КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ И СПОСОБ ОЦЕНКИ НЕВОСПРИИМЧИВОСТИ К ЛЕЧЕНИЮ

Настоящее изобретение относится к способу и набору для определения резистентности субъекта к лечению 2,2-диметил-N-((S)-6-оксо-6,7-дигидро-5Н-дибензо[b,d]-азепин-7-ил)-N'-(2,2,3,3,3-пентафторпропил)малонамидом. Изобретение также относится к комбинированной терапии для лечения пациента, страдающего от пролиферативного заболевания, включающей прием 2,2-диметил-N-((S)-6-оксо-6,7-дигидро-5Н-дибензо[b,d]-азепин-7-ил)-N'-(2,2,3,3,3-пентафторпропил)малонамида и по меньшей мере одного из агентов, выбранного из анти-IL6 и анти-IL8.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Белок Notch - это трансмембранный белок, присутствующий в большинстве организмов, включая млекопитающих, и принимающий участие в экспрессии регуляторных генов. При связывании лиганда с внеклеточным доменом Notch, белок Notch расщепляется только с внешней стороны мембраны при помощи фактора некроза опухоли-альфа - конвертирующего фермента (ТАСЕ), высвобождающего внеклеточный домен, который сохраняет взаимодействие с лигандом. Далее гамма-секретаза расщепляет белок с внутренней стороны мембраны, высвобождая внутриклеточный домен (известный как активный внутриклеточный домен Notch или «ICN»). ICN транспортируется в клеточные ядра и активирует фактор транскрипции CSL, таким образом индуцируя транскрипцию генов.

Нарушение Notch сигналинга приводит к возникновению различных заболеваний, включая пролиферативные заболевания. Поэтому ингибирование Notch сигналинга представляет значительный интерес для онкологии. Ингибирование гамма-секретазы блокирует сигнальный путь Notch, благодаря чему ингибиторы гамма-секретазы обладают анти-пролиферативной активностью.

2,2-диметил-N-((8)-6-оксо-6,7-дигидро-5Н-дибензо[b,d]-азепин-7-ил)-N-(2,2,3,3,3-пентафторпропил)малонамид (далее - Соединение I) является сильным и селективным ингибитором гамма-секретазы, ингибирующим Notch сигналинг в опухолевых клетках. Известно, что ксенографты, на которые воздействовали Соединением I, показывают уменьшение экспрессии генов, связанных с ангиогенезом, согласующееся со способностью Соединения I ингибировать опухолевый ангиогенез (Luistro et al., Cancer Research, 69:7672-80 (2009). Интересно отметить, что эти исследования показали небольшое изменение в ангиогенном генном профиле для ксенографта Н460а.

Интерлейкин-6 (IL6) и интерлейкин-8 (IL8) - это сильные цитокины, которые играют важные роли в таких разных заболеваниях, как инфекционные болезни, болезни иммунитета, воспалительные, аутоиммунные заболевания и рак. Заявители обнаружили, что повышенная экспрессия каждого из упомянутых интерлейкинов: IL6 и IL8, дает устойчивость к лечению Соединением I.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу определения резистентности субъекта к лечению с использованием 2,2-диметил-N-((S)-6-оксо-6,7-дигидро-5Н-дибензо[b,d]-азепин-7-ил)-N'-(2,2,3,3,3-пентафторпропил)малонамида, включающему измерение уровня биомаркера, присутствующего в биологическом образце, полученном у упомянутого субъекта, где упомянутый биомаркер представляет собой IL6 или IL8.

Настоящее изобретение также относится к набору, предназначенному для определения резистентности субъекта к лечению с использованием 2,2-диметил-N-((S)-6-оксо-6,7-дигидро-5Н-дибензо[b,d]-азепин-7-ил)-N'-(2,2,3,3,3-пентафторпропил)малонамида, где набор включает агент для определения биомаркера, представляющего собой IL6 или IL8.

Настоящее изобретение далее относится к способу лечения пациента, страдающего от пролиферативного заболевания, включающего введение пациенту: А) Соединения I и Б) анти-IL6 агента или анти-11.8 агента.

Настоящее изобретение далее относится к комбинации, предполагающей последовательное или одновременное введение А) Соединения I и Б) анти-IL6 агента и/или анти-И8 агента, для использования в качестве медикамента, в частности, медикамента для лечения пролиферативного заболевания, такого как рак, предпочтительно солидных опухолей, наиболее предпочтительно опухолей молочной железы, кишечника, легких и предстательной железы.

Настоящее изобретение далее относится к набору, содержащему: А) Соединение I и Б) анти-IL6 агент или анти-IL8 агент.

Настоящее изобретение далее относится к применению комбинации А) Соединения I и Б) анти-IL6 агента и/или анти-IL8 агента для производства медикамента для лечения пролиферативного заболевания, в частности рака, предпочтительно солидных опухолей, таких как опухоль молочной железы, кишечника, легких и предстательной железы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фигура 1 демонстрирует результаты анализа цитокинов, проведенного с использованием клеточных линий NCI-H460a и А549.

Фигура 2 показывает количество IL6 и IL8, секретируемых в различных клеточных линиях, измеренное с использованием метода ELISA.

Фигура 3 показывает количество мРНК, кодирующей IL6 и IL8 в различных клеточных линиях, измеренное с использованием qRT-PCR.

Фигура 4 показывает измеренное с использованием метода ELISA количество IL6 и IL8, секретируемых в клетках Н460а; родительских клетках А549; контрольных клетках А549; клетках А549, сверхэкспрессирующих IL6, и в клетках А549, сверхэкспрессирующих IL8.

