Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММЫ БАКТЕРИЙ РОДОВ Bacillus, Pseudomonas, Rahnella, Serratia, ОБЛАДАЮЩИЕ ФИТОПРОТЕКТОРНОЙ И РОСТОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ, И ПРЕПАРАТ НА ОСНОВЕ ЭТИХ ШТАММОВ

Изобретение относится к биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии и касается получения микробных препаратов на основе смеси штаммов бактерий для оздоровления биоценоза, ускорения разложения лигноцеллюлозы, повышения урожая сельскохозяйственных культур и качества получаемой продукции.

Основу изобретения составляют бактерии Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11986, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11987, Pseudomonas brassicaceamm ВКПМ В-11984, Rahnella aquatilis ВКПМ В-11985, Serratia plymuthica ВКПМ В-12008, обладающие фитопротекторными, целлюлолитическими и ростостимулирующими свойствами, и препарат на основе этих штаммов, снижающий инфекционный фон в период вегетации растений, обеспечивающий оздоровление биоценоза, ускорение разложения соломы и пожнивных остатков, стимулирующий рост и развитие растений.

Известен консорциум молочнокислых, азотфиксирующих и фосфатмобилизующих бактерий, способствующий оздоровлению почвы и позволяющий повысить урожайность на 25-35%, приживаемость растений на 20-40% и качество стандартного посадочного материала (пат. РФ №2127509). Консорциум применяется для предпосевной обработки семян, для прямого внесения в грунт перед посевом или высадкой растений, для обработки вегетирующей части растений или внесения в почву в период роста. Однако отсутствуют данные о способности консорциума снижать численность патогенных микроорганизмов и разлагать растительные остатки в почве.

Известен консорциум азотофиксирующих и фосфатмобилизирующих бактерий Azospirillum sp. и антагониста Bacillus polymixa, способный к разложению целлюлозосодержащих материалов (солома, ксилан, гемицеллюлоза, лигнин) (пат. США №5147441 А). Однако свойства консорциума изучены только в лабораторных условиях, нет данных об эффективности его действия в полевых условиях.

Зарегистрированы и внесены в Список Госхимкомиссии Минсельхоза РФ следующие бактериальные фунгициды на основе бактерий рода Bacillus против болезней различных культур: препарат Интеграл - жидкость на основе штамма Bacillus subtilis 24Д, препарат Фитоспорин-М - порошок на основе штамма Bacillus subtilis 24Д (патент РФ №№2129375, 2129004), препарат Бактофит смачивающийся порошок на основе штамма Bacillus subtilis ИПМ 215 (пат. РФ №2019966). Препарат Бактофосфин (на основе Bacillus mucilaginosus), предназначен для обогащения почвы, а также восстановления ее плодородия, повышения всхожести и урожайности многих видов сельскохозяйственных культур в открытом и защищенном грунте. Микробиологическое удобрение Байкал Эм-1 содержит консорциум представителей различных групп микроорганизмов, в том числе грибов, которые, развиваясь в почве при внесении как симбиотическое сообщество, призваны увеличить численность почвенной микрофлоры и, соответственно, плодородие и урожайность. Однако вышеприведенные препараты обладают недостаточно широким спектром действия.

Известны консорциумы бактерий Bacillus subtilis IC-1435-1-1, Bacillus amyloliquefaciens IC-1436-1-23, Bacillus amyloliquefaciens IC-1437-1-23, Bacillus licheniformis ВКПМ B-10561 (пат. РФ №2482174) и бактерий Bacillus licheniformis IC-831-1-2, Bacillus licheniformis IC-832-1-2, Bacillus licheniformis IC-833-1-2, Bacillus licheniformis IC-834-1-2 (пат. РФ 2440413) обладающие антибактериальной и фунгицидной активностью и обеспечивающие восстановление микробиоценоза почвы. Однако спектр антимикробной активности консорциума в отношении фитопатогенов сельскохозяйственных культур недостаточно широк.

