ДИАГНОСТИКА ЗАБОЛЕВАНИЙ ПАРОДОНТА У БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике заболеваний пародонта у больных бронхиальной астмой, и может быть использовано для профилактики заболеваний пародонта в зависимости от тяжести основного заболевания - бронхиальной астмы.

Хронический пародонтит - широко распространенная стоматологическая патология, профилактика и лечение которой остается серьезной проблемой.

В настоящее время имеются научные данные о влиянии состояния пародонта на возникновение бронхолегочной патологии. Результаты стоматологического обследования пациентов, страдающих бронхиальной астмой, подтверждают у них высокую распространенность пародонтологических заболеваний (Крылова В.Ю. Оценка состояния полости рта у больных бронхиальной астмой: Диссертация канд. мед. наук: 14.01.14 / Крылова Вероника Юрьевна. - СПб. - 2009. - 132 с.). Научные исследования подтверждают, что назначение лекарственных препаратов, большинство из которых представлено ингаляционными кортикостероидами имеет, несомненно, положительное действие. С другой стороны, у таких пациентов отмечаются нарушения естественного защитного барьера слизистой оболочки полости рта, в слюне и в зубном налете определяется высокая концентрация патогенной микрофлоры, которая характеризуется особой агрессивностью и весьма сложно поддается лечению антибактериальными препаратами (Плахтий Л.Я. Клинико-микробиологические аспекты применения препаратов пролонгированного биоактивного действия в комплексной терапии пародонта / Л.Я. Плахтий, А.В. Митронин, А.И. Галабуева // Тез. Докл. Всероссийской научно-практической конференции Дентал-Ревю. - Москва, 2005. - С. 130-131). У больных, принимающих гормональные препараты для лечения бронхиальной астмы, степень тяжести хронического пародонтита более тяжелая, чем у пациентов, которые не получают гормонотерапию.

Из общего уровня техники известны различные способы диагностирования и прогнозирования течения пародонтита.

Известно определение клинических индексов, которые в своей совокупности лежат в основе методов диагностики хронического пародонтита: Папиллярно-маргинально-альвеолярный индекс - РМА - по E. Schour и J. Massler в модификации C. Parma, 1948; Гингивальный индекс по Loe и Silness, 1963; Пародонтальный индекс PI no A. Russel, 1956; Костный показатель по Fuchs, 1946; Комплексный пародонтальный индекс - КПИ - по П.А. Леусу, 1989; Индекс пародонтальной болезни - PDI - по Ramfiord, 1959; Индекс степени и тяжести поражений (Extent and Severity Index, ESI) no Carlos и соавт., 1986 и др. Однако все известные способы диагностики представляют собой лишь индексный эквивалент относительной распространенности клинических проявлений заболевания и отражают лишь те или иные клинически выявленные аспекты поражений пародонта, а следовательно, не могут быть использованы в качестве универсальных тестов, отражающих всю полноту клинического диагноза в пародонтологии.

Существующие клинические методы обследования больного, включая измерение глубины пародонтальных карманов по методике А.И. Лампусовой, 1980; оценку патологической подвижности зубов по методике А.И. Евдокимова, 1975; кровоточивости десны после зондирования по методике H.R Mühlemann, S. Son, 1971 и т.д., имеют основное значение для постановки диагноза, так как регистрируются уже в стадии клинических проявлений, но относительно малоэффективны в оценке прогноза заболевания. В то же время до сих пор не существует методов, которые давали бы полную оценку всех аспектов поражений пародонта и были бы пригодны при популяционных обследованиях.

Известен способ диагностики воспалительных заболеваний пародонта (ВЗП) путем биохимического исследования перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы защиты слюны (Безрукова И.В. Быстропрогрессирующий пародонтит. Этиология. Клиника. Лечение // Автореф. Дисс. … докт. мед. наук. М., 2001).

Эффективность такого метода диагностики обусловлена тем, что он позволяет определить избыточное накопление перекисных продуктов, являющихся патогенетическим признаком развития и дальнейшего прогрессирования острого воспаления, прямой предпосылкой к обострению хронических процессов и их осложненному течению.