Фигура 5 демонстрирует эффект применения Соединения I и эффект применения Таксола на рост опухоли в ксенографтных моделях, полученных в клетках Н460а; родительских клетках А549; контрольных клетках А549; клетках А549, сверхэкспрессирующих IL6; клетках А549, сверхэкспрессирующих IL8 и в смеси 1:1 клеток А549, сверхэкспрессирующих IL6, и клеток А549, сверхэкспрессирующих IL8.

Фигура 6 показывает количество мРНК, кодирующей IL8, и количество секретируемого IL8, измеренного в родительских клетках Н460а; клетках Н460а, в которые был введен контрольный вектор, и клетках Н460а с нокдауном гена IL8.

Фигура 7 демонстрирует эффект применения Соединения I на рост опухоли в ксенографтных моделях, полученных в клетках Н460а и Н460а с нокдауном гена IL8.

Фигура 8 демонстрирует эффект применения Соединения I, антитела против IL8 и комбинированной терапии, включающей Соединение I и антитело против IL8, на рост опухоли в ксенографтных моделях, полученных в клетках Н460а.

Фигура 9 демонстрирует эффект влияния Соединения I, антитела против IL6 и комбинированной терапии, включающей Соединение I и антитело против IL6, на рост опухоли в ксенографтных моделях, полученных в клетках Н460а.

Фигура 10 показывает уровни мРНК, кодирующих IL6 и IL8, в различных клеточных линиях, измеренные при помощи qRT-PCR.

Фигура 11 показывает уровни IL6 и IL8, секретируемых в различных клеточных линиях, измеренные с использованием ELISA.

Фигура 12 демонстрирует даунрегуляцию Hesl мРНК в U87MG и LOX клетках после обработки Соединением I.

Фигура 13 демонстрирует влияние применения Соединения I на рост опухоли в U87MG и LOX клетках.

Фигура 14 показывает количества секретируемых IL6 и IL8, измеренные при помощи ELISA, в клетках Н460а; в клетках Н460а, обработанных Соединением I; в клетках Н460а с нокдауном по IL8; в клетках Н460а с нокдауном по IL8; обработанных Соединением I, в клетках U87MG и в клетках U87MG, обработанных Соединением I.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

Если не утверждается иное, нижеследующие термины, использованные в данной заявке, включая описание и формулу изобретения, имеют определения, данные ниже. Следует заметить, что в описании и приложенной формуле изобретения формы единственного числа также включают формы множественного числа, если из контекста однозначно не следует иное.

В контексте настоящего изобретения термин «Соединение I» относится к 2,2-диметил-N-((8)-6-оксо-6,7-дигидро-5Н-дибензо[b,d]-азепин-7-ил)-N'-(2,2,3₁3,3-пентафторпропил)малонамиду, который полезен в качестве ингибитора гамма-секретазы. Соединение I имеет следующую структуру:

Термин «биомаркер» означает объективно измеряемый объект, который служит индикатором биологического состояния.

Термин «биологический образец» означает порцию (например, крови, сыворотки, ткани, мокроты, мочи, слюны), полученную у субъекта, в которой может быть определено количество биомаркера.

Термин «уровень» в отношении к биомаркеру означает показатель концентрации, активности, уровня экспрессии или количества присутствующего биомаркера. Уровень может быть определен количественно, например, путем измерения концентрации или массы биомаркера, присутствующего в образце, или путем определения количества мРНК, кодирующей биомаркер, который экспрессируется в соответствующей клеточной популяции или ткани. Или же уровень может быть определен в большей степени качественно, например, как находящийся выше или ниже установленного порогового уровня. Пороговый уровень может соответствовать среднему уровню биомаркера у здоровых субъектов, или уровню, при котором делается вывод о диагнозе заболевания. Говорят, что присутствует повышенный уровень биомаркера, если измеренный уровень превышает установленный пороговый уровень.

Термин «субъект» включает млекопитающих и птиц. «Млекопитающие» означают любого члена класса млекопитающих, включая, но не ограничиваясь следующими: человек; приматы, не являющиеся человеком, такие как шимпанзе и другие человекообразные, и прочие обезьяны; сельскохозяйственные животные, такие как крупный рогатый скот, лошади, овцы, козы и свиньи; домашние животные, такие как кролики, собаки и кошки; лабораторные животные, включая грызунов, таких как крысы, мыши и морские свинки, и им подобные. Термин «субъект» не указывает на определенный возраст или пол.

В контексте настоящего изобретения термин «фармацевтически приемлемый носитель» указывает, что данный носитель не обладает свойствами, которые могут вынудить практикующего врача, действующего с разумной предусмотрительностью, избегать назначения его пациенту, принимая во внимание заболевание или состояние, требующее лечения, и соответствующий способ введения.

В контексте настоящего изобретения термин «терапевтически эффективное» означает количество соединения, комбинации или композиции, которое является эффективным для получения желаемого терапевтического эффекта при приеме его пациентом, например, для задержки роста, сокращения раковой опухоли или увеличения продолжительности жизни пациента.

Термины «клеточное пролиферативное заболевание» и «пролиферативное заболевание» означают заболевания, которые связаны с некоторой степенью аномальной клеточной пролиферации. В одном из вариантов осуществления изобретения пролиферативное заболевание - это рак.

Термин «рак» или «раковый» означает или описывает физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым клеточным ростом/пролиферацией. Примеры рака включают, но не ограничиваются ими: рак кишечника, меланому, рак щитовидной железы.

«Ингибирование клеточного роста или пролиферации» означает уменьшение роста клеток или пролиферации на по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 100%, и включает индукцию клеточной смерти.

Фраза «значительно преобразован» или «значительно отличается» в контексте настоящего изобретения означает достаточно высокую степень различия между двумя численными значениями (как правило, одно связано с исследуемой молекулой, а другое с контрольной/сравниваемой молекулой), такую, что любой специалист в данной области техники сочтет различие между двумя величинами статистически значимым в контексте биологических характеристик, измеряемых посредством этих величин.