Известен биопрепарат, состоящий из смеси суспензий следующих штаммов, депонированных в ВКПМ: Agrobacterium tumefaciens В-4116, Agrobacterium radiobacter В-956, Azotobacter chroococcum B-2375, Bacillus thurengiensis B-2918, Bacillus subtillis B-6554, Bacillus subtillis B-4419, Bacillus megaterium B-4440, Bacillus megaterium B-200, Bradyrhizobium japonicum B-1978, Ervinia ananas B-5292, Lactobacillus casei B-3961, Pseudomonas fluorescens B-1138, Rhodopseudomonas palustris B-1620. Изобретение позволяет восстановить плодородие почвы и улучшить ее структуру, увеличить всхожесть семян, укрепить иммунную систему растений, повысить сопротивляемость болезням и вредителям, что значительно увеличивает урожайность и качество получаемого продовольствия (пат. РФ №2322061). Однако способ получения препарата на основе 10-13 штаммов довольно трудоемкий: изначально штаммы бактерий выращивают раздельно в течение (36±2) часов при температуре 37°С на питательной среде, оптимальной для каждого штамма, смывают выросшие культуры 9% раствором хлорида натрия и рассчитывают по оптическому стандарту мутности (ОСО 45-28-59-85-П) количество микробных клеток в 1 мл суспензии, затем готовят суспензию каждого штамма в защитной среде, например в сахарозожелатиновой смеси, доводя концентрацию микробных клеток каждой культуры до 1,0-1,5×10⁹ в 1 мл, после чего готовят смесь суспензий штаммов в определенном соотношении.

Известен препарат (пат. РФ №2313941) для защиты растений от возбудителей болезней сельскохозяйственных культур с ростостимулирующим эффектом, включающий культуральную жидкость штаммов микроорганизмов, отличающийся тем, что в качестве культуральной жидкости штаммов микроорганизмов он содержит культуральные жидкости штамма бактерий Bacillus subtilis БАГ-65 и штамма актиномицета Streptomyces sindenensis БАГ-55, а также вспомогательные добавки.

Наиболее близким техническим решением является изобретение (пат. РФ №2482174), которое относится к биотехнологии и защите растений. Штамм бактерий Bacillus subtilis IC-1435-1-1 депонирован в ВКПМ под регистрационным номером В-10641. Штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens IC-1436-1-23 депонирован в ВКПМ под регистрационным номером В-10642. Штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens IC-1437-1-23 депонирован в ВКПМ под регистрационным номером В-10643. Штаммы получены путем селекции и обеспечивают восстановление микробиоценозов почвы, обладают бактерицидной, фунгицидной и вирулицидной активностью. Препарат на основе штаммов содержит наполнитель или воду с биомассой бактерий в споровой форме Bacillus subtilis ВКПМ В-10641, или Bacillus amyloliquefaciens номером ВКПМ В-10642, или Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10643, или их смесью в соотношении 1:1:1 с титром каждого штамма бактерий не менее 1-10⁴ КОЕ/г или 1·10⁴ КОЕ/мл. Препарат обладает бактерицидной и фунгицидной активностью.

Однако данные штаммы также оказывают ограниченное действие, направленное на отдельных возбудителей болезней сельскохозяйственных культур, препарат на их основе не обладает ростостимулирующей активностью, обладает недостаточно широким спектром антагонистической активности и способностью восстановления микробиоценоза почвы до эволюционно нормального. Предложенный биопрепарат не предусмотрен для использования в период вегетации растений и рекомендован только для внесения в почву.

Задачей настоящего изобретения является получение препарата на основе смеси штаммов бактерий с комплексной - фитопротекторной, целлюлолитической и ростостимулирующей - активностью, предназначенного для снижения инфекционного фона в период вегетации растений, а также ускорения разложения соломы и пожнивных остатков, активации микробиоценоза почв и повышения урожайности сельскохозяйственных культур и качества производимой продукции.

