СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ РЕПРОДУКТИВНОЙ АКТИВНОСТИ МЫШЕЙ САМЦОВ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Изобретение относится к медицине и ветеринарии и может быть использовано для повышения репродуктивной активности особей мужского пола (самцов).

Меланины - природные пигменты, участвуют в работе живых систем различного уровня организации. Меланины содержатся в микроорганизмах и растениях, в тканях животных и человека (придают окраску волосам, ресницам, коже), в ряде пищевых продуктов (чай, кофе, грибы, гречиха и др.). Меланины - высокомолекулярные соединения, образуются в результате полимеризации тирозина, диоксифенилаланина или катехоламинов на белковой матрице, обладают широким спектром биомедицинских и технических свойств. Известны сообщения о практическом применении синтетических, полусинтетических и выделенных из биологических источников меланинов в медицине, косметологии, пищевой и лакокрасочной отраслях промышленности, технике и электронике.

По данным доклинического фармакологического исследования водорастворимые меланины не токсичны. После однократного внутрижелудочного или внутрибрюшинного введения в дозах от 100 до 3000 мг/кг не отмечено гибели мышей. При введении в течение 15 суток не зафиксировано смертельных исходов, нарушения общего состояния, патологических изменений внутренних органов, не выявлено канцерогенного действия.

В то же время опубликованные данные указывают на наличие у меланинов разнообразных фармакологических свойств.

В экспериментах на грызунах показано, что меланин обладает антистрессорным, противосудорожным и антимутагенным действием, повышает физическую работоспособность, усиливает иммунную защиту организма, вызывает продукцию цитокинов, таких как интерлейкины - 6 и 8, туморнекротического фактора, ростового фактора эндотелия, ускоряет рост массы тела и нормализует гематологический статус. Сообщается об успешном применении меланина в схеме комплексной терапии онкологических заболеваний и при сахарном диабете.

Запатентовано противовирусное средство на основе меланина.

Мазь, изготовленная с использованием меланина (мазь: туба 15 г, регистрационные №№11/12/947, 06.12.11) рекомендована в качестве фотопротектора для наружного применения.

Водорастворимый меланиновый экстракт (http://melanin.com.ua/voda-s-melaninom/38-melaninovyy-ekstrakt.html) рекламируется в качестве средства для лечения инсульта, диабета, язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки, антирадиационного, иммуномодулирующего и противовирусного средства при СПИДе.

Меланин запатентован в качестве радиопротектора и лечебного средства при лучевой болезни.

При хроническом в течение 20-ти суток облучении беременных крыс в суммарной дозе ~ 1,25 Гр, не сопровождающемся развитием лучевой болезни, ежедневное внутрижелудочное введение суспензии меланина в крахмальном геле (10 мг/кг) устраняло в постнатальном периоде дефицит соматического развития крысят.

Имеются указания на способность меланина снижать накопление радионуклидов в организме.

Наличие у меланинов разнообразных биомедицинских свойств многие авторы связывают с наличием у них антиоксидантной активности.

Задачей работы является исследование и доказательство возможности использования водорастворимого меланина для повышения репродуктивной способности особей мужского пола, мышей-самцов. Разработка позволяет повысить репродуктивную способность мышей, с различным исходным уровнем репродуктивной активности, установленной по увеличению числа мышат в помете и морфологическим исследованием семенников.

Технический результат заключается в повышении репродуктивной активности интактных мышей самцов и восстановлении репродуктивной активности самцов, сниженной путем воздействия ионизирующего излучения.

Для достижения поставленной задачи изучено влияние меланина на репродуктивную активность самцов мышей по числу мышат в помете самок после спаривания и на морфологическую картину семенников.

В исследовании было выявлено, что наилучшие эффекты достигаются при использовании меланина в растворенном виде. Причем оптимальным (эффективная концентрация) является его растворение в дистиллированной воде из расчета 12,5-50 мг на 100 мл воды с использованием этой воды у животных как питьевой. Нами было выявлено, что именно в данной форме меланин способен оказывать адекватное стимулирующее действие на репродуктивную активность интактных мышей самцов и мышей со сниженной под воздействием облучения способностью к оплодотворению.

В экспериментах использовали меланин, изготовленный в соответствии с ТУ 9197-001-6735746-0, с водорастворимостью не менее 80% и концентрацией парамагнитных центров не менее 8×10¹⁷ спин/г.

Стимулирующая в отношении репродуктивной способности активность меланина была изучена на аутбредных мышах CD-1 самцах и самках, массой 22-30 г. К экспериментам отбирались только клинически здоровые особи. Контрольные и подопытные группы формировались случайным выбором из равнозначных по массе животных.

