Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОЦЕНКИ АДГЕЗИВНЫХ СВОЙСТВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ Vibrio cholerae El Tor И Vibrio cholerae O139 НА КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЕ HuTu-80

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в лабораторной диагностике для определения индекса адгезии холерных вибрионов Vibrio cholerae El Tor и Vibrio cholerae O139 (Бенгал).

В настоящее время существуют различные способы определения уровня адгезии холерных вибрионов, которая является одним из главных показателей патогенности возбудителя холеры. Известные способы с применением эритроцитов (1), адгезии холерных вибрионов к эпителию кишечника кролика (2) утратили свою актуальность в решении этого вопроса в связи с вступлением в 2013 г. в силу директивы Европейского парламента на проведение экспериментов с лабораторными животными, согласно которым данные методы не соответствуют требованиям биоэтики.

Предлагаемый способ предусматривает, использование перевиваемой монослойной человеческой клеточной линии аденокарциномы двенадцатиперстной кишки HuTu-80, как наиболее эффективной модели эпителиоцитов кишечника человека для определения адгезивной активности холерных вибрионов.

Известен способ выявления эпидемической значимости холерных вибрионов Vibrio cholerae El Tor и Vibrio cholerae O139 по их адгезивной способности (см. патент RU №2332460, кл. C12Q , C12R , 27.08.2008), заключающийся в том, что в качестве субстрата, к которому прикрепляются холерные вибрионы, используют II группу крови человека, последнюю дефибринизируют, трижды отмывают, центрифугируют, после полученные эритроциты разводят физиологическим раствором в соотношении 1:8, ставят реакцию на стекле, после чего проводят учет реакции по среднему показателю адгезии.

Однако недостатком этого способа в условиях лаборатории является нестабильность эритроцитов II группы крови человека, трудность в их получении и стандартизации.

За прототип выбран способ определения адгезивных свойств бактерий рода Enterococcus с помощью клеточной линии СаСо-2 (см. патент RU №2501861, кл. C12Q , G01N , C12N¹/₁₂₀, 20.12.2013), включающий подготовку бактериальной суспензии, отделение полученной биомассы бактерий центрифугированием, разведение полученной биомассы в физиологическом растворе, подготовку монослоя клеток СаСо-2, внесение бактериальной культуры, культивирование клеток, промывку физиологическим раствором, снятие монослоя с бактериальными клетками и подсчитыванием количества связанных с 1000 клетками СаСо-2 бактериальных клеток, при этом бактерии относятся к высокоадгезивным, если количество связавшихся клеток составляет от 1010 до 3000, среднеадгезивным от 210 до 1000, к низкоадгезивным от 0 до 200.

Недостатком прототипа является то, что известный способ не может быть использован при мониторинге холеры, так как подготовительный этап СаСо-2 к эксперименту длительный (культура растет в течение 14 дней) и трудоемкий.

При этом культура СаСо-2 при культивировании требует внесения в ростовую среду дополнительных питательных веществ, что приводит к удорожанию исследований.

Кроме того, применение трипсина и версена на этапе снятия монослоя с прикрепившимися бактериальными клетками отрицательно влияет на клеточную стенку холерных вибрионов, что приводит к большим погрешностям в исследованиях, а метод серийных разведений влияет на точность результатов.

Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка нового способа, имеющего высокую точность выявления адгезивной способности холерных вибрионов Vibrio cholerae El Tor и Vibrio cholerae O139 с использованием клеточной культуры HuTu-80.

Поставленная задача достигается тем, что способ оценки адгезивных свойств холерных вибрионов Vibrio cholerae El Tor и Vibrio cholerae O139 на клеточной культуре HuTu-80 включает следующие стадии:

а) проводят подготовку монослоя клеток HuTu-80 путем их выращивания в пластиковых флаконах объемом 50 мл, по 100-150 тыс. на 1 мл с последующим трипсинизированием культуры и внесением ее в пенфлаконы с дисками (диски 12,0 X 0,11 SPL Lifesciences) по 50 тыс. клеток в объеме 1 мл;

б) готовят бактериальную суспензию штаммов Vibrio cholerae El Tor и Vibrio cholerae O139, которые выращивают на агаре Мартена (рН 7,7) в течение 18 часов, после этого петлей засевают в бульон LB (рН 7,7) и выдерживают в термостате при 37°С в течение трех часов;

в) эксперимент проводят в пенфлаконах с дисками, на которых сформировался разреженный монослой HuTu-80, туда добавляют 10 мкл бактериальной суспензии и 1 мл среды DMEM с 5% сыворотки эмбриональной бычьей, до концентрации холерных вибрионов 106 м.к. /мл, затем проводят инкубирование в течение 90 минут при 37°С, удаляют питательную среду, дважды промывают монослой раствором Хенкса рН 7,4, фиксируют 5% формалином 1 час, после этого высушивают и окрашивают диски по Романовскому - Гимза 1:5 в течение 40 минут;

