Результат интеллектуальной деятельности: КОМПОЗИТНЫЙ ЧУМНОЙ АНТИГЕННЫЙ F1-ДИАГНОСТИКУМ ДЛЯ ИНДИКАЦИИ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к иммунобиотехнологии, и может быть использовано в иммунохимической диагностике чумы у людей и животных при эпизоотологическом обследовании природных очагов и при производстве иммунных сывороток для определения активности антител к фракции 1 (F1) чумного микроба in vitro методом дот-иммуноанализа.

Сущность выявления специфических антител заключается в образовании комплексов антител исследуемой сыворотки, фиксированной на твердом носителе (например, на нитроцеллюлозной мембране), с антигенами, конъюгированными с ферментной, радиоизотопной, люминесцентной или оптической меткой.

Известен диагностикум эритроцитарный чумной антигенный для обнаружения специфических антител к фракции 1 (F1) чумного микроба в сыворотке крови производства Казахского научного центра карантинных и зоонозных инфекций им. М. Айкимбаева РГКП (Казахстан) (регистрационный номер РК-МТ-5№003645). Диагностикум представляет собой взвесь фиксированных эритроцитов, сенсибилизированных чумным антигеном F1, и предназначен для использования в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).

Среди недостатков эритроцитарных диагностикумов приводят следующие:

- трудность стандартизации эритроцитов и, как следствие, нестандартность эритроцитарных диагностикумов;

- отсутствие 100% специфичности для диагностикума чумного эритроцитарного поликлонального;

- возможность получения неспецифического результата за счет наличия в исследуемом материале протеолитических ферментов, гетероантигенов или некоторых химических примесей;

- возможность спонтанной агглютинации диагностикума в нормальной кроличьей сыворотке, используемой в качестве стабилизатора для разведения исследуемых материалов. [1, 2].

Известна тест-система иммуноферментная для выявления антител к чумному микробу (ИФА-АТ-Ф1 Yersinia pestis) [3, 4, 5]. Тест-система представляет собой полистироловые планшеты для ИФА однократного применения, сенсибилизированные чумным антигеном F1 и набор реактивов, необходимых для проведения ИФА. Для выявления специфического комплекса «антиген F1+антитела к F1» тест-система содержит стафилококковый белок А, конъюгированный с пероксидазой хрена. Тест-система предназначена для целей серодиагностики чумы путем выявления в сыворотке крови антител, специфичных к чумному F1 антигену методом прямого гетерогенного иммуноферментного анализа.

Данной тест-системе присущи те же недостатки, что и другим иммуноферментным тест-системам: необходимость наличия сложного и дорогостоящего оборудования, что требует дополнительной подготовки персонала; необходимость дополнительного этапа субстратного проявления комплексов антител с мечеными ферментом антигенами, что увеличивает время анализа; использование канцерогенных веществ.

Известен антигенный F1-диагностикум, разработанный на основе окрашенного полиакролеинового латекса [6]. Диагностикум представляет собой суспензию полиакролеиновых частиц, сенсибилизированных чумным антигеном F1, и предназначен для иммунодиагностики чумы в реакции непрямой суспензионной агглютинации пластинчатым методом (на предметном стекле) или пробирочным методом.

К недостаткам латексных диагностикумов относят то, что партии латекса разнятся по сорбционной активности, что затрудняет стандартизацию диагностикума; гидрофилизированные участки латексного носителя экранируют полимерные цепи иммунореагентов в поверхностном слое латексных частиц, что снижает чувствительность диагностикума; при использовании сорбционных методов нагрузки латексных частиц диагностикум снижает свою чувствительность в 4-8 раз уже в течение месяца; зачастую срок использования латексных диагностикумов сокращается за счет десорбции специфического белка с поверхности полимера из-за конкуренции с балластным белком, содержащимся в диагностикуме; и, наконец, латексным диагностикумам присущ недостаток, характерный для всех диагностикумов, используемых в иммуносуспензионных реакциях - неспособность выявить неполные антитела в прямых методах, что также уменьшает их чувствительность [6, 7, 8, 9].

Известен иммунодиагностикум для определения сывороточных антител к инфекционным агентам методом дот-иммуноанализа на пористых стрипах, представляющий собой водную взвесь частиц активированного угля с размерами менее 10 мкм, сорбционно связанных с одним из специфических иммунореагентов антигенами или антивидовыми антителами или стафилококковыми протеинами А или G при соотношении по массе маркера к иммунореагенту в диапазоне от 1000:1 до 10000:1 и стабилизированных высокомолекулярными полимерами. Основным недостатком является сравнительно низкая стабильность диагностикума из-за обратимости сорбционных связей в условиях длительного хранения и/или при хранении диагностикума без соблюдения «холодовой цепи».

Наиболее близким аналогом (прототипом) является диагностикум с углеродной меткой для дот-иммуноанализа, на которой сорбирован видоспецифический чумной капсульный антиген фракция 1 (F1), полученный из штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ [10]. Диагностикум представляет собой взвесь углеродных частиц неопределенного размера, сенсибилизированных чумным антигеном F1.

Основным недостатком прототипа является низкая стабильность диагностикума, приводящая к потере чувствительности при использовании в дот-иммуноанализе, и обусловлено это тем, что антиген F1 конъюгирован с углеродной частицей путем физической адсорбции, которая обратима и сопровождается процессом десорбции. При хранении диагностикума в нем устанавливается адсорбционное равновесие, выражающееся в том, что в диагностикуме всегда будет находиться некоторое количество антигена в свободном, несвязанном с оптической меткой состоянии. Несвязанные антигены будут конкурировать с сорбированным антигеном в иммунохимической реакции, тем самым снижая чувствительность диагностикума. Добавление в такой диагностикум неспецифических белков или полимеров, призванных блокировать свободные активные сорбционно-активные участки на оптической метке и предотвращать неспецифическое связывание диагностикума с выявляемыми антителами, приводит к конкуренции с сорбированным антигеном, что еще больше снижает чувствительность диагностикума. Кроме того, учитывая, что процесс десорбции зависит от температуры (чем выше температура, тем выше десорбция), то требуется соблюдение «холодовой цепи» при транспортировке и хранении такого диагностикума.

Задача изобретения заключается в создании чумного антигенного F1 диагностикума, позволяющего повысить чувствительность при индикации специфических антител.

Технический результат обеспечивает повышение чувствительности метода дот-иммуноанализа за счет стабилизации антигена на поверхности углеродной метки, что приводит к повышению эффективности анализа, позволяющего выявлять специфические антитела в более низких титрах.

Указанный технический результат достигается разработкой диагностикума для индикации специфических антител к F1 антигену чумного микроба, представляющего собой взвесь композитных частиц, состоящих из углеродной метки размером не более 500 нм, заключенных в полимерную матрицу, представляющую собой привитой сополимер бычьего сывороточного альбумина с чумным капсульным антигеном F1, при следующем соотношением компонентов