Поставленная задача решается за счет использования препарата и следующих штаммов:

1. Штамм бактерий Bacillus. amyloliquefaciens 133, обладающий фитопротекторной активностью и депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ В-11986.

2. Штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens 67, обладающий фитопротекторной активностью и депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ В-11987.

3. Штамм бактерий Pseudomonas brassicacearum S-1, обладающий ростостимулирующей активностью и депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ B-11984.

4. Штамм бактерий Rahnella aquatilis Е 101, обладающий ростостимулирующей активностью и депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ В-11985.

5. Штамм бактерий Serratia plymuthica 53, обладающий ростостимулирующей активностью и депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ В-12008.

6. Препарат для защиты растений от возбудителей болезней сельскохозяйственных культур, обладающий фитопротекторными, целлюлолитическими и ростостимулирующими свойствами, включающий культуральную жидкость смеси штаммов бактерий. При этом в качестве культуральной жидкости штаммов бактерий он содержит культуральные жидкости штаммов бактерий Bacillus amyloliquefaciens 133 ВКПМ В-11986, Bacillus amyloliquefaciens 67 ВКПМ В-11987, Pseudomonas brassicacearum S-1 ВКПМ В-11984, Rahnella aquatilis Е 101 ВКПМ В-11985, Serratia plymuthica ВКПМ В-12008, в соотношении 1:1:1:1:1 с титром каждого штамма бактерий не менее 1×10⁹ КОЕ в 1 см³.

Технический результат, который может быть получен при использовании предлагаемых объектов, заключается в оздоровлении биоценоза, ускорении разложения лигноцеллюлозы, повышении урожайности сельскохозяйственных культур и качества получаемой продукции.

Культуры, составляющие смесь штаммов бактерий, выделены из почвы, а также из образцов, отобранных из компостных ям и из рубца домашней козы, идентифицированы с использованием микроскопических, биохимических, молекулярно-генетических методов исследования и переданы на хранение в ВКПМ под номерами: В. amyloliquefaciens ВКПМ В-11986, В. amyloliquefaciens ВКПМ В-11987, P. brassicasearum ВКПМ В-11984, R. aquatilis ВКПМ В-11985, S. plymuthica ВКПМ В-12008.

Культурально-морфологические признаки штаммов, входящих в заявляемый состав

Культуральные признаки при поверхностном культивировании на ΜΠΑ: штаммы В. amyloliquefaciens ВКПМ В-11986 и В. amyloliquefaciens ВКПМ В-11987 образуют круглые колонии сероватого цвета, с ровным краем, 3-5 мм в диаметре, слизистые, приподнятые у молодой культуры и шероховатые, плоские у стареющей; штамм P. brassicasearum ВКПМ В-11984 - мелкие, выпуклые, прозрачные колонии с ровным краем, флюоресцирующие при УФ-освещении; штамм R. aquatilis ВКПМ В-11985 - гладкие, серовато-белые, выпуклые, полупрозрачные с ровными краями колонии, диаметр колоний 2-4 мм, профиль выпуклый; штамма S. plymuthica ВКПМ В-12008 - кремового цвета, круглые слизистые, непрозрачные, блестящие, выпуклые, край колоний ровный. Все указанные штаммы не являются зоопатогенными и фитопатогенными.

Морфологические признаки

Вегетативные клетки В. amyloliquefaciens ВКПМ В-11986 подвижные, представляют собой палочки бациллярной формы размером 0,8×1,2-1,5 мкм с округлыми концами. Споры эллипсовидные, расположены центрально или субтерминально. Спорангиум не раздут.Клетки расположены одиночно, в парах или коротких цепочках. Окраска по Граму положительная.