Однако недостатком этого метода является то, что он недостаточно точен для постановки диагноза на ранних стадиях и при хроническом протекании воспалительного процесса без обострения, а также для определения степени тяжести пародонтита, так как перекисное окисление непрерывно протекает в норме во всех тканях живых организмов. Это требует дополнительного, более дифференцированного подхода в дальнейшей диагностике ВЗП.

Известен способ оценки свободно-радикального окисления ротовой жидкости посредством определения активности супероксиддисмутазы - фермента, регулирующего скорость свободно-радикального окисления, химическим путем (С. Чавари, И. Чаба, И. Секей. Лабораторное дело. - 1985. - № 11. - С. 678-681), но данный метод дорогостоящ, требует специальных лабораторных условий, трудоемок.

Из патентной литературы также известны различные способы диагностирования и прогнозирования течения пародонтита.

Известен способ прогнозирования течения пародонтита (авт. свид. СССР 1210788) путем добавления исследуемой сыворотки больного в тест-системе с последующим определением титра последней. С целью повышения точности прогнозирования, исследуемую сыворотку в разведении 1:40 добавляют к тест-системе стандартной неадсорбированной агглютинирующей брюшно-тифозной сыворотке в разведении 1:20 и определяют суммарный ее титр после контакта с исследуемой сывороткой, высчитывают отношение первого к второму и при снижении этого показателя до значений ниже 1,2 прогнозируют благоприятное течение заболевания.

С целью упрощения способа оценки свободно-радикального окисления и подбора адекватного лечения воспалительных заболеваний пародонта с учетом активности окислительных процессов в ротовой жидкости используют способ оценки состояния свободно-радикального окисления в ротовой жидкости при воспалительных заболеваниях пародонта путем исследования ротовой жидкости, при этом в ротовой жидкости регистрируют уровень люминолзависимой хемилюминесценции и показатели максимальной вспышки от 0,8 до 5 условных единиц и светосуммы от 1,5 до 37 условных единиц оценивают как низкую активность свободно-радикального окисления, а в комплекс лечебных мероприятий вводят прооксиданты, показатели максимальной вспышки от 6,55 до 45 и светосуммы от 61 до 497 условных единиц оценивают как высокую активность свободно-радикального окисления и в комплекс лечения назначают антиоксиданты (пат РФ 2140633).

Известен способ диагностики воспалительно-деструктивных процессов в пародонте путем исследования микроциркуляции в слизистой оболочке десны (авт. свид СССР 1812490). С целью обеспечения дифференциальной диагностики измеряют скорость микроциркуляции и время реакции после воздействия сосудорасширяющего средства и при увеличении скорости менее чем на 15% и появлении реакции в течение 1-5 мин диагностируют гингивит, при увеличении скорости больше чем на 15% и появлении реакции 5-10 мин - пародонтит, а при снижении скорости и отсутствии реакции на сосудорасширяющие средства - пародонтоз.

Известен способ диагностики патологического процесса в тканях пародонта путем исследования ротовой жидкости (авт. свид. СССР 1640648). С целью повышения точности в образцах, содержащих высушенную ротовую жидкость, измеряют суммарную интенсивность полос поглощения при частотах 720, 950 и 1280 см^-1 и при значениях этого параметра от 84 до 645 относительно нормы диагностируют доклиническую стадию патологического процесса, а при значениях 63% и ниже - патологический процесс в тканях пародонта.

Известен способ диагностики пародонтита (пат. РФ 2389028), включающий исследование сыворотки крови, отличающийся тем, что у больного определяют уровень остеопротегерина и при содержании остеопротегерина от 8,000 до 11,999 пмоль/л регистрируют пародонтит легкой степени, при содержании остеопротегерина от 3,000 до 7,999 пмоль/л регистрируют пародонтит средней степени тяжести, при содержании остеопротегерина от 1,000 до 2,999 пмоль/л регистрируют пародонтит тяжелой степени.