Термин «опухоль» относится к росту и пролиферации неопластических клеток, как злокачественных, так и доброкачественных, и всем предраковым и раковым клеткам и тканям. Термин «рак», «раковый», «клеточное пролиферативное заболевание», «пролиферативное заболевание» и «опухоль» в контексте настоящего изобретения не являются взаимоисключающими.

Методы определения резистентности

Настоящее изобретение относится к способу определения резистентности субъекта к лечению 2,2-диметил-N-((S)-6-оксо-6,7-дигидро-5Н-дибензо[b,d]-азепин-7-ил)-N'-(2,2,3,3,3-пентафторпропил)малонамидом (далее - «Соединение I»), включающему измерение уровня биомаркера, присутствующего в биологическом образце, полученном у упомянутого субъекта, где упомянутый биомаркер представляет собой IL6 или IL8.

В одном из примеров осуществления изобретения уровень биомаркера, присутствующего в образце, сравнивают с пороговым уровнем упомянутого биомаркера, и если он превышает этот уровень, то упомянутый субъект считается имеющим in vivo резистентность к лечению Соединением I. Для удобства, при включении в пункты формулы изобретения «in vivo резистентность» означает «уменьшение эффективности действия in vivo при лечении Соединением I».

В следующем примере осуществления изобретения биомаркер представляет собой IL6 и упомянутый пороговый уровень для IL6 составляет около 500 пг/мл.

В следующем примере осуществления изобретения биомаркер представляет собой IL8 и упомянутый пороговый уровень для IL8 составляет около 50 пг/мл.

Уровень биомаркера может быть определен как на основании измерения количества самого белка, так и соответствующей ему мРНК.

Количество белков может быть измерено напрямую, посредством физико-химических методов, таких как гель-электрофорез, ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография), масс-спектрометрия и протеомные методы; методами иммунологического анализа, такими как ELISA, конкурентными, «сэндвичевыми» и т.п.; и путем измерения биологической активности (например, лиганда и/или фермента), а также путем измерения биологической активности образца методами, известными из уровня техники, с использованием двухгибридных систем, и аналогичными им. Для многих или даже большинства упомянутых выше биомаркеров доступны коммерческие методы анализа, или методы анализа, описанные в уровне техники. Подходящие биологические образцы включают кровь, сыворотку, мочу и т.п.

Альтернативным образом можно измерять уровень мРНК, который соответствует вышеупомянутым белковым биомаркерам. Определение уровня транскрипции мРНК может быть проведено с использованием любого подходящего количественного или полуколичественного метода, включая в том числе: Нозерн-блот; микроэррей, RT-PCR (полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой), qRT-PCR (количественная полимеразная цепная реакция в режиме реального времени) и другие количественные и полуколичественные методы амплификации ДНК и мРНК и им подобные. Например, проводя RT-PCR, можно выделить общую РНК в биологическом образце, обработать ее ДНКазой I и превратить в кДНК, используя обратную транскриптазу, такую как обратную транскриптазу Multiscribe™ (Applied Biosystems Inc., Foster City, Calif.). Затем может быть проведена "SYBR green" количественная ПЦР в режиме реального времени с использованием кДНК в качестве матрицы, и проведен анализ с использованием ABI PRISM 7900 Sequence Detector.

В одном из примеров осуществления изобретения субъект является млекопитающим, например человеком.

В одном из примеров осуществления изобретения измеряемый биомаркер представляет собой IL6.

В одном из примеров осуществления изобретения измеряемый биомаркер представляет собой IL8.

В одном из примеров осуществления изобретения биологический образец представляет собой кровь.

В одном из примеров осуществления изобретения биологический образец представляет собой сыворотку.

В одном из примеров осуществления изобретения биологический образец представляет собой мочу.

В одном из примеров осуществления изобретения биомаркер измеряется путем определения количества белка, присутствующего в упомянутом образце.

В одном из примеров осуществления изобретения биомаркер измеряется путем определения уровня мРНК, кодирующей биомаркер.

Набор для определения резистентности

Настоящее изобретение также относится к набору для определения резистентности (устойчивости, невосприимчивости) субъекта к лечению 2,2-диметил-N-((S)-6-оксо-6,7-дигидро-5Н-дибензо[b,d]-азепин-7-ил)-N'-(2,2,3,3,3-пентафторпропил)малонамидом, где набор включает агент для определения биомаркера, представляющего собой IL6 или IL8, в биологическом образце, полученном у субъекта.

Комбинированная терапия

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения пациента, страдающего от пролиферативного заболевания, который включает введение пациенту А) Соединения I и Б) анти-IL6 агента или анти-IL8 агента. В одном из примеров осуществления настоящего изобретения вводится как анти-IL6 агент, так и анти-IL8 агент.

Настоящее изобретение также относится к комбинации, предполагающей последовательное или одновременное введение А) Соединения I и Б) анти-IL6 агента или анти-IL8 агента, для использования в качестве медикамента, в частности, медикамента для лечения пролиферативного заболевания, такого как рак, предпочтительно солидных опухолей, наиболее предпочтительно опухолей молочной железы, кишечника, легких и предстательной железы.

Под лечением пролиферативного заболевания следует понимать в том числе сохранение или сокращение размера опухоли, включая регрессию опухоли (частично или полностью), ингибирование роста опухоли и/или увеличение продолжительности жизни пациента, страдающего от упомянутого заболевания.

Настоящее изобретение также относится к набору, включающему: А) Соединение I и Б) анти-IL6 агент или анти-IL8 агент. В одном из примеров осуществления настоящего изобретения набор включает как анти-IL6 агент, так и анти-IL8 агент.