г) проводят по окрашенным дискам подсчет связанных бактериальных клеток, для этого диски промывают раствором Хенкса рН 7,4, достают из флаконов, высушивают, просматривают под микроскопом и определяют адгезивные свойства холерных вибрионов по числу вибрионов, связавшихся с 100 клетками HuTu-80, и рассчитывают индекс адгезии по формуле

где

ИА - индекс адгезии,

∑КБ - суммарное количество клеток бактерий, прикрепившихся к одной клетке линии HuTu-80,

100К - 100 клеток линии HuTu-80,

оценивают результаты по полученному количественному индексу адгезии, если он больше 20 делают вывод, что исследуемый штамм - высокоадгезивный, от 10 до 20 - среднеадгезивный штамм, меньше 10 - штамм низкоадгезивный.

Способ осуществляется следующим образом.

Для проведения способа необходима клеточная линия HuTu-80 (двенадцатиперстная кишка человека), которую получают из Российской коллекции клеточных культур позвоночных института цитологии РАН (г. Санкт-Петербург).

Предлагаемый способ включает в себя следующие этапы:

1) подготовительный;

а) размораживание клеточной линии и ее адаптацию к условиям выполнения эксперимента;

б) культивирование штаммов Vibrio cholerae El Tor и Vibrio cholerae O139 на питательных средах для постановки опытов;

2) проведение эксперимента - взаимодействие клеток холерных вибрионов с перевиваемой монослойной человеческой клеточной линией аденокарциномы двенадцатиперстной кишки HuTu-80;

3) учет результатов воздействия клеток Vibrio cholerae с перевиваемой монослойной человеческой клеточной линией аденокарциномы двенадцатиперстной кишки HuTu-80.

Этап 1, а - Ампулы с клеточной культурой достают из биохранилища и размораживают при температуре 37°С, выдерживая ампулу на водяной бане в течение 2-3 минут. С помощью теста прижизненной окраски трипановым синим определяют их жизнеспособность, последняя должна быть не менее 80-85%.

Суспензию монослойных клеток переносят в пробирку с 199 средой для отмывания от примесей защитной среды и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут, супернатант удаляют, осадок клеток ресуспендируют в полной среде выращивания при рН7,5.

Клетки высевают в пластиковые флаконы объемом 50 мл, 100-150 тысяч на 1 мл. Культивирование проводят в СО₂-инкубаторе (Naure) при температуре 37°С и концентрации СО₂ - 5%, с периодичностью высева 2-3 раза в неделю. Для снятия клеточного монослоя HuTu-80 используют растворы трипсина и версена в соотношении 1:3. В процессе тиражирования клеточной культуры с помощью инвертированного микроскопа (Nikon) оценивают их морфологию и отсутствие посторонней бактериальной микрофлоры.

Для постановки опыта используют свежую трипсинизированную культуру клеток линии HuTu-80. В пенфлаконы с дисками (диски 12,0 X 0,11 SPL Lifesciences) вносят по 50 тысяч клеток в объеме 1 мл. На следующий день с помощью инвертированного микроскопа оценивают образование разреженного монослоя.

Этап 1, б - Культуры холерных вибрионов готовят непосредственно перед опытом. Для этого штаммы выращивают на агаре Мартена (рН 7,7) в течение 18 часов, по истечении этого срока засевают одну стандартную петлю (d=2 мм) исследуемой культуры в бульон LB (Luria-Bertani) (рН 7,7), выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение трех часов. После этого с помощью денсиламетра (Erba Lachema) определяют концентрацию холерных вибрионов в бульонных культурах. Все культуры доводят до концентрации 10⁸ м.к./мл.

Второй этап заключается в определении адгезивных свойств холерных вибрионов, для этого в 1 мл среды DMEM с 5% сыворотки эмбриональной бычьей добавляют по 10 мкл стандартизованной взвеси до получения конечной концентрации 10⁶ м.к./мл испытуемых штаммов холерных вибрионов и вносят в пенфлаконы с дисками (диски 12,0 X 0,11 SPL Lifesciences), на которых сформирован разреженный монослой HuTu-80. Инкубируют в течение 90 минут при 37°С в СО₂-инкубаторе (Naure), затем удаляют питательную среду и промывают разреженный монослой дважды раствором Хенкса (рН 7,4) от несвязавшихся с монослоем клеток холерных вибрионов, фиксируют 5% формалином 1 час для соблюдения требований биологической безопасности, высушивают и окрашивают диски по Романовскому - Гимза 1:5 в течение 35-40 минут. Окрашенные диски три раза промывают раствором Хенкса (рН 7,4) достают из флаконов.