Известен способ диагностики степени тяжести пародонтита (пат. РФ 2269138) путем исследования крови, отличающийся тем, что проводят исследование крови из десны пациента, определяют в крови из десны содержание фосфатидилинозитов и по показаниям содержания фосфатидилинозитов, выраженным в н.моль на 1 мг белка, диагностируют при значении концентрации фосфатидилинозитов 7 н.моль на 1 мг белка отсутствие патологии пародонта, при повышении концентрации фосфатидилинозитов до 10 н.моль на 1 мг белка диагностируют легкую степень пародонтита, при концентрации фосфатидилинозитов от 10 до 15 н.моль на 1 мг белка диагностируют среднюю тяжесть пародонтита, при концентрации фосфатидилинозитов выше 15 н.моль на 1 мг белка диагностируют пародонтит тяжелой степени тяжести.

Известен способ диагностики пародонтита, который предусматривает проведение биохимического исследования крови из десны пациента на наличие в ней простагландина Е2, арахидоновой кислоты и фосфатидилинозитов (пат. РФ 2280874). Способ предусматривает диагностику степени тяжести пародонтита путем биохимического исследования крови из десны, причем его отличительной особенностью является то, что при биохимическом исследовании крови из десны определяют содержание простагландина Е2 (ПГЕ2) и арахидоновой кислоты (АК) и фосфатидилинозитов (ФИ) и диагностируют: 1. тяжелую степень пародонтита при концентрации ПГЕ2 >1650 пг/мг; 2. среднюю степень пародонтита при концентрации ПГЕ2 ≤1650 пг/мг, арахидоновой кислоты >7,5 мас. %; 3. легкую степень пародонтита при концентрации арахидоновой кислоты ≤7,5 мас. %, фосфатидилинозитов >7 н.моль на 1 мг белка. Этот способ позволяет определить наличие воспалительного процесса пародонта. Однако он также не является достаточно точным для постановки диагноза на ранних стадиях и при хроническом протекании воспалительного процесса без обострения для определения степени тяжести пародонтита, поскольку не является достаточно объективным, т.к. не учитывает состояние общего иммунного статуса при пародонтите.

Известен способ диагностики степени тяжести пародонтита, включающий исследование крови, отличающийся тем, что в крови из кубитальной вены пациента определяют содержание Т-лимфоцитов, циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), иммуноглобулина G (Ig G) и при значении Т-лимфоцитов более 72,5%, ЦИК 24,7 у.е. и более, Ig G 20,3 и более диагностируют тяжелую степень, при значении Т-лимфоцитов от 68,8 до 72,5%, ЦИК от 16,3 до 24,7 у.е., Ig G 15,2 до 20,3 - среднюю, а при значении Т-лимфоцитов от 62,5 до 68,8%, ЦИК - 15,4-16,2 у.е., Ig G - более 12,4 до 15,2 - легкую степень (пат РФ 2364865). Материалом исследования в данном методе является кровь пациента, что в стоматологическом кабинете осуществить бывает не всегда просто и доступно. Кроме того, данный метод обладает дороговизной, трудоемок и не всегда доступен в практической медицине.

Наиболее близким к предложенному является способ диагностики степени тяжести пародонтита путем определения вакуолизированных нейтрофилов в периферической крови и слюне (авт. свид. СССР №1366947), выбранный в качестве прототипа. У больного берут из пальца кровь, к опытной пробе добавляют слюну пациента, а к контрольной - фосфатный буфер, инкубируют их в течение 1,5-2 ч в физиологических условиях, затем приготавливают мазки, определяют в них число вакуолизированных нейтрофилов и при повышении их содержания в опытной пробе относительно контроля на 9,8-19,7%, 20-30% и 30,3% и более диагностируют соответственно легкую, среднюю и тяжелую степень заболевания. Данный способ позволяет определить степень тяжести пародонтита. Однако он не является достаточно точным для постановки диагноза особенно на ранних стадиях и при хроническом протекании воспалительного процесса без обострения для определения степени тяжести пародонтита.

Общим недостатком перечисленных выше методов диагностики является:

- невозможность точного диагноза для больных бронхиальной астмой,

- известные методы обладают дороговизной, трудоемки и не всегда доступны в практической медицине.

Целью предлагаемого технического решения является повышение эффективности диагностики заболеваний пародонта для оценки тяжести течения уже развившегося процесса у больных бронхиальной астмой, создание простого и доступного метода диагностики за счет использования в качестве объекта для исследования слюны пациента.

