СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ПЕРВИЧНОГО И ВТОРИЧНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА НА ВИРУС КРАСНУХИ

Изобретение относится к области медицинской иммунологии, а именно к способам определения специфического гуморального иммунного ответа.

Изобретение может быть использовано в медицине для дифференциальной диагностики первичного и вторичного гуморального иммунного ответа на вирусы краснухи у больных или привитых против этой инфекции. Известно, что со временем поствакцинальный иммунитет истощается, и в результате человек, привитый в детстве против краснухи, может заболеть при контакте с диким штаммом вируса. С другой стороны, в результате нарушения инструкций по хранению и применению вакцины человек мог быть привит некачественной вакциной и, при наличии документа о проведенной прививке, он на самом деле остается не защищенным против краснухи. По графику прививок РФ, вакцинация против краснухи проводится двукратно в 1 год и в 6 лет и документы о проведенных прививках тщательно сохраняются, однако с годами документы о прививках могут теряться, а сам взрослый не помнит, делали ли ему прививку в раннем детском возрасте, такие люди имеют статус «с неясным прививочным анамнезом». Краснуха имеет большое значение для общественного здравоохранения из-за тератогенного эффекта врожденной краснушной инфекции, который может приводить к прерыванию беременности или смерти плода, а также к рождению детей с синдромом врожденной краснухи. По данным Л.Л. Нисевич с соавт. краснуха является причиной врожденной патологии в 27-35% случаев [1]. В рамках программы ВОЗ по элиминации краснухи важное место занимает мониторинг привитых лиц. Особое значение дифференциальная диагностика первичного (первая встреча с вирусом у непривитого и не болевшего этой инфекцией) и вторичного (повторная встреча с вирусом у привитого или переболевшего данной инфекцией) иммунного ответа на антигены вирусов краснухи имеет для принятия решения в случае контакта беременной женщины с краснушным больным. Учитывая высокий процент формирования пороков развития при врожденной краснухе, встает вопрос о прерывании беременности на любом сроке. На сегодняшний момент нет стандартного метода, позволяющего четко разграничить первичный и вторичный иммунный ответ на вирусы краснухи.

Для дифференциальной диагностики первичного и вторичного иммунного ответа используют количество специфических IgM и IgG антител. Однако уровень специфических IgG-антител в самом начале заболевания весьма вариабелен, требуется подтверждение прироста уровня антител через 2-3 недели, но в результате бустер-эффекта уровень антител может повышаться и у привитого, вполне защищенного индивидуума. IgM-антитела могут наблюдаться и при первичном, и при вторичном иммунном ответе [2]. Также используют определение авидности IgG-антител, однако она подвержена межиндивидуальным колебаниям [3].

Известно, что антитела класса IgG делятся на 4 субкласса: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Считают, что для противовирусного иммунного ответа наиболее типичны антитела субклассов IgG1 и IgG3 [4]. Отсутствие коммерческих тест-систем затрудняет сопоставление и оценку результатов. Тем не менее, было показано, что у больных краснухой сначала появляются специфические IgM, затем низкоаффинные IgA и IgG3, и только после этого - высокоаффинные IgG1 [5], то есть для первичного иммунного ответа преобладающим субклассом специфических антител являются IgG3, а для вторичного иммунного ответа - IgG1 [6,7]. Этот феномен может быть использован для разделения первичного и вторичного иммунного ответа на вирусы краснухи.

Наиболее близкое техническое решение описано в статье А.П. Топтыгиной [6]. В статье на примере привитых и ревакцинированных против вирусов краснухи детей было показано, что через месяц после вакцинации в противокраснушном иммунном ответе IgG1 и IgG3 - антитела составляли 55,3% и 43,9% от общего количества противокраснушных IgG антител, через год преобладающим субклассом оказался IgG1, который составил 78,8%, а после ревакцинации IgG1 субкласс составил 73,5%. Тем не менее, не было выявлено четких критериев дифференциальной диагностики первичного и вторичного иммунного ответа. Так у давно переболевших и привитых в детстве взрослых, имевших, несомненно, вторичный тип иммунного ответа, количество специфических IgG1 составило 72% и 68%, соответственно.

Задачей изобретения является разработка способа дифференциальной диагностики первичного и вторичного иммунного ответа на вирус краснухи.

Поставленная задача достигается за счет того, что разделение типов иммунного ответа на первичный и вторичный осуществляется на основании рассчитанных пороговых критериев (cut off) по результатам определения количества специфических противокраснушных антител, принадлежащих к субклассам IgG1 и IgG3, определенных методом иммуноферментного анализа.