Испытания стимулирующей эффективности меланина проводили на интактных мышах в разное время года, поскольку известны сезонные колебания уровня репродуктивной активности у грызунов. Кроме того, часть экспериментов выполнена на облученных самцах, поскольку известно, что сперматогенез является чрезвычайно радиочувствительным процессом. Мышей облучали тотально γ-квантами ⁶⁰Со с мощностью 1 Гр/мин на установке Рокус-М. Доза однократного облучения составила 0,5 и 1,0 Гр.

Меланин, растворенный в дистиллированной воде из расчета 12,5-50 мг на 100 мл, мыши самцы получали в свободном доступе вместо питьевой воды в течение 8-10 суток перед спариванием, а затем в течение 3-10 суток в период спаривания. Контрольные животные на протяжении всего эксперимента получали дистиллированную воду.

Эксперименты проведены с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных, регламентированных приказом Министерства здравоохранения СССР №75 от 12.08.1987».

Влияние меланина на репродуктивную активность самцов оценивали по числу живых мышат в помете. Кроме того, на 5-15 сутки содержания мышей самцов на питьевой воде с меланином часть животных умерщвляли методом цервикальной дислокации, у них извлекали семенники, которые исследовали гистологическими методами.

Статистическую обработку полученных в эксперименте данных проводили с помощью общепринятых методов вариационной статистики. Рассчитывали средние арифметические показатели и их стандартные ошибки. О статистической значимости различий у животных сравниваемых групп судили по критерию Стьюдента.

В проведенных исследованиях авторами установлено, что меланин при длительном приеме как интактными мышами, так и облученными мышами обладает выраженной способностью стимулировать репродуктивную активность. Полученные результаты в обобщенном виде и в различных сериях представлены в таблицах 1 и 2.

Во всех 6 экспериментах отмечен стимулирующий эффект меланина в отношении репродуктивной активности самцов, что является достаточным для доказательства статистической достоверности эффекта (Р=0,05).

Отмечено увеличение числа беременностей: у интактных животных с 80% до 86% (таблица 1), у облученных - с 87% до 97% (таблица 2).

Суммарно у животных, получавших меланин, на 89 самок зарегистрировано 80 беременностей, у контрольных на 89 самок - 73 беременности.

Применение меланина увеличило число мышей в приплоде у интактных животных с 321 гол до 429, у облученных - с 183 до 226 гол. Суммарно с 504 до 655 гол, т.е. в 1,3 раза.

При анализе данных о среднем числе мышат в приплоде обращает внимание тот факт, что стимулирующий эффект меланина проявляется при исходно низкой репродуктивной активности самцов или в случае ее снижения после облучения, тогда как при исходно (у контрольных животных) высокой репродуктивной активности (эксперимент №2 таблица 2) стимулирующий эффект минимален.

Дополнительно было проведено изучение морфофункциональных изменений в семенниках мышей, получавших меланин.

Эксперименты выполнены на 100 мышах самцах CD-1 с исходной массой 22-24 г. Животные получали раствор меланина (12,5-50 мг меланина на 100 мл дистиллированной воды) в свободном доступе вместо питьевой воды. Контрольные животные получали дистиллированную воду. На 5, 10 и 15 сутки от начала эксперимента осуществляли эвтаназию животных методом декапитации в одно и тоже время суток с 9.00 до 13.00. Протокол эксперимента в разделах выбора, содержания и выведения животных из опыта составляется в соответствии с принципами биоэтики и правилами лабораторной практики, которые представлены в «Руководстве по содержанию и использованию лабораторных животных» (1996) и приказе МЗ РФ №226 от 19.06.2003 «Правила клинической практики в РФ», а также с соблюдением правил гуманного обращения с животными (Report of the AVMA Panel on Euthanasia JAVMA, 2001).

Для определения морфофункционального состояния сперматогенного эпителия семенников препараты подвергались гистологическому (ГИ) и иммуногистохимическому (ИГХ) исследованию.

Препараты фиксировали в 10%-ном нейтральном забуференном формалине. Дальнейшая обработка производилась по общепринятой унифицированной методике.

Изучение гистологических препаратов проводилось в световом микроскопе Leica DMR (Германия) при увеличениях от х50 до х630.

В препаратах, окрашенных гематоксилином-эозином, визуально оценивались изменения сперматогенного эпителия в разных группах.