В одном из примеров осуществления изобретения пролиферативное заболевание представляет собой солидную опухоль.

В следующем примере осуществления изобретения солидная опухоль выбирается из группы, включающей опухоли: мозга, печени, предстательной железы, яичника, поджелудочной железы, кожи, молочной железы, кишечника и легких.

В следующем примере осуществления изобретения солидная опухоль выбирается из группы, состоящей из: молочной железы, кишечника, легких и предстательной железы.

В одном из примеров осуществления изобретения анти-IL6 агент вводится в количестве, эффективном для снижения уровня IL6 у пациента.

В одном из примеров осуществления изобретения анти-IL8 агент вводится в количестве, эффективном для снижения уровня IL8 у пациента.

В одном из примеров осуществления изобретения анти-IL6 агент представляет собой антитело против IL6.

В следующем примере осуществления изобретения анти-IL8 агент представляет собой антитело против IL8.

В одном из примеров осуществления изобретения анти-IL6 агент представляет собой нуклеиновую кислоту, которая препятствует экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей IL6. Нуклеиновая кислота, которая препятствует экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей IL6, может быть, например, антисмысловой РНК. Также она может представлять собой shPHK или siPHK.

В следующем примере осуществления изобретения анти-IL8 агент представляет собой нуклеиновую кислоту, которая препятствует экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей IL8. Нуклеиновая кислота, которая препятствует экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей IL6, может быть, например, антисмысловой РНК. Также она может представлять собой shPHK или siPHK.

В одном из вариантов осуществления способа по настоящему изобретению, Соединение I вводится в количестве, терапевтически эффективном для лечения пролиферативного заболевания. Это количество может составлять, например, от приблизительно 400 нг-час/мл до приблизительно 9000 нг-час/мл, от приблизительно 1100 нг-час/мл до приблизительно 4100 нг-час/мл, от приблизительно 1380 нг-час/мл до приблизительно 2330 нг-час/мл. В вариантах настоящего изобретения Соединение I может вводиться в количестве от приблизительно 400 нг-час/мл до приблизительно 9000 нг-час/мл в течение периода времени, достигающего приблизительно 21 дня, в количестве от приблизительно 1380 нг-час/мл до приблизительно 2330 нг-час/мл в течение периода времени, достигающего приблизительно 21 дня.

В одном из вариантов осуществления способа по настоящему изобретению, Соединение I вводится один раз в день в 1, 2, 3, 8, 9 и 10 дни 21-дневного цикла. В другом варианте введение может осуществляться один раз в день с 1 по 7 дни 21-дневного цикла. Еще в одном варианте введение может осуществляться ежедневно, 1 раз в сутки.

В одном из вариантов способа и набора по настоящему изобретению Соединение I может находиться в виде фармацевтической композиции, представляющей собой пероральную дозированную форму, состоящую из дискретных единиц.

В одном из вариантов способа по настоящему изобретению пациент дополнительно получает радиотерапию.

В одном из вариантов способа по настоящему изобретению Соединение I вводится один раз в день в 1, 2, 3, 8, 9 и 10 дни 21-дневного цикла в количестве от приблизительно 400 нг-час/мл до приблизительно 9000 нг-час/мл.

В одном из вариантов способа по настоящему изобретению Соединение I вводится один раз в день с 1 по 7 день 21-дневного цикла в количестве от приблизительно 400 нг-час/мл до приблизительно 9000 нг-час/мл.

В одном из вариантов настоящего изобретения антитело против IL6 вводится в количестве, эффективном для сокращения уровня IL6 у пациента.

В одном из вариантов способа по настоящему изобретению антитело против IL6 вводится в количестве от приблизительно 1 до приблизительно 100 мг/кг дважды в неделю.

В одном из вариантов способа по настоящему изобретению антитело против IL6 вводится в количестве от приблизительно 1 до приблизительно 50 мг/кг дважды в неделю.

В одном из вариантов способа по настоящему изобретению антитело против IL6 вводится в количестве от приблизительно 10 до приблизительно 30 мг/кг дважды в неделю.

В одном из вариантов способа по настоящему изобретению антитело против IL6 вводится в количестве около 20 мг/кг дважды в неделю.

В одном из вариантов настоящего изобретения антитело против IL8 вводится в количестве, эффективном для сокращения уровня IL8 у пациента.

В одном из вариантов способа по настоящему изобретению антитело против IL8 вводится в количестве от приблизительно 1 до приблизительно 100 мг/кг дважды в неделю.

В одном из вариантов способа по настоящему изобретению антитело против IL8 вводится в количестве от приблизительно 1 до приблизительно 50 мг/кг дважды в неделю.

В одном из вариантов способа по настоящему изобретению антитело против IL8 вводится в количестве от приблизительно 10 до приблизительно 30 мг/кг дважды в неделю.

В одном из вариантов способа по настоящему изобретению антитело против IL8 вводится в количестве около 20 мг/кг дважды в неделю.

В одном из вариантов настоящего изобретения анти-IL6 shPHK вводится в количестве, эффективном для сокращения уровня IL6 у пациента.

В одном из вариантов настоящего изобретения анти-IL8 shPHK вводится в количестве, эффективном для сокращения уровня IL8 у пациента.

В одном из вариантов настоящего изобретения анти-IL6 siPHK вводится в количестве, эффективном для сокращения уровня IL6 у пациента.

В одном из вариантов настоящего изобретения анти-IL8 siPHK вводится в количестве, эффективном для сокращения уровня IL8 у пациента.

В зависимости от потребностей пациента и его реакции на лечение дозировки Соединения I, анти-IL6 агента и/или анти-IL8 агента могут быть скорректированы лечащим врачом в сторону снижения или увеличения по сравнению с приведенными здесь.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры приведены с целью облегчить специалистам в данной области понимание настоящего изобретения и предоставить возможность оценить его практическую сторону. Они не должны рассматриваться, как ограничивающие изобретение, а только как представляющие и иллюстрирующие его.