Пример. Проводилась дифференциальная диагностика первичного и вторичного типа иммунного ответа на антигены вирусов краснухи в сыворотках крови детей через 1 месяц после первичной вакцинации (60 человек, группа 1) или ревакцинации (28 человек, группа 2) против краснухи.

Определение количества специфических антител против краснухи, принадлежащих к субклассам IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, проводилось ранее описанным методом [8, 9]. Для выявления наиболее информативных показателей субклассов специфических антител, образующихся после прививки Приорикс, позволяющих различить первичный и вторичный гуморальный ответ на антигены вирусов, входящих в состав вакцины, был проведен ROC-анализ полученных данных для группы 1 (первичный иммунный ответ) и группы 2 (вторичный иммунный ответ). Определение количества специфических IgG1 для антигенов вирусов краснухи соответствовало высокой вероятности правильного разделения на первичный и вторичный иммунный ответ, площадь под ROC кривой (AUC) составила 0,970 (0,932-1,008) (р<0,01). Оценка содержания IgG3 к вирусу краснухи характеризовалась хорошим прогностическим качеством модели, AUC 0,680 (0,528-0,832) (р<0,05). Вероятность правильного прогноза разделения на первичный и вторичный тип иммунного ответа на основе определения специфических IgG4 не превышала вероятности случайных событий. Для IgG2 расчет не проводили ввиду отсутствия специфических антител данного субкласса у привитых детей. Для антител субклассов IgG1 и IgG3 прослеживались прямо противоположные зависимости. Чем больше количество IgG1 - антител и меньше количество IgG3 - антител, тем вероятнее, что данный человек отвечает по типу вторичного иммунного ответа, и наоборот. На Рисунке 1 представлены ROC-кривые, полученные в результате анализа количества специфических антител субклассов IgG1 и IgG3 через 1 месяц после прививки против краснухи для определения типа иммунного ответа (первичный или вторичный гуморальный иммунный ответ). Для определения уровня порогового значения количества субклассов антител (cut-off) были выбраны наиболее информативные показатели - количество специфических антител IgG1 и IgG3 субклассов. Результаты расчета значения cut off представлены в Таблице 1.

В связи с тем, что определение количества специфических IgG антител и их субклассов для антигенов вирусов краснухи сильно различаются в зависимости от использования тех или иных тест систем, результаты были представлены в виде процента от общего количества противокраснушных IgG антител, что позволило объединить всех лиц, отвечающих по первичному типу иммунного ответа или по вторичному типу иммунного ответа, независимо от возраста и использованной тест-системы. На Рисунке 2 представлены ROC-кривые, полученные в результате ROC-анализа процента специфических антител субклассов IgG1 и IgG3 от общего специфического иммунного ответа на антигены вирусов краснухи для определения типа иммунного ответа (первичный или вторичный гуморальный иммунный ответ).

На основании этих ROC кривых были рассчитаны площади под кривыми и значения порогового критерия. Предложенная модель характеризовалась очень высоким прогностическим качеством (р<0,01).Результаты расчетов представлены в Таблице 2.

Таким образом, независимо от количества специфических антител, определяемых в той или иной тест-системе, если для краснухи количество специфических антител субкласса IgG1<62,76% от общего иммунного ответа на этот вирус и IgG3>18,63%, то с вероятностью более 95% это первичный иммунный ответ, а если IgG1>62,76% и IgG3<18,63%, то это вторичный иммунный ответ. Предложенный метод дифференциальной диагностики первичного и вторичного иммунного ответа на вирус краснухи продемонстрировал высокую чувствительность и специфичность (см. Таблицу 2).

В качестве примера в Таблице 3 приведено процентное содержание противокраснушных антител субклассов IgG1 и IgG3 у женщин, впервые привитых вакциной против краснухи через 1 месяц после прививки (группа 1), беременных женщин, привитых в детстве против краснухи (группа 2), и беременных женщин с неизвестным прививочным анамнезом, проконтактировавших с больным краснухой (группа 3).