Вегетативные клетки В. amyloliquefaciens ВКПМ В-11987 подвижные, представляют собой палочки бациллярной формы размером 0,8×1,2-1,5 мкм с округлыми концами. Споры эллипсовидные, расположены центрально или субтерминально. Спорангиум не раздут. Клетки расположены одиночно, в парах или коротких цепочках. Окраска по Граму положительная.

Клетки P. brassicasearum ВКПМ В-11984: прямые или слабо изогнутые палочки 0,6-0,7*1,3-2,3 мм, одиночные, в парах, реже в коротких цепочках. Грамотрицательные.

Клетки S. plymuthica ВКПМ В-12008 грамотрицательные прямые палочки, размером 0,5-0,8×0,9-2,0 мкм. Аспорогенны.

Клетки R. aquatilis ВКПМ В-11985 грамотрицательные палочки размером 0,3-0,4×0,6-1,2 мкм. Аспорогенны. Характер жгутикования перитрихальный.

Основным свойством смеси штаммов является наличие фитопротекторной, целлюлолитической и ростостимулирующей активностей.

Антимикробная активность установлена в отношении фитопатогенных грибов родов Fusarium, Alternaria, Botrytis, Sclerotinia, Rhizoctonia и фитопатогенных бактерий родов Pseudomonas, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia методом лунок на чашках Петри, при этом зоны подавления роста фитопатогенов составляют 18-27 мм в диаметре.

Смесь штаммов бактерий характеризуется продукцией гидролитических ферментов: эндо-1,4-β-глюканазы (0,8-1,5 ед/мл), ксиланазы (1,5-3,0 ед/мл), протеазы (10,0-12,0 ед/мл).

Использование смеси штаммов бактерий обеспечивает фиксацию молекулярного азота в пределах 81-120,2 нМ С₂Н₄/фл./сут, ускоряет солюбилизацию фосфатов кальция (диаметр зон растворения Са₃(PO₄)₂ - 10-16 мм).

Благодаря перечисленным свойствам обеспечивается ростостимулирующая активность смеси штаммов, например: всхожесть семян салата при обработке 2% рабочим раствором увеличивается на 5-9%, вес сырой массы - на 9%, длина надземной части растений - на 10-20%, длина корня - на 10-25%.

Штаммы-продуценты, входящие в состав препарата, являются непатогенными и безвредными для теплокровных животных, не обладают токсичностью, аллергенностью и токсигенными свойствами.

Пример 1. Получение препарата

Культивирование каждого штамма бактерий В. amyloliquefaciens ВКПМ В-11986, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11987, P. brassicacearum ВКПМ В-11984, R. aquatilis ВКПМ В-11985 и S. plymuthica ВКПМ В-12008 осуществляется по отдельности на питательных средах, состав которых приведен в таблице 1. Условия культивирования следующие: интенсивность аэрации 1,0 л воздуха/л среды/мин, скорость вращения мешалки составляет (200±20) об./мин, температура 30°С. Продолжительность культивирования - 48 часов.

Культуральные жидкости бактерий, содержащие живые бактериальные клетки, их споры и метаболиты, полученные при раздельном культивировании штаммов-продуцентов, смешивают в равных соотношениях (1:1:1:1:1).

Основные показатели готового препарата приведены в таблице 2.

Пример 2. Влияние препарата на целлюлолитическую активность почвы и степень разложения соломы и стерни в модельных и модельно-полевых условиях

Изучение целлюлолитической активности почвы под воздействием заявляемого препарата проводилось в течение одного месяца аппликационным методом. Для этого 1,2 кг дерново-подзолистой супесчаной почвы (рН 5,7-6,0, гумус - 2,20-2,56%, подвижные формы P₂O₅ - 133-160 мг/кг, K₂O - 135-161 мг/кг), содержащей пластины с льнополотном, обрабатывали 100 мл 2%-ного рабочего раствора препарата. В качестве контроля использовали почву, обработанную водой. Внесение препарата в почву обеспечивает за 1 месяц разложение льнополотна на 93,67% и увеличивает целлюлолитическую активность почвы на 33,67% по сравнению с контролем.