Поставленная цель достигается за счет использования предлагаемого способа диагностики степени тяжести пародонтита у больных бронхиальной астмой, включающего определение нейтрофилов в исследуемой среде. При этом в качестве исследуемой среды используют слюну и смыв из полости рта пациентов, не принимающих и принимающих гормональные препараты, на определение в ней зрелых (EN-PO) и ранних (DPOH) нейтрофилов, при этом для пациентов, не принимающих гормональные препараты, при уменьшении EN-PO на 1,1-1,5% по отношению к норме и увеличении DPOH на 2,0-4,1% по отношению к норме диагностируют легкую степень пародонтита, среднюю степень - при уменьшении EN-PO на 6,4-10,4% по отношению к норме и увеличении DPOH на 6,7-10,2% по отношению к норме, тяжелую степень пародонтита - при уменьшении EN-PO на 11,4-14,2% по отношению к норме и увеличении DPOH на 12,5-17,0% по отношению к норме, для пациентов, принимающих гормональные препараты, диагностируют легкую степень при уменьшении EN-PO на 5,2-9,2% по отношению к норме и увеличении DPOH на 5,0-7,9% по отношению к норме, среднюю - при уменьшении EN-PO на 10,6-14,6% и DPOH на уровне нормы, а тяжелую - при уменьшении EN-PO на 16.7-20,2% по отношению к норме и уменьшении DPOH на 10.7-12,7% по отношению к норме.

Авторами была изучена роль ранних (двойных) нейтрофилов (DPOH) и зрелых (зрелых) нейтрофилов (EN-PO) в развитии хронического пародонтита у пациентов с бронхиальной астмой.

Среди клеточных факторов местной защиты в полости рта важнейшая роль принадлежит нейтрофилам. Нейтрофилы различаются по своему рецепторному составу. Популяция нейтрофилов, экспрессирующих ЭБ-рецепторы, составляет основной пул нейтрофилов периферической крови и обозначается как зрелые нейтрофилы (EN-РО). Нейтрофилы, экспрессирующие помимо ЭБ-рецепторов еще и комплементарные рецепторы, обозначаются как ранние (двойные) (DPOH) нейтрофилы-предшественники поздних нейтрофилов. Эти различия рецепторного аппарата определяют разную роль нейтрофилов в процессах защиты и воспаления. Именно зрелые нейтрофилы (EN-PO) обладают более высокой фагоцитарной активностью, набором ферментов, бактерицидных белков с их бактериолитическим действием, что обеспечивает также их участие в разрешении поврежденных при воспалении клеток и тканей организма.

Уменьшение содержания поздних нейтрофилов (EN-PO) свидетельствует о снижении клеточных механизмов защиты и должно компенсироваться увеличением количества ранних нейтрофилов (DPOH). Нормализация количества зрелых нейтрофилов (EN-PO) указывает на восстановление активности клеточных факторов местной защиты.

Авторами отмечено, что состояние тканей пародонта во многом зависит от тяжести течения бронхиальной астмы и приема ингаляционных или системных глюкокортикоидов. Следствием систематического приема пациентами глюкокортикоидов является нарушение иммунных реакций как в организме в целом, так и в ротовой полости. У таких пациентов отмечаются нарушения естественного защитного барьера слизистой оболочки полости рта, в слюне и в зубном налете определяется более высокая концентрация патогенной микрофлоры. Доказана роль иммунной системы в развитии патологии пародонта и бронхиальной астмы.

Всего было обследовано 47 пациентов с бронхиальной астмой.

Первую группу составили 23 пациента, не принимающих гормоны для лечения бронхиальной астмы, с наличием хронического пародонтита.

Вторую группу составили 24 пациента, принимающих гормоны для лечения бронхиальной астмы, с наличием хронического пародонтита.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Результаты приведены в таблице 1.

Пример 1. Исследование местного иммунитета полости рта

Местный иммунитет полости рта обеспечивается секреторными, гуморальными и клеточными факторами защиты.

Факторы местного иммунитета полости рта определяли в слюне (иммуноглобулины) и в смыве из полости рта (клеточные факторы).

Для иммунологических исследований использовали нестимулированную смешанную слюну в количестве 3-5 мл, собранную в течение 5 минут в пластиковую пробирку через час после еды и после предварительного полоскания полости рта водой.

Полученную пробу центрифугировали в течение 20 минут для удаления посторонних включений.