На следующем этапе проводилось иммуногистохимическое исследование с моноклональным антителом Ki-67, клон В56 (BD Pharmingen™, США) с последующим подсчетом клеток сперматогенного эпителия на 1 семенной каналец, исключая зрелые формы сперматозоидов и сперматиды. Подсчитывалось количество окрашенных клеток (положительная реакция с Ki-67) в отдельном семенном канальце, общее количество клеток. Затем рассчитывали индекс пролиферации в контрольной и опытных группах.

ИГХ исследование выполнялось на парафиновых срезах толщиной 4 мкм с использованием системы визуализации DAKO EnVision+System, Peroxidase (DAB), с помощью моноклональных мышиных антител Ki-67 (BD Pharmingen™, США) с предварительной депарафинизацией, регидратацией и демаскировкой антигенов. Далее проводили гашение эндогенной пероксидазы 3%-ным раствором перекиси водорода, срезы инкубировали первичными, затем вторичными антителами. Продукт реакции выявляли с помощью DAKO EnVision+System, затем срезы докрашивались гематоксилином.

Количественная оценка экспрессии Ki-67 проводилась с использованием системы анализа изображений Leica Q550IW (Германия) и программы «ImageJ».

Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием программы Statistica 6.0. Данные представлены в виде среднего значения (М) и стандартной ошибки средней (т). Значимость различий оценивали по критерию Стьюдента, считая статистически достоверным значение Р<0,05.

Результаты суммированы в таблице 3.

Из представленных данных видно, что уже после 5 суток содержания мышей на питьевой воде с меланином статистически достоверно повышается пролиферативная активность сперматогенного эпителия, при этом стимулирующий эффект увеличивается через 10, а затем и 15 суток эксперимента.

Анализ совокупности полученных результатов позволяет сделать вывод о том, что меланин при приеме внутрь стимулирует репродуктивную активность мышей самцов. Вывод подтвержден экспериментами на интактных мышах и животных со сниженной под влиянием ионизирующего излучения репродуктивной способностью по числу забеременевших самок, числу мышат в помете и общему числу животных в приплоде. Кроме того, иммуногистохимическим методом продемонстрировано увеличение пролиферативной активности сперматогенного эпителия у животных, получавших меланин.

Таким образом, предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Мышам самцам осуществляют пероральное введение меланина в жидкой форме. Причем используют меланин с водорастворимостью не менее 80% и концентрацией парамагнитных центров не менее 8×10¹⁷ спин/г в растворимом виде в дистиллированной воде в эффективной концентрации. Воду с меланином используют в качестве питьевой как у интактных мышей, так и у предварительно облученных животных в нелетальной дозе ионизирующего излучения. Воду с меланином употребляют в течение 8-10 суток перед спариванием животных.

Пример 1. Стимуляцию репродуктивной активности меланина изучают в опыте на аутбредных мышах CD-1: 10 самцах и 50 самках с массой 24-26 г, находящихся в условиях вивария на обычном рационе.

Опытные 5 самцов в течение 8 суток получали в качестве питьевой воды раствор меланина (50 мг на 100 мл дистиллированной воды). Контрольные 5 самцов получили дистиллированную воду. На 8-е сутки к каждому из самцов подсадили по 5 самок и животные продолжали получать меланин или дистиллированную воду. Через 10 суток от начала спаривания самцы были отсажены. За развитием беременности и родами наблюдали в течение 22 суток после отсаживания самцов. В каждом помете подсчитывали количество живых мышат. Мертворожденные не учитывались.

В результате из 25 самок в опытной группе принесли приплод 18 животных, среднее число мышат на одну родившую самку составило 8,8 при общем числе родившихся мышат - 159 гол. В контроле родили 16 самок из 25, среднее число мышат на одну родившую самку составило 5,4, при общем числе родившихся 87.

Таким образом, стимуляция репродуктивной активности мышей самцов проявилась в увеличении числа родивших самок на 8%, числа мышат на 1 родившую самку в 1,6 раза и общего числа мышат в приплоде до 183%.

Пример 2. Стимуляцию репродуктивной активности меланина изучают в опыте на аутбредных мышах CD-1: 6 самцах и 30 самках с массой 27-30 г, находящихся в условиях вивария на обычном рационе.

Опытные 3 самца в течение 10 суток получали в качестве питьевой воды раствор меланина (12,5 мг на 100 мл дистиллированной воды). Контрольные 3 самца получали дистиллированную воду.

На 10 сутки к каждому из 3 самцов подсадили по 5 самок и животные продолжали получать меланин или дистиллированную воду. Через 10 суток от начала спаривания самцы были отсажены. За развитием беременности и родами наблюдали в течение 22 суток после отсаживания самцов. В каждом помете подсчитывали количество живых мышат. Мертворожденные не учитывались.