Пример 1

Данный пример демонстрирует ответ различных ксенографтных моделей на лечение с использованием Соединения I.

Были использованы самки мышей nu/nu, полученные из Charles River Laboratories (Wilmington, MA), или мышей SCID-beige (Taconic, Germantown, NY), в возрасте 7-14 недель, весом приблизительно 23-25 г, разделенные на группы по 10 животных. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколом, одобренным Roche Animal Care и Use Committee (RACUC).

Человеческие раковые клеточные линии LOVO, BxPC3, НСТ-116, А549, AsPC-1, MiaPaCa-2 и Calu-6 были приобретены в Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС). Линия клеток Н460а была предоставлена доктором Jack Roth (M.D. Anderson Medical Center).

Перед имплантацией ксенографтов клетки (А549, Н460а, LOVO, Calu-6, НСТ-116, MiaPaca-2 и AsPC-1) собирали, используя 0,05% раствор трипсина, промывали и центрифугировали в культуральной среде, затем ресуспендировали в смеси 1:1 фосфатно-солевого буфера (PBS) и Matrigel (ВхРС-3), или в PBS (А549, Н460а, LOVO, Calu-6, НСТ-116, MiaPaca-2 и AsPC-1), получали суспензию клеток с концентрацией 1,5÷5×10⁷ клеток/мл. По 0,2 мл клеточной суспензии (что составляло 7,5×10⁶ клеток для линии А549, 1×10⁷ клеток для Н460а, 3×10⁶ клеток для Calu-6 и НСТ116, 5×10⁶ клеток для ВхРС3 и AsPC-1, 6 х 10⁶ клеток для MiaPaca-2 и 5×10⁶ клеток для LOVO) имплантировали подкожно в правый бок мыши. Все ксенографты были имплантированы голым мышам, за исключением ВхРC3, который был имплантирован мышам SCID-beige. Рост опухолей продолжался в течение 8-26 дней после имплантации, до достижения среднего объема опухоли около 100-150 мм³, после чего животные были рандомизированы в группы для лечения.

Соединение I (синтезированное в соответствии с методикой, описанной в WO 2005/023772) готовили в виде суспензии для перорального приема в 1,0% растворе Klucel в воде с добавлением 0,2% Твин-80. Раствор Соединения I и контрольный раствор готовили еженедельно и хранили при 4°C.

В ксенографтной модели с использованием клеток Calu-6 Соединение I вводилось в дозах 60 мг/кг в день через неделю в продолжение 4 недель (2 цикла 7+/7-). Во всех остальных ксенографтных моделях Соединение I вводилось в дозе 10 мг/кг ежедневно.

Измерение размера опухолей и массы мышей проводилось дважды в неделю. Статистический анализ результатов проводился с использованием критерия суммы рангов Манна-Уитни (Mann-Whitney Rank Sum Test), однофакторного дисперсионного анализа (1-way ANOVA) и t-теста Бонферрони (SigmaStat, версия 2.0, Jandel Scientific, San Francisco, CA). Различия между группами считались значимыми при величине вероятности p≤0,05.

Ингибирование роста опухоли (ИРО%) измерялось на 21 день после начала лечения. Результаты приведены ниже, в Таблице 1.

Таблица 1

Можно видеть, что ксенографт Н460а демонстрирует наименьшее ингибирование роста опухоли при лечении Соединением I.

Пример 2

После того, как в Примере 1 было определено, что ксенографтная модель Н460а после обработки Соединением I демонстрирует минимальный эффект ингибирования роста опухоли, для обеих клеточных линий Н460а и А549 (немелкоклеточная карцинома легких) был определен профиль цитокинов, чтобы определить наличие каких-либо биомаркеров, присущих исключительно линии Н460а.

Набор для определения профиля цитокинов был приобретен в компании RayBiotech, Inc. (Norcross, GA.) и использован в соответствии с инструкцией производителя. Клетки выращивали в течение 5 дней, клеточную среду отбирали, отделившиеся клетки удаляли центрифугированием. Четыре миллилитра среды инкубировали в течение ночи согласно методике, несколько раз промывали PBS/Твин, и регистрировали сигнал.

Оказалось, что клеточная линия Н460а экспрессирует более высокие уровни цитокинов IL6 и IL8, чем А549 или сывороточный контроль. См. Фигуру 1.

Пример 3

Экспрессия IL6 и IL8 была затем количественно определена в клеточных линиях ВхРС3, НСТ-116, А549, AsPC-1, MiaPaCa-2 и Calu-6 путем измерения уровня секретируемых белков IL6 и IL8 с использованием ELISA.

Набор ELISA для IL6 был приобретен в Bender MedSystems (BMS213/2 или BMS213INST). Набор ELISA для IL8 приобретался в Bender MedSystems (BMS204/3INST) или в R&D Systems (D8000C). Для измерения секретируемых IL6 и IL8 в клеточной культуральной среде клетки высевали с плотностью полмиллиона на 35 мм планшет.На следующий день клетки промывали 2 мл PBS и ресуспендировали в 1 мл свежей среды. Через 24 часа среду отбирали и сразу использовали для ELISA.

Как видно из полученных результатов (см. Фигуру 2), клетки Н460а секретируют более высокие количества белков IL6 и IL8, чем другие протестированные клеточные линии, в частности, в 4 раза больше IL6 и в 10 раз больше IL8, чем клетки А549.

