Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ ПЛАЦЕНТАРНОГО ТИПА

Изобретение относится к области медицины, а именно биохимии, и может быть использовано, в частности, для выделения щелочной фосфатазы плацентарного типа.

В практике известен способ выделения щелочной фосфатазы плацентарного типа, основанный на бутаноловой экстракции, осаждении ацетоном, тепловой обработке, преципитации сульфатом аммония, ионообменной и гель-проникающей хроматогоафии (Lehman F.G., Lehman W. Regan-Isoenzym: Isolierung der alkalischen Phosphatase aus menschlicher Placenta und Entwicklung. Vern. Dtsch. Ges. Inn. Med. Kongr. Wiesbaden, 1974, Mimchen, 1974, p. 1658-1661).

Недостатками этого способа являются: трудоемкость; длительность проведения; невысокий выход продукта и недостаточная его чистота.

Наиболее близким к предлагаемому является прототип - способ выделения щелочной фосфатазы плацентарного типа путем гомогенизации ткани плаценты до однородной массы, экстракции 10 мМ трис-HCl буфером pH 7,0 в соотношении 1:4, содержащим 20% бутанол, в течение 6-8 часов при температуре 0-2°C, основанный на использовании аффинной хроматографии на СоА-сефарозе. Авторами описан усовершенствованный метод выделения щелочной фосфатазы из человеческой плаценты (CHANG Т-С, HUANG S-M., HUANG Т-М. and CHANG G-G. Human placental alkaline phosphatase. An improved purification procedure and kinetic studies. Eur. J. Biochem. 1992, v. 209, pp. 241-247). Очистка фермента проводилась путем последовательных Конка-навалин-A-Sepharose и Q-Sepharose хроматографии. Высокоочищенный фермент был получен с 39% выходом.

Однако данный способ выделения щелочной фосфатазы плацентарного типа имеет следующие недостатки:

- трудоемкость;

- необходимость использования дорогостоящих реактивов и оборудования;

- длительность проведения (72-96 часов);

- низкий выход продукта и недостаточная его чистота.

Изобретение направлено на упрощение и ускорение выделения щелочной фосфатазы плацентарного типа, а также на увеличение выхода и степени ее чистоты.

Указанный технический результат достигается тем, что смесь, полученную после гомогенизации и экстракции из ткани плаценты, через сутки центрифугируют с диэтиловым эфиром в течение 40-45 мин при 10000 об/мин последовательно 2-3 раза в соотношении 1 часть диэтилового эфира и 5 частей гомогената, собирают водную фазу и далее проводят аффинную хроматографию щелочной фосфатазы плацентарного типа на иммобилизованном лектине бодяги речной, после чего промывают 1М раствором NaCl, забуференным трис-HCl буфером и элюируют связанную на колонке щелочную фосфатазу плацентарного типа 0,1 М раствором лактозы в боратном буфере с pH=9,0.

Выделение щелочной фосфатазы плацентарного типа проводят следующим способом. Для приготовления экстракта, содержащего щелочную фосфатазу плацентарного типа, кусочки плаценты взвешивали, мелко нарезали, гомогенизировали до однородной массы, добавляя при этом 10 мМ трис-HCl буфер pH 7,0 в соотношении 1:4, содержащий 20% бутанол, и перемешивали в течение 6-8 часов при температуре 0-2°C.

Через сутки указанную смесь центрифугировали с диэтиловым эфиром в течение 40-45 мин при 10000 об/мин в рефрижераторной центрифуге 2-3 раза в соотношении 1 часть диэтилового эфира и 5 частей гомогената. После центрифугирования водную фазу, содержащую щелочную фосфатазу плацентарного типа, помещали в колбу и на сутки оставляли в холодильнике. Затем еще раз центрифугировали и определяли общий белок и активность щелочной фосфатазы в надосадочной жидкости.

Заключительная стадия выделения щелочной фосфатазы плацентарного типа представляет собой аффинную хроматографию щелочной фосфатазы на иммобилизованном лектине бодяги речной. Через колонку (1,5×12 см) лектин-сефарозы, уравновешенную трис-HCl буфером, пропускали весь объем полученной на предшествующей стадии фракции. Далее колонку промывали 1М раствором хлорида натрия, забуференного трис-HCl буфером, а затем элюировали связанную на колонке щелочную фосфатазу плацентарного типа 0,1 М раствором лактозы в боратном буфере с pH=9,0. Полученный элюат диализовали и концентрировали до приемлемого объема (17 мл).

Нами обнаружена способность лектина бодяги речной (Ephydatia fluviatilis) преципитировать щелочную фосфатазу плацентарного типа. На рис.1 (преципитация препаратов щелочной фосфатазы плацентарного типа лектином бодяги речной) показана преципитация фракций поэтапного выделения щелочной фосфатазы из плаценты по сравнению со стандартным препаратом плацентарной щелочной фосфатазы в агаровом геле, содержащем лектин бодяги речной (1 - стандартный препарат плацентарной щелочной фосфатазы (Sigma 100 мкг/мл); 2 - бутанольный экстракт плаценты; 3 - водная фаза бутанольного экстракта плаценты; 4 - фракция, после аффинной хроматографии. Агаровый гель содержит полуочищенный лектин бодяги речной в конечной концентрации 1,0 мг на 100 мл агара. Окраска на общий белок амидо-черным В).

Образцы №2, 3, 4 стандартизованы по уровню общего белка и приведены по концентрации его к уровню в коммерческом препарате плацентарной щелочной фосфатазы (Sigma) - 100 мкг/мл.