В результате из 15 самок в опытной группе принесли приплод 14 животных, среднее число мышат на 1 родившую самку составило 7,4 при общем числе родившихся - 104 гол. В контроле родили 12 самок из 15, среднее число мышат на 1 родившую самку составило 6,5 при общем числе животных в приплоде - 78 гол.

Таким образом, стимуляция репродуктивной активности мышей самцов проявилась в увеличении числа родивших самок на 13%, числа мышат на 1 родившую самку в 1,14 раза и общего числа мышат в приплоде до 133%.

Пример 3. Стимуляцию репродуктивной активности, сниженной под воздействием ионизирующего излучения, меланином изучают в опыте на аутбредных мышах CD-1: 9 самцах и 45 самках, массой 28-30 г, находящихся в условиях вивария на обычном рационе.

6 самцов облучили тотально γ-квантами ⁶⁰Со на установке Рокус-М в дозе 0,5 Гр при мощности дозы 1 Гр/мин. Сразу после облучения 3 самцов начали поить раствором меланина (12,5 мг/100 мл дистиллированной воды) и продолжали этот режим 10 суток. 3 облученных самца в течение 10 суток получали дистиллированную воду и 3 необлученных самца получали дистиллированную воду. Затем на 10 сутки после облучения к каждому самцу подсадили по 5 самок. Спаривание проводили 10 суток, после чего самцы были отсажены. За развитием беременностей и родами наблюдали в течение 22 суток после отсаживания самцов. В каждом помете учитывали количество живых мышат. Мертворожденных не учитывали.

Результаты представлены в таблице 4.

В группе необлученных животных число мышат в приплоде составило 110 при среднем числе в помете 7,8. Облучение самцов в дозе 0,5 Гр снизило величину приплода до 89 при среднем числе мышат в приплоде 6,4. Содержание облученных животных на меланине практически восстановило их репродуктивную активность: число мышат в приплоде 108, при среднем числе мышат на 1 роды 7,2.

Таким образом, содержание облученных самцов на питьевой воде с меланином обеспечивает восстановление их репродуктивной активности до значений у необлученных животных.

Пример 4. Морфофункциональные изменения в семенниках мышей под влиянием меланина изучают в опыте на 20 аутбредных мышах самцах с исходной массой 22-24 г, находящихся в условиях вивария на обычном рационе.

Опытные 10 самцов в течение 15 суток получили в качестве питьевой воды раствор меланина (12,5 мг на 100 мл дистиллированной воды).

Контрольные 10 самцов получили дистиллированную воду. Затем провели эвтаназию животных путем декапитации и извлекли семенники. Препараты фиксировали в 10%-ном нейтральном забуференном формалине. Дальнейшая обработка производилась по общепринятой унифицированной методике. Изучение гистологических препаратов проводилось в световом микроскопе Leica DMR (Германия) при увеличениях от х50 до х630.

В препаратах, окрашенных гематоксилином-эозином, визуально оценивались изменения сперматогенного эпителия в разных группах.

На следующем этапе проводилось иммуногистохимическое исследование с моноклональным антителом Ki-67, клон В56 (BD Pharmingen™, США) с последующим подсчетом клеток сперматогенного эпителия на 1 семенной каналец, исключая зрелые формы сперматозоидов и сперматиды. Подсчитывалось количество окрашенных клеток (положительная реакция с Ki-67) в отдельном семенном канальце, общее количество клеток. Затем рассчитывали индекс пролиферации в контрольной и опытных группах.

ИГХ исследование выполнялось на парафиновых срезах толщиной 4 мкм с использованием системы визуализации DAKO EnVision+Systam, Peroxidase (DAB), с помощью моноклональных мышиных антител Ki-67 (BD Pharmingen™, США) с предварительной депарафинизацией, регидратацией и демаскировкой антигенов. Далее проводили гашение эндогенной пероксидазы 3%-ным раствором перекиси водорода, срезы инкубировали первичными, затем вторичными антителами. Продукт реакции выявляли с помощью DAKO EnVision+Systam, затем срезы докрашивались гематоксилином.

Количественная оценка экспрессии Ki-67 проводилась с использованием системы анализа изображений Leica Q550IW (Германия) и программы «ImageJ».

Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием программы Statistica 6.0. Данные представлены в виде среднего значения (М) и стандартной ошибки средней (т). Значимость различий оценивали по критерию Стьюдента, считая статистически достоверным значение Р<0,05.