Используя значения порогового критерия из таблицы 2, находим, что у всех обследованных женщин, впервые привитых перед беременностью вакциной против краснухи (группа 1), через месяц после прививки значения специфических антител субкласса IgG1 были менее пороговых значений (62,76%), а антитела к вирусу краснухи субкласса IgG3 превышали значение cut off (18,63%), то есть эти женщины отвечали на прививку первичным иммунным ответом, что типично для ранее не привитых людей. Все беременные женщины группы 2, привитые против краснухи в детстве, демонстрировали вторичный тип иммунного ответа (значения IgG1 превышали уровень cut off, а уровень IgG3 был ниже cut off). В группе 3 ситуация была не столь однородной. Так женщины под номерами 11, 13 и 14 имели уровень специфических IgG1 антител выше значения cut off, a IgG3 - ниже cut off. Это означает, что несмотря на контакт с больным краснухой и неизвестный прививочный анамнез, им беспокоиться не стоит - их организм отвечает на вирусы краснухи вторичным типом иммунного ответа, то есть в действительности они были привиты против краснухи и имеют надежную защиту. А вот у женщины под №12 ситуация иная. Ее противокраснушные антитела субкласса IgG1 оказались ниже уровня cut off, а антитела субкласса IgG3 - выше cut off, то есть она демонстрирует первичный тип иммунного ответа. Это неблагоприятный прогноз. Это означает, что женщина не имела защитных антител против вирусов краснухи и была инфицирована в результате контакта с больным краснухой (отсутствие сыпи не является важным, т.к. заболевание может протекать и в стертой форме). Эта женщина имеет очень высокий риск внутриутробной патологии плода, поэтому ей может быть рекомендовано прерывание беременности. Таким образом, предложенный метод позволяет оценивать процесс формирования иммунитета после прививки или заболевания, но, главное, позволяет провести дифференциальную диагностику для людей группы риска (беременные женщины с неясным прививочным анамнезом и особенно в случае контакта с больны краснухой). Это особенно важно, поскольку решается вопрос о прерывании беременности.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа дифференциальной диагностики первичного и вторичного иммунного ответа на вирусы краснухи, позволяющего независимо от способа получения этого иммунитета (вакцинация или инфекция) четко различать первый или повторный контакт организма с вирусом краснухи. Такие знания позволяют выявить среди лиц с неизвестным прививочным анамнезом группу первичных больных краснухой, что при наличии беременности у данной больной угрожает осложнениями в виде формирования пороков развития плода, спонтанных абортов и преждевременных родов; и группу привитых в детстве от краснухи, что, несмотря на контакт с больным краснухой, не несет угрозы заболевания и формирования указанных осложнений. Разработанный способ дифференциальной диагностики первичного и вторичного иммунного ответа на вирусы краснухи помогает осуществлять контроль за качеством противокраснушного иммунитета населения и анализировать случаи первичных и вторичных вакцинальных неудач.

ЛИТЕРАТУРА

1. Нисевич Л.Л., Бахмут Е.В., Талалаев А.Г. и др., Врожденная краснуха и ее роль в развитии внутриутробной инфекции. // В кн. Краснуха. Синдром врожденной краснухи. М. - СПб. 1997: 31-33.

2. Ярилин А.А. Иммунология. - М.: «ГЭОТАР-Медиа», 2010: 752.

3. Thomas Н. I. and Morgan-Capner P. Rubella-specific IgG subclass avidity ELISA and its role in the differentiation between primary rubella and rubella reinfection. Epidemiol Infect. Dec 1988; 101(3): 591-598.

4. Gregorek H., K. Madaliński, M. Woynorowski, J. Mikołajevicz, M. Syczewska, and J. Socha. The IgG subclasse profile of ant-HBs rersponse in vaccinated children and children seroconverted after natural infection. Vaccine 2000; 18: 1210-1217.

5. Wilson K.M., Di Camillo C., Doughty L., Dax E.M. Humoral immune response to primary rubella virus infection. Clin Vaccine Immunol. 2006; 13(3): 380-6.

6. Топтыгина А.П., Алешкин B.A. Сопоставление первичного и вторичного гуморального иммунного ответа на вакцинацию «Приорикс». Инфекция и иммунитет. 2013; 3(4): 359-364.

7. Топтыгина А.П. Общие закономерности формирования и поддержания специфического гуморального иммунного ответа на примере ответа на вирусы кори и краснухи. Инфекция и иммунитет.2014; 4(1): 7-14.

8. Топтыгина А.П., Пухальский А.Л., Мамаева Т.А., Алешкин В.А. Спектр субклассов противокоревых иммуноглобулинов G у лиц, перенесших корь. Бюлл. экспер. биол. 2004; 137(3): 293-295.

9. Топтыгина А.П., Алешкин В.А. Созревание специфического гуморального ответа у детей, привитых вакциной «Приорикс». Иммунология. 2008; 29(6): 353-356.