Снижение диаметра колец преципитации обусловлено повышением степени очистки щелочной фосфатазы плацентарного типа и уменьшением количества балластных белков, способных преципитироваться лектином бодяги речной.

На рис. 2 (электрофорез в полиакриламидном геле), где A - водно-солевой экстракт плаценты; В - бутанольный экстракт; C - фракция щелочной фосфатазы плацентарного типа после аффинной хроматографии, показано, что препарат щелочной фосфатазы плацентарного типа гомогенен при электрофоретическом контроле чистоты.

Предлагаемый способ был успешно апробирован на кафедре общей и биоорганической химии ГБОУ ВПО АГМА, с апреля 2010 года до мая 2013 года на 46 образцах человеческой плаценты, собранных в родильном доме 1 областной клинической Александро-Мариинской больницы г. Астрахани. Ниже приводятся результаты апробации.

Пример №1. 6.04.2010 г. получена плацента от женщины N., родившей здорового мальчика и не страдавшей поздними токсикозами. Для приготовления экстракта, содержащего щелочную фосфатазу плацентарного типа, кусочки плаценты взвешивали, мелко нарезали, гомогенизировали до однородной массы, добавляя при этом 10 мМ трис-HCl буфер pH 7,0 в соотношении 1:4, содержащий 20% бутанол, и перемешивали в течение 6 часов при температуре 0°C. Через сутки указанную смесь центрифугировали с диэтиловым эфиром в течение 40 мин при 10000 об/мин в рефрижераторной центрифуге последовательно 3 раза в соотношении 1 часть эфира и 5 частей гомогената. После центрифугирования водную фазу, содержащую щелочную фосфатазу плацентарного типа, помещали в колбу и на сутки оставляли в холодильнике. Затем еще раз центрифугировали и определяли общий белок и активность щелочной фосфатазы в надосадочной жидкости.

Заключительная стадия выделения щелочной фосфатазы плацентарного типа представляет собой аффинную хроматографию щелочной фосфатазы на иммобилизованном лектине бодяги речной. Через колонку (1,5×12 см) лектин-сефарозы, уравновешенную трис-HCl буфером, пропускали весь объем полученной на предшествующей стадии фракции. Далее колонку промывали 1М раствором хлорида натрия, забуференного трис-HCl буфером, а затем элюировали связанную на колонке щелочную фосфатазу плацентарного типа 0,1 М раствором лактозы в боратном буфере с рН=9,0. Полученный элюат диализовали и концентрировали до приемлемого объема (23 мл).

Пример №2. 13.09.2010 г. Получена плацента от женщины X., родившей здоровую девочку и не страдавшей поздними токсикозами. Для приготовления экстракта, содержащего щелочную фосфатазу плацентарного типа, кусочки плаценты взвешивали, мелко нарезали, гомогенизировали до однородной массы, добавляя при этом 10 мМ трис-HCl буфер pH 7,0 в соотношении 1:4, содержащий 20% бутанол, и перемешивали в течение 8 часов при температуре +2°C. Через сутки указанную смесь центрифугировали с диэтиловым эфиром в течение 45 мин при 10000 об/мин в рефрижераторной центрифуге последовательно 2 раза в соотношении 1 часть эфира и 5 частей гомогената. После центрифугирования водную фазу, содержащую щелочную фосфатазу плацентарного типа, помещали в колбу и на сутки оставляли в холодильнике. Затем еще раз центрифугировали и определяли общий белок и активность щелочной фосфатазы в надосадочной жидкости.

Заключительная стадия выделения щелочной фосфатазы плацентарного типа представляет собой аффинную хроматографию щелочной фосфатазы на иммобилизованном лектине бодяги речной. Через колонку (1,5×12 см) лектин-сефарозы, уравновешенную трис-HCl буфером, пропускали весь объем полученной на предшествующей стадии фракции. Далее колонку промывали 1М раствором хлорида натрия, забуференного трис-HCl буфером, а затем элюировали связанную на колонке щелочную фосфатазу плацентарного типа 0,1 М раствором лактозы в боратном буфере с рН=9,0. Полученный элюат диализовали и концентрировали до приемлемого объема (23 мл).

В таблице 1 показаны стадии выделения щелочной фосфатазы из плаценты человека. В таблице 2 приведена сравнительная характеристика предлагаемого способа выделения щелочной фосфатазы плацентарного типа с прототипом.

Предложенный нами способ упрощает (в прототипе выделение состоит из 5 стадий, если учесть, что авторы используют не первичный экстракт плаценты, а препарат фирмы Sigma, полученный бутанольной экстракцией по Fishman, а в предложенном нами способе - из 2 стадий), ускоряет в 2,6 раза выделение щелочной фосфатазы из плаценты человека по сравнению с прототипом и тем самым повышается эффективность способа (повышается выход конечного продукта на 14,4% по сравнению с прототипом).

Главное преимущество предлагаемого способа заключается в применении аффинной хроматографии на малоизученном лектине животного происхождения из бодяги речной. Этот лектин обладает высоким сродством к галактозосодержащим гликопротеинам. По нашим данным константа диссоциации лактозы с этим лектином составляет 1,34×10^-4 мМ. Это позволяет однократно повысить степень очистки в 289 раз (по сравнению с предыдущей стадией очистки). Самое главное, в отличие от прототипа, способ позволяет связать всю массу щелочной фосфатазы плацентарного типа, а не повторять многократно операцию хроматографии, выделяя за один сеанс не более 1 мг препарата.