Пример 4

Далее экспрессия IL6 и IL8 в клеточных линиях ВхРС3, НСТ-116, А549, AsPC-1, MiaPaCa-2 и Calu-6 оценивалась количественно путем измерения уровня мРНК методом qRT-PCR. Выделение РНК и ПЦР с обратной транскриптазой (RT-PCR) проводили с использованием стандартных лабораторных методов. Каталожные номера для каждого набора проб были следующими: Hes1 (Hs00172878_m1), АСТВ (4333762F), IL6 (Hs00174131_m1), IL8 (Hs00174103_m1) and 18S (4319413Е).

Как видно из полученных результатов (см. Фигуру 3), клетки Н460а экспрессируют более высокие количества мРНК, кодирующей IL6 и IL8, чем другие протестированные клеточные линии, в частности, в 12 раз больше IL6 и в 8 раз больше IL8, чем клетки А549.

Пример 5

Для того чтобы проверить, влияет ли экспрессия IL6 или IL8 на эффективность обработки Соединением I, были разработаны и использованы для получения ксенографтных моделей клеточные линии А549, сверхэкспрессирующие IL6 и IL8. Далее эти ксенографтные модели были изучены, чтобы определить, влияет ли такая сверхэкспрессия на чувствительность клеток к обработке Соединением I.

IL6 и IL8 лентивирусы были сконструированы с использованием IL6 и IL8 плазмид соответственно (доступных у таких поставщиков, как Genecopoeia, Rockville, Maryland, USA). Клетки A549 были разделены на три группы, из которых одна получила контрольный вектор, вторая была инфицирована лентивирусом IL6, третья - инфицирована лентивирусом IL8. Последние две группы образовали пулы клеток со стабильной экспрессией экзогенных IL6 и IL8 соответственно.

Сверхэкспрессию белков IL6 и IL8 определяли при помощи ELISA. См. Фигуру 4. Клетки А549, сверхэкспрессирующие IL6, секретируют в 7 раз большее количество IL6 по сравнению с Н460а. Клетки А549, сверхэкспрессирующие IL8, секретируют немного меньше белка IL8, чем Н460а. Морфология клеточных линий А549, сверхэкспрессирующих IL6 или IL8, аналогична морфологии контрольных клеток, содержащих вектор.

Часть клеток А549, сверхэкспрессирующих IL6, и часть клеток А549, сверхэкспрессирующих IL8, были объединены для получения четвертой группы, содержащей смесь таких клеток в соотношении 1:1.

Клетки А549, содержащие контрольный вектор; клетки А549, сверхэкспрессирующие IL6; клетки А549, сверхэкспрессирующие IL8, и смесь 1:1 клеток А549, сверхэкспрессирующих IL6, и А549, сверхэкспрессирующих IL8, были помещены в 6-луночный планшет, каждая группа в отдельную лунку в количестве около 1×10⁵ клеток/лунку в день 0. В 4, 6, 10 и 12 дни все клетки трипсинизировали и подсчитывали, затем их снова возвращали в планшет для дальнейшего роста в том же разведении. Рост контрольных клеток принимали за 100%. Рост всех остальных типов клеток выражали как отношение к росту контрольных клеток. Все тестируемые клеточные линии продемонстрировали близкие скорости роста. См. Таблицу 2.

Влияние сверхэкспрессии IL6 и IL8 in vivo на эффективность Соединения I было оценено для каждой из групп клеток.

Клетки из вышеупомянутых четырех групп и родительские линии А549 и Н460а были использованы для получения ксенографтных моделей, согласно методике, описанной в Примере 1.

Мыши были рандомизированы на группы по способу лечения (10 мышей в группе): мыши с клетками родительской линии А549, получавшие контрольный раствор (Klucel и Твин) один раз в день; мыши с клетками родительской линии А549, получавшие Соединение I в дозировке 10 мг/кг один раз в день; мыши с клетками родительской линии А549, получавшие Taxol® в дозировке 30 мг/кг четыре раза в день; мыши с клетками А549, содержащими контрольный вектор, получавшие контрольный раствор (Klucel и Твин) один раз в день; мыши с клетками А549, содержащими контрольный вектор, получавшие Соединение I в дозировке 10 мг/кг один раз в день; мыши с клетками А549, содержащими контрольный вектор, получавшие Taxol® в дозировке 30 мг/кг четыре раза в день; мыши с клетками А549, сверхэкспрессирующими IL6, получавшие контрольный раствор (Klucel и Твин) один раз в день; мыши с клетками А549, сверхэкспрессирующими IL6, получавшие Соединение I в дозировке 10 мг/кг один раз в день; мыши с клетками А549, сверхэкспрессирующими IL6, получавшие Taxol® в дозировке 30 мг/кг четыре раза в день; мыши с клетками А549, сверхэкспрессирующими IL8, получавшие контрольный раствор (Klucel и Твин) один раз в день; мыши с клетками А549, сверхэкспрессирующими IL8, получавшие Соединение I в дозировке 10 мг/кг один раз в день; мыши с клетками А549, сверхэкспрессирующими IL8, получавшие Taxol® в дозировке 30 мг/кг четыре раза в день; мыши с клетками А549, представляющими собой ксенографтную смесь 1:1 клеток А549, сверхэкспрессирующих IL6 и IL8, получавшие контрольный раствор (Klucel и Твин) один раз в день; мыши с клетками А549, представляющими собой ксенографтную смесь 1:1 клеток А549, сверхэкспрессирующих IL6 и IL8, получавшие Соединение I в дозировке 10 мг/кг один раз в день; мыши с клетками А549, представляющими собой ксенографтную смесь 1:1 клеток А549, сверхэкспрессирующих IL6 и IL8, получавшие Taxol® в дозировке 30 мг/кг четыре раза в день; мыши с клетками Н460а, получавшие контрольный раствор (Klucel и Твин) один раз в день; мыши с клетками Н460а, получавшие Соединение I в дозировке 10 мг/кг один раз в день; мыши с клетками Н460а, получавшие Taxol® в дозировке 30 мг/кг четыре раза в день.