Для получения смыва из полости рта пациент полоскал рот 10 мл физиологического раствора 3-5 минут и собирал смыв в пластиковую пробирку. Пробирку с клетками смыва центрифугировали, осадок отмывали раствором Хенкса, затем добавляли раствор Хенкса до концентрации клеток 2×10⁶ кл/мл. Жизнеспособность клеток определяли по окрашиванию 0,3% раствором трипанового синего (окрашиваются только мертвые клетки). В реакцию допускался смыв с содержанием не менее 60% жизнеспособных нейтрофилов.

Изучали цитологию смыва, субпопуляционный состав с выявлением зрелых (EN-PO) и ранних нейтрофилов (DPOH) и их фагоцитарную способность по активности фагоцитоза (фагоцитарный индекс ФИ %) и его интенсивности (по фагоцитарному числу ФЧ).

Пример 2. Оценка субпопуляционного состава нейтрофилов

Проводили с помощью эритроцитарных маркеров в реакциях розеткообразования с выявлением числа зрелых нейтрофилов (EN-PO) в реакции спонтанного розеткообразования и ранних нейтрофилов (DPOH) в реакции комплементарного розеткообразования.

Непосредственно перед постановкой реакции готовили суспензию эритроцитарных маркеров. С этой целью отмывали физиологическим раствором эритроциты барана (ЭБ) центрифугированием до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет бесцветной. Если для этого требовалось более 3-х отмываний, данные эритроциты в реакцию не допускались. Из отмытого осадка готовили 0,5% суспензию эритроцитов на среде 199.

Пример 3. Определение числа поздних нейтрофилов (EN-PO)

Количество поздних нейтрофилов определяли в реакции спонтанного розеткообразования. Нейтрофилы имеют на своей поверхности рецепторы к эритроцитам барана (ЭБ-рецепторы), которые играют важную роль в выполнении клеткой своих функций. Эритроциты барана фиксируются ЭБ-рецепторами клетки с образованием вокруг нее «розетки».

К 0,1 мл осадка клеток добавляют 0,1 мл 0,5% раствора эритроцитов барана, инкубируют смесь при t-37°C 5 минут, далее в холодильнике 2 часа для образования розеток. Затем добавляют для фиксации розеток 0,05 мл 0,6 раствора глютаральдегида и оставляют на 20 минут при комнатной температуре. Отмывают от дальнейшего воздействия глютаральдегида физиологическим раствором 2 раза путем центрифугирования, затем делают мазки, сушат, фиксируют в спирте, красят по Романовскому-Гимза и подсчитывают число розеткообразующих нейтрофилов (Е - эритроцит, N - нейтрофил, РО - розеткообразование - EN-PO). Розеткой считается клетка, присоединившая не менее 3-х эритроцитов.

Пример 4. Определение количества ранних нейтрофилов (DPOH)

Количество ранних нейтрофилов определяли в реакции комплементарного розеткообразования. Ранние нейтрофилы, помимо ЭБ-рецепторов, имеют на своей поверхности рецепторы к комплементу (С) и поэтому обозначаются как двойные нейтрофилы (DPOH: D - двойные, РО - розеткообразующие, Н - нейтрофилы). При дальнейшем созревании и старении они утрачивают С-рецепторы.

В реакции комплементарного розеткообразования помимо эритроцитов (Е) барана используется стандартная гемолитическая сыворотка в разведении 1:200 с антителами (А) к эритроцитам барана.

Реакцию ставили в объемах: 2,0 мл гемолитической сыворотки с антителами (А) соединяли с 2,0 мл эритроцитов барана (Е), инкубировали при t -37°C 30 минут для образования комплекса (ЕА).

Стандартный сухой комплемент мыши разводили 1:10 и к 2,0 мл ЕА добавляли 2,0 мл комплемента (С), инкубировали при t -37°C 30 минут для образования комплекса ЕАС. Смесь отмывали в среде 199 дважды от избытка комплемента путем центрифугирования.

Далее 0,1 мл комплекса ЕАС соединяли с осадком нейтрофилов, инкубировали при t 37°C 30 минут и центрифугировали 5 минут для посадки ЕАС (Е - эритроцит барана; А - антитела; С - комплимент) на нейтрофилы.