Количество клеток - среднее на 1 семенной каналец составило в опытной группе 208,1±5,63, в контрольной 210,1±6,72. Количество окрашенных с помощью моноклональных антител Ki-67 клеток сперматогенного эпителия среднее на 1 семенной каналец в опытной группе составило 77,10±1,65, а в контрольной 62,1±1,95. Различия статистически достоверны: t=-4,85, Р=0,000003. Индекс пролиферации в опытной группе составил 38,7±1,12, в контрольной 30,5±0,96. Различия статистически достоверны: t=-4,69, Р=0,000006.

Таким образом, содержание мышей в течение 10 суток на питьевой воде, содержащей меланин (12,5 мг на 100 мл дистиллированной воды), увеличивает пролиферативную активность сперматогенного эпителия в 1,27 раза, оцененную иммуногистохимическим методом.

Пример 5. Морфофункциональные изменения в семенниках мышей под влиянием меланина изучают в опыте на 20 аутбредных мышах самцах с исходной массой 22-24 г, находящихся в условиях вивария на обычном рационе.

Опытные 10 самцов в течение 5 суток получали в качестве питьевой воды раствор меланина (50 мг на 100 мл дистиллированной воды). Контрольные 10 самцов получали дистиллированную воду. Затем провели эвтаназию животных путем декапитации и извлекли семенники. Препараты фиксировали в 10%-м нейтральном забуференном формалине. Дальнейшая обработка производилась по общепринятой унифицированной методике. Изучение гистологических препаратов проводилось в световом микроскопе Leica DMR (Германия) при увеличениях от х50 до х630.

В препаратах, окрашенных гематоксилином-эозином, визуально оценивались изменения сперматогенного эпителия в разных группах.

На следующем этапе проводилось иммуногистохимическое исследование с моноклональным антителом Ki-67, клон В56 (BD Pharmingen™, США) с последующим подсчетом клеток сперматогенного эпителия на 1 семенной каналец, исключая зрелые формы сперматозоидов и сперматиды. Подсчитывалось количество окрашенных клеток (положительная реакция с Ki-67) в отдельном семенном канальце, общее количество клеток. Затем рассчитывали индекс пролиферации в контрольной и опытных группах.

ИГХ исследование выполнялось на парафиновых срезах толщиной 4 мкм с использованием системы визуализации DAKO EnVision+Systam, Peroxidase (DAB), с помощью моноклональных мышиных антител Ki-67 (BD Pharmingen™, США) с предварительной депарафинизацией, регидратацией и демаскировкой антигенов. Далее проводили гашение эндогенной пероксидазы 3%-ным раствором перекиси водорода, срезы инкубировали первичными, затем вторичными антителами. Продукт реакции выявляли с помощью DAKO EnVision+Systam, затем срезы докрашивались гематоксилином.

Количественная оценка экспрессии Ki-67 проводилась с использованием системы анализа изображений Leica Q550IW (Германия) и программы «ImageJ».

Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием программы Statistica 6.0. Данные представлены в виде среднего значения (М) и стандартной ошибки средней (т). Значимость различий оценивали по критерию Стьюдента, считая статистически достоверным значение Р<0,05.

Количество клеток среднее на 1 семенной каналец составило в опытной группе 241,8±7,1, в контрольной 210,1±6,72. Различия статистически достоверны: t=-2,73, Р=0,007127. Количество окрашенных с помощью моноклональных антител Ki-67 среднее на 1 каналец составило в опытной группе 60,76±17,38, а в контрольной 62,1±1,95. Индекс пролиферации в опытной группе - 34,5±0,11, в контрольной 30,5±0,96, различия статистически достоверны: t=-2,39, Р=0,018077.

Таким образом, содержание мышей в течение 5 суток на питьевой воде, содержащей меланин (50 мг на 100 мл дистиллированной воды), увеличивает пролиферативную активность сперматогенного эпителия, судя по общему количеству клеток в 1,15 раза, а по индексу пролиферации 1,13.

Таким образом, меланин стимулирует репродуктивную активность мышей самцов. Стимулирующий эффект достигается при курсовом приеме внутрь с питьевой водой из расчета 12,5-50 мг меланина на 100 мл, при этом достигается увеличение числа животных в приплоде в среднем в 1,34 раза у интактных мышей и в 1,23 раза у мышей со сниженной под влиянием облучения репродуктивной активностью. Стимулирующая активность меланина подтверждается данными иммуногистохимического исследования семенников - максимальное увеличение индекса пролиферации отмечено в 1,27 раза.

Стимулирующий эффект меланина в отношении репродуктивной активности самцов при практически полной безвредности, простой и удобный способ применения позволяют использовать меланин для решения задач репродуктивной медицины (андрологии), а также в животноводстве и ветеринарии.