Ксенографтные опухоли из клеток Н460а (с высокими уровнями, как IL6, так и IL8), которые обрабатывали Соединением I в дозировке 10 мг/кг раз в день, приводили к 9% ИРО после 21 дня. Такая резистентность значительно отличалась от 71% ИРО, наблюдаемого для А549-опухолей, и 61% ИРО для А549-опухолей в случае клеток, содержащих контрольный вектор (низкий уровень IL6 и IL8), что согласуется с предыдущими экспериментами. Сверхэкспрессия в клетках А549 сокращала ИРО до 32% и 45% соответственно. Опухоли, инициированные 1:1 смесью А549, сверхэкспрессирующих IL6 и IL8, демонстрировали полную резистентность к Соединению I (8% ИРО), аналогичную резистентности ксенографта на основе родительской линии Н460а. Taxol® был включен в качестве положительного лекарственного контроля, показывающего устойчивые значения ИРО в различных моделях. См. Фигуру 5.

Резистентность по отношению к Соединению I линии клеток А549, сверхэкспрессирующей IL6 или IL8, не была вызвана потерей Notch ингибирования, т.к. даунрегуляция мРНК Hesl, признак блокады сигналинга Notch, являющаяся результатом in vitro обработки Соединением I, правильно протекает в этих клетках.

Пример 6

Этот пример описывает исследование, проведенное с целью выяснения, требуется ли экспрессия IL8 для появления резистентности клеток Н460а.

Лентивирусы были получены с использованием анти-IL8 shPHK, на основе pLKO.1 (приобретенной в Open Biosystems) и использованы для подавления экспрессии IL8 в клетках Н460а.

Как показано на Фигуре 6, shPHK приводит к 75% подавлению экспрессии IL8 (как мРНК, так и белка), по сравнению с родительской линией клеток Н460а. Однако клетки Н460а с нокдауном по IL8 все еще имеют уровень IL8, более чем в два раза превышающий уровень IL8 в клетках А549.

Родительская линия клеток Н460а и клетки Н460а с нокдауном по IL8 были имплантированы мышам как ксенографты в соответствии с методиками, описанными в Примере 1. Затем мыши были рандомизированы на группы по способу лечения (10 мышей в группе): мыши с ксенографтами Н460а, получавшие контрольный раствор раз в день; мыши с ксенографтами Н460а, получавшие Соединение I в дозировке 10 мг/кг раз в день; мыши с ксенографтами Н460а с нокдауном по IL8, получавшие контрольный раствор раз в день; мыши с ксенографтами Н460а с нокдауном по IL8, получавшие Соединение I в дозировке 10 мг/кг раз в день.

Как показано на Фигуре 7, при обработке Соединением I в дозировке 10 мг/кг раз в день в течение 21 дня, опухоли, полученные из клеток Н460а с нокдауном по IL8, показывали повышенную чувствительность в сравнении с опухолями из родительских клеток Н460а (5% ИРО против 24% ИРО).

Пример 7

Этот пример описывает дальнейшие исследования, проведенные с целью выяснения, требуется ли экспрессия IL8 для появления резистентности клеток Н460а.

Нейтрализующее антитело против IL8 было приобретено в R&D Systems (каталожный номер: МАВ208). Сначала антитело было протестировано in vitro, и в клетках А460а, обработанных этим антителом, не наблюдалось ингибирования роста.

Ксенографтные модели Н460а были получены с использованием методик, описанных в Примере 1. Затем мыши были рандомизированы на группы по способу лечения (10 мышей в группе): мыши с ксенографтами Н460а, получавшие контрольный раствор дважды в неделю; мыши с ксенографтами Н460а, получавшие Соединение I в дозировке 10 мг/кг раз в день; мыши с ксенографтами Н460а, получавшие антитело против IL8 в дозировке 20 мг/кг дважды в неделю, и мыши с ксенографтами Н460а, получавшие Соединение I в дозировке 10 мг/кг раз в день, и антитело против IL8 в дозировке 20 мг/кг дважды в неделю.

Комбинация антитела и Соединения I повышала чувствительность Н460а опухолей к Соединению I (10% ИРО против 43% ИРО). Это согласуется с предыдущими данными, относящимися к shPHK IL8. См. Фигуру 8.

Пример 8

Этот пример описывает исследования, проведенные с целью выяснения, требуется ли экспрессия IL6 для появления резистентности клеток Н460а.

Нейтрализующее антитело против IL6 было приобретено в R&D Systems (каталожный номер: МАВ2061). Сначала антитело было протестировано in vitro, и в клетках А460а, обработанных этим антителом, не наблюдалось ингибирования роста.

Ксенографтные модели Н460а были получены с использованием методик, описанных в Примере 1. Затем мыши были рандомизированы на группы по способу лечения (10 мышей в группе): мыши с ксенографтами Н460а, получавшие контрольный раствор дважды в неделю; мыши с ксенографтами Н460а, получавшие Соединение I в дозировке 10 мг/кг раз в день; мыши с ксенографтами Н460а, получавшие антитело против IL6 в дозировке 20 мг/кг дважды в неделю, и мыши с ксенографтами Н460а, получавшие Соединение I в дозировке 10 мг/кг раз в день, и антитело против IL6 в дозировке 20 мг/кг дважды в неделю.

Комбинация антитела и Соединения I повышала чувствительность Н460а опухолей к Соединению I (43% ИРО против 47% ИРО). Это согласуется с предыдущими данными, относящимися к shPHK IL8. См. Фигуру 9.