Третий этап, учет результатов, включает просмотр дисков под световым микроскопом фирмы Nikon (увеличение 100X10). Просмотр дисков всегда начинают с контроля. Адгезивные свойства бактерий определяют по числу вибрионов, связавшихся со 100 клетками HuTu-80 и рассчитывают индекс адгезии по формуле

где

ИА - индекс адгезии,

∑КБ - суммарное количество клеток бактерий, прикрепившихся к одной клетке линии HuTu-80,

100К - 100 клеток линии HuTu-80.

Оценка индекса адгезии: больше 20 - высокоадгезивный штамм, от 10 до 20 - среднеадгезивный штамм, меньше 10 - низкоадгезивный штамм.

Применение способа для оценки адгезивных свойств холерных вибрионов Vibrio cholerae El Tor и Vibrio cholerae O139 подтверждено в Ростовском противочумном институте (г. Ростов-на-Дону) на 20 штаммах.

Пример

Адгезивные свойства определяли у штаммов холерных вибрионов Vibrio cholerae El Tor 18775, Vibrio cholerae El Tor 18777, Vibrio cholerae O139 17258, выделенных от человека и из объектов окружающей среды и характеризующиеся наличием или отсутствием генов холерного токсина и токсинкорегулируемых пилей адгезии.

Постановку опыта проводят в боксе биологической безопасности (БМБ) II класса. Культуры холерных вибрионов готовят непосредственно перед опытом. Для этого штаммы выращивают на агаре Мартена (рН 7,7) в течение 18 часов, по истечении этого срока засевают одну стандартную петлю (d=2 мм) исследуемой культуры в бульон LB (рН 7,7), выдерживают в термостате при 37°С в течение 3 часов. После этого с помощью денсиламетра (Erba Lachema) определяют концентрацию холерных вибрионов в бульонных культурах. Все культуры стандартизуют до концентрации 10⁸ мк. кл/мл. В 1 мл среды DMEM с 5% эмбриональной бычьей сыворотки добавляют 10 мкл стандартизованной взвеси, получая конечную концентрацию вибрионов 10⁶ м.к./мл. Вносят в пенфлаконы с дисками (диски 12,0 X 0,11 SPL Lifesciences), на которых присутствует разреженный монослой HuTu-80.

Пенфлакон с интактной культурой служит отрицательным контролем. Все пробы инкубируют в CO₂-инкубаторе при 37°С в течение 90 минут. По истечении указанного времени опытные и контрольные образцы отмывают раствором Хенкса рН 7,4 от неприкрепившихся клеток холерных вибрионов и фиксируют 5% формалином 1 час для соблюдения требований биологической безопасности, высушивают и окрашивают диски по Романовскому - Гимза 1:5 в течение 35-40 минут. Окрашенные диски три раза промывают раствором Хенкса рН 7,4, достают из флаконов, высушивают, просматривают под световым микроскопом.

Адгезивные свойства холерных вибрионов определяют по числу вибрионов, связавшихся со 100 клетками HuTu-80, и рассчитывают индекс адгезии по формуле.

Испытуемые штаммы холерных вибрионов отличались по индексу адгезии, который представлен в расчетах и таблице.

Штамм Vibrio cholerae El Tor 18775 ∑КБ=2036.

- высокоадгезивный

Штамм Vibrio cholerae El Tor 18777 ∑КБ=1017.

- среднеадгезивный

Штамм Vibrio cholerae O139 17258 ∑КБ=511.

- низкоадгезивный

Таким образом, способ оценки адгезивных свойств холерных вибрионов Vibrio cholerae El Tor и Vibrio cholerae O139 основан на взаимодействии бактерий с рецепторами, локализованными на клеточной стенки эпителиальных клеток аденокарциномы двенадцатиперстной кашки человека HuTu-80.

Преимущества предлагаемого способа заключаются в том, что используемая культура клеток HuTu-80 стандартна, гомогенна и обладает фиксированным фенотипом, опыты с культурой могут быть многократно повторены, кроме того, возможно прижизненное наблюдение процесса адгезии пи помощи микроскопа, что исключает опыты на животных. Новый способ позволяет изучить исследуемые свойства непосредственно на эпителиальных клетках человека, что дает основание для экстраполяции результатов на организм в целом. При данном способе используются клетки человека, а не животного, что позволяет определить адгезивность бактерий с большей точностью.

Источники информации

1. Саппо С.Г., Урбанович Л.Я., Колесник B.C. «Использование эритроцитов для выявления адгезивной способности вибрионов». Сборник «Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций», Министерство здравоохранения СССР, Иркутск, 1984 г. С. 126 -127.

2. Методические рекомендации по количественной оценке адгезивной активности холерных вибрионов in vitro (Ростов-на-Дону, 1996).