Следующие этапы реакции не отличались от реакции спонтанного розеткообразования. К взвеси ЕАС с нейтрофилами добавляли 0,05 мл 0,6% раствора глютаральдегида для фиксации розеток, оставляя на 20 минут при комнатной температуре. Отмывали от глютаральдегида, делали мазки, сушили, фиксировали в спирте, окрашивали по Романовскому-Гимзе и подсчитывали число розеткообразующих клеток с двойными рецепторами (DPOH).

Полученные клинические данные подтверждаются иммунологическими исследованиями.

Полученные результаты в первой группе

Со стороны клеточных механизмов защиты отмечено снижение содержания зрелых нейтрофилов (EN-PO). Уменьшение количества зрелых нейтрофилов сопровождалось компенсаторным увеличением числа ранних нейтрофилов (DPOH). Таким образом, при патологии пародонта у пациентов с бронхиальной астмой, не принимавших гормональные препараты, наблюдается изменения взаимосвязей между клеточными механизмами защиты, особенно при тяжелом течении пародонтита. Эти изменения направлены на восстановление местного иммунитета в полости рта путем компенсаторной стимуляции клеточных факторов (DPOH).

Полученные результаты во второй группе

Со стороны клеточных факторов защиты отмечалось снижение содержания зрелых нейтрофилов (EN-PO). Соответственно активность фагоцитарного процесса была снижена в зависимости от тяжести течения пародонтита. Снижение содержания зрелых нейтрофилов (EN-PO) не сопровождалось компенсаторным увеличением числа ранних нейтрофилов (DPOH) при средней степени тяжести, а при тяжелом течении пародонтита наблюдалось даже снижение их количества.

Таким образом, местный иммунитет полости рта у пациентов с бронхиальной астмой, с патологией пародонта, принимавших гормональные препараты, характеризуется угнетением секреторных компонентов иммунитета в сочетании со снижением активности клеточных факторов защиты и их истощением при тяжелом течении пародонтита.

Результаты исследований показали:

1. Уменьшение числа поздних нейтрофилов в сопровождении с компенсаторным повышением количества ранних нейтрофилов не снижает активность фагоцитоза и патологический процесс протекает без осложнений. Таким образом, компенсаторное увеличение количества ранних нейтрофилов может быть прогностическим критерием неосложненного течения патологического процесса для пациентов первой группы.

2. При снижении числа поздних нейтрофилов (EN-PO) и отсутствии компенсаторного увеличения количества ранних нейтрофилов (DPOH) велика вероятность развития отека, что может быть прогностическим критерием развития отека у пациентов второй группы при средней тяжести пародонтита. Это объясняется способностью ранних нейтрофилов к выбросу лизосомальных энзимов, бактерицидных белков, что облегчает фагоцитарный процесс, но способствует отеку тканей.

3. Снижение количества как зрелых (EN-PO), так и ранних нейтрофилов (DPOH) указывает на развитие агранулоцитоза и способствует воспалению без нагноения, т.е. язвенно-некротическим процессам, что может быть прогностическим критерием развития язвенно-некротических процессов в полости рта у пациентов второй группы при тяжелой степени пародонтита.

Таким образом, доказана роль ранних нейтрофилов (DPOH) в развитии хронического пародонтита у пациентов с бронхиальной астмой. Местный иммунитет полости рта у пациентов с бронхиальной астмой, не принимающих гормональные препараты, и хроническим пародонтитом, характеризуется компенсаторным увеличением содержания ранних нейтрофилов. На фоне гормональной терапии содержание ранних нейтрофилов снижается и зависит от степени тяжести течения хронического пародонтита. Снижение показателей ранних нейтрофилов (DPOH) можно расценивать как прогностические критерии неблагоприятного течения пародонтита. Везде идет снижение зрелых нейтрофилов (см. таблицу 1).

Авторами на основе комплексных показателей клинических, лабораторных и функциональных методов исследования разработана методика, позволяющая повысить качество диагностики и профилактики заболеваний пародонта у пациентов с бронхиальной астмой. Полученные результаты внедрены в клиническую практику на кафедре пропедевтической стоматологии и материаловедения ГОУ ВПО МГМСУ им А.И. Евдокимова.