Пример 9

Важной особенностью любого маркера является способность к успешной предсказательной идентификации типов опухолей, отвечающих или не отвечающих на лечение. В этом примере были проанализированы различные клеточные линии, чтобы определить наличие высокого уровня экспрессии IL6 и/или IL8. Клетки с высоким уровнем экспрессии IL6 и IL8 были в дальнейшем использованы для получения ксенографтов (и таким образом для них предполагалось отсутствие ответа на воздействие Соединением I). Затем ксенографтные модели были обработаны Соединением I, чтобы увидеть, влияет ли высокий уровень IL6 и IL8 на эффективность лечения.

При помощи qRT-PCR был проведен скрининг приблизительно ста клеточных линий с множественными типами опухолей на экспрессию IL6 или IL8. Около 13% клеточных линий показали по меньшей мере в 10 раз большую экспрессию IL6 или IL8, чем А549. Для дальнейших исследований были отобраны две клеточные линии: U87MG (глиобастома), которая экспрессировала высокие уровни IL6 (в 35 раз больше мРНК IL6, чем А549) и IL8 (в 85 раз больше мРНК IL8, чем А549), и LOX (меланома), которая экспрессировала более высокий уровень IL8 (в 50 раз больше мРНК IL8, чем А549) и IL6 (в 2 раза больше мРНК IL6, чем А549), по отношению к А549 (Фигура 10). Высокие уровни экспрессии IL6 и/или IL8 этих двух клеточных линий были далее подтверждены ELISA (Фигура 11).

Человеческие раковые клеточные линии U87MG и LOX были приобретены в Американской коллекции Типовых Культур.

В дальнейшем клеточные линии U87MG и LOX были использованы для получения ксенографтных моделей.

Ксенографты имплантировали самкам nu/nu (голых) мышей, полученных в Charles River Laboratories (Wilmington, MA), в возрасте около 8-14 недель, весом приблизительно 23-25 г, разбитым на группы по 10 животных. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколом, одобренным Roche Animal Саге и Use Committee (RACUC).

Для проведения имплантации ксенографта клетки собирали, используя 0,05% раствор трипсина, промывали и центрифугировали в культуральной среде, затем ресуспендировали в смеси 1:1 фосфатно-солевого буфера (PBS) и Matrigel (U87MG), или только в PBS (LOX), получали суспензию клеток с концентрацией 1,5÷5×10⁷ клеток/мл. По 0,2 мл клеточной суспензии (что составило 5 х 10⁶ клеток для линии U87MG, 2×10⁶ клеток для линии LOX) имплантировали подкожно в правый бок мыши. Рост опухолей продолжался в течение 8-26 дней после имплантации, до достижения среднего объема около 100-150 мм³, после чего животные были рандомизированы в группы для лечения: мыши с ксенографтами U87MG, получающие контрольный раствор (Klucel и Твин) один раз в день; мыши с ксенографтами U87MG, получающие Соединение I в дозировке 10 мг/кг один раз в день в течение 21 дня; мыши с ксенографтами LOX, получающие контрольный раствор (Klucel и Твин) один раз в день; мыши с ксенографтами LOX, получающие Соединение I в дозировке 10 мг/кг один раз в день в течение 11 дней.

Как и предполагалось, обе модели, U87MG и LOX, продемонстрировали резистентность к лечению Соединением I, показав следующие результаты: 17% ИРО для опухолей U87MG и 15% ИРО для опухолей LOX. См. Фигуру 12.

Устойчивость клеточных линий U87MG и LOX к Соединению I не была вызвана потерей Notch ингибирования, т.к. даунрегуляция мРНК Hesl, признак блокады сигналинга Notch, являющаяся результатом in vitro обработки Соединением I, правильно протекает в этих клетках. См. Фигуру 13.

Пример 10

В данном примере определялись сывороточные уровни IL6 и IL8 в ксенографтных моделях, чтобы определить, отражают ли они различия в экспрессии, наблюдаемые in vitro в клеточной среде. Полученные данные подтвердили, что сбор сыворотки может стать подходящим клиническим методом для мониторинга уровней IL6 и IL8 у пациентов, имеющих опухоли.

Сыворотки были собраны у мышей, имеющих опухоли, полученные с использованием следующих ксенографтных моделей: А549, Н460а, Н460а с нокдауном по IL8, U87MG и LOX (все модели были получены с помощью методов, описанных выше). Сбор сывороток осуществлялся посредством ретро-орбитального метода или при помощи пункции сердца в пробирки для сбора сыворотки BD Microtainer (каталожный номер #365956, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Кровь оставляли для свертывания минимум на 10 минут и затем вращали при 9000 оборотов/мин в течение 10 минут в микроцентрифуге. Сыворотку отбирали, помещали в 1,5 мл микроцентрифужные пробирки и хранили при -80°C.

Уровни IL6 и IL8, секретируемые в сыворотке, полученной у мышей с А549-опухолями, оказались слишком низкими, чтобы их можно было оценить посредством ELISA. В то же время сывороточные уровни IL6 и IL8, полученные из ксенографтных моделей на основе Н460а, LOX и U87MG, легко определялись при помощи этого метода (Фигура 14). Более того, ожидаемые изменения в уровнях IL8, секретируемого в сыворотке, наблюдались при сравнении ксенографтных моделей Н460а с нокдауном по IL8 и Н460а.

В общем случае, уровни IL6 и IL8, наблюдаемые in vivo в сыворотке, отражают концентрации, наблюдаемые in vitro в клеточных культурах. Однако мы не наблюдали различия между IL6 и IL8, измеренными в мышиной сыворотке и клеточной среде. Например, U87MG секретировала в 5-6 раз больше IL6 и IL8, чем Н460а при посеве одинакового количества клеток в пластиковые планшеты; что никак не отразилось на результатах, полученных в мышиной сыворотке.