Для анализа деструкции целлюлозы под воздействием препарата 5 г соломы помещали в контейнер, увлажняли стерильной дистиллированной водой в количестве 5 мл, накрывали крышкой с отверстиями для аэрации и оставляли на сутки. Далее, обрабатывали из опрыскивателя солому рабочим раствором препарата объемом 390 мкл на каждый контейнер, добавляли 300 г просеянной земли без растительных остатков, перемешивали и еще раз увлажняли 10 мл стерильной дистиллированной водой. Рабочий раствор заявляемого препарата - 500 мкл на 100 мл стерильной дистиллированной воды, а эталона (препарата на основе гриба Trichoderma, мицелиальная форма) - 100 мкл на 100 мл стерильной дистиллированной воды. (При расчете концентрации рабочего раствора препаратов исходили из количества сухой биомассы в препаратах). Условия проведения опыта: температурный режим - 22-24°С, влажность 60%. Через 30 дней проводилась обработка результатов. Для этого землю просеивали через сита разных по диаметру ячеек - №2, 5 мм - 1 мм. Солому собирали в крафт-пакеты и сушили в сушильном шкафу при 50°С в течение 8 часов (до неизменной остаточной сухой массы). Результаты приведены в таблице 3.

В результате опыта по разложению соломы лучшие показатели получены в варианте с заявляемым препаратом, использование которого повышает разложение соломы в 4 раза по сравнению с контролем и в 2 раза по сравнению с эталоном.

Модельно-полевые опыты по изучению влияния препарата на темпы разложения соломы озимой тритикале и пожнивно-корневых остатков кукурузы проводили на дерново-подзолистой супесчаной почве (рН - 5,87, гумус - 2,39%, 145 мг/кг почвы, Р₂О₅ и 147 мг/кг почвы) следующим образом: в емкость помещали 1,0 кг почвы (в пересчете на воздушно-сухую) и 25 г (в пересчете на стандартную влажность - 16%) соломы озимой тритикале и пожнивно-корневые остатки кукурузы, тщательно перемешивали почву с растительными остатками, после чего обрабатывали 2% рабочими растворами препарата, переносили в мешочки из стеклоткани размером 25×40 см. Глубина заделки мешочков - 10-15 см. Время проведения эксперимента - 2 месяца. Обработка результатов проводилась аналогично предыдущему эксперименту.

На основании результатов исследований (см. таблицу 4) установлено, что применение препарата положительно влияет на увеличение темпов протекания деструкционных процессов, обеспечивая усиление степени минерализации соломы на 7% и стерни на 5% относительно контроля, при этом скорость минерализации достигает 0,32%/сут. и 0,46%/сут., что в 1,7 и 1,3 раза превышает аналогичный показатель по соломе и стерне в контроле.

Таким образом, установлена способность препарата повышать целлюлолитическую активность почвы и ускорять разложение соломы и стерни в лабораторных и модельно-полевых условиях.

Пример 3. Влияние препарата на микробиологическую активность почвы

Использование препарата для обработки почвы после запашки соломы стимулирует жизнедеятельность почвенных микроорганизмов, повышая биогенность почвы в 2,2 раза (44,86 млн. КОЕ/г) по сравнению с контролем (19,77 млн. КОЕ/г).

Одним из показателей интенсификации минерализационных процессов в почве может быть соотношение бактерий, усваивающих органический и минеральный азот. В почвах с более энергичным процессом минерализации микроорганизмы, усваивающие минеральный азот, обычно превышают по численности микрофлору, развивающуюся за счет органического азота. Нами установлено, что коэффициент минерализации при использовании заявляемого препарата в 2 раза превышает контрольные показатели, что аналогично действию эталона, коэффициент минерализации которого в 2,2 раза превышает контроль (таблица 5).

Таким образом, заявляемый препарат при внесении в почву, содержащую свежее органическое вещество, положительно влияет на увеличение общего микробного числа почвы и приводит к интенсификации минерализационных процессов.

Пример 4. Фитопротекторный и ростостимулирующий эффекты препарата при обработке семян сахарной свеклы, гибрид Портланд.

В течение последних вегетационных сезонов широкое распространение и развитие имели следующие болезни сахарной свеклы: сосудистый бактериоз, вызывающий полную потерю тургора корнеплода; вирусная желтуха; вирусная мозаика, развившаяся в конце вегетации. Для изучения фитопротекторного и ростостимулирующего действия препарата обработку свеклы проводили по схеме, приведенной в таблице 6. Опыт заложен в 3-х повторениях на опытных делянках площадью 600,0 м². Результаты приведены в таблицах 7, 8.

Заявляемый препарат снижает распространенность бактериозов на посевах сахарной свеклы до 56%, биологическая эффективность препарата составляет 44,4%, что несколько превышает показатели химического препарата «Кагатник» и практически в 2 раза превосходит биологический эталон.

Наряду с высоким фитопротекторным эффектом заявляемый препарат положительно влияет на густоту стояния сахарной свеклы, увеличивая ее до 56,3 тыс. шт./га, что на 39% выше, чем в контроле.

Кроме того, при использовании заявляемого препарата наблюдается улучшение качественных и количественных характеристик урожая сахарной свеклы. Так, под воздействием препарата происходит повышение сахаристости корнеплодов, что увеличивает сбор сахара с 1 га посевов на 4%, с 5,35 т в контроле до 5.56 т в обработанном варианте. Урожайность при этом возрастает на 13% по сравнению с контролем и на 4% по сравнению с химическим и биологическим эталонами.

Таким образом, заявляемый препарат оказывает высокий фитопротекторный эффект против бактериозов сахарной свеклы во время вегетации и улучшает качественные и количественные характеристики урожая.

Пример 5. Обеззараживание семян яровой пшеницы

Проведена оценка фунгицидной активности заявляемого препарата в отношении фитопатогенных грибов Bipolaris sp., Fusarium sp., Alternaria sp. и других возбудителей гнилей яровой пшеницы. Для этого семена яровой пшеницы с. Тулеевская обрабатывали из расчета 0,25 л препарата на 1 т семян. Исходная зараженность семян, установленная в лаборатории фитоиммунологии и защиты растений Курганского государственного университета (г. Курган), приведена в таблице 9. Лабораторные испытания показали, что обработка семян приводит к практически полному подавлению возбудителей фузариозно-гельминтоспориозной корневой гнили (Таблица 9).

Энергетическая оценка выращивания пшеницы в условиях обеззараживания семян биологическими препаратами приведена в таблице 10.

Таким образом, показан высокий фитопротекторный эффект заявляемого препарата при протравливании семян яровой пшеницы.

Пример 6. Обработка вегетирующих растений озимой пшеницы

Место проведения полевых исследований: второй агроклиматический район - центральная часть Рязанской области. Культура: озимая пшеница, сорт Галина. Почва на опытном участке: темно-серая лесная тяжелосуглинистая. Содержание гумуса 3,2%; гидролитическая кислотность 2,5-4,7 мг·экв; рН солевой вытяжки 5,2. Предшественник: ячмень.

Способ применения - опрыскивание растений. Расход рабочей жидкости: 300 л/га. Кратность обработок: однократная. Схема опыта приведена в таблице 11.

Хозяйственная эффективность (сохраненный урожай в ц/га, в % к контролю и эталону) по вариантам представлена в таблице 12.

Установлено, что применение заявляемого препарата способствует прибавке к урожаю 4,2 ц/га, что на 17% превышает контрольные показатели, на 10,4% - показатели эталона и соответствует действию прототипа, применяемого для обработки почвы совместно со стартовыми дозами азотных удобрений.