы в форме 1-[4-(1Н-бензимидазол-2-ил)-фенил]-3-[4-(1Н-бензимидазол-2-ил)-фенил]-мочевины к культуральной жидкости (группа В), и модели кожи, культивированной с добавлением как N-гидрокси-2-[[(4-метоксифенил) сульфонил](3-пиколил)амино]-3-метилбутанамид гидрохлорида (CGS27023A), так и 1-[4-(1Н-бензимидазол-2-ил)-фенил]-3-[4-(1Н-бензимидазол-2-ил)-фенил]-мочевины к культуральной жидкости (группа С). Результаты показаны в нижеприведенной таблице.

Наряду со структурами, наблюдавшимися в нормальной человеческой коже, образование структур якорных волокон наблюдалось только в группе С, т.е. в модели кожи, в которой к культуральной жидкости добавлялись и ММР-ингибитор, и ингибитор гепараназы. Помимо этого, появление fibripositors, которые не удалось реализовать в ранее описанных моделях кожи и которые играют важную роль в образовании матрицы кожи, также наблюдалось только в группе С.Более того, появление эластина, структуры которого образуются непосредственно под базальной мембраной моделей кожи, также наблюдалось только в группе С.Эти результаты указывают на то, что модель кожи группы С в еще большей степени приближена к натуральной коже, чем когда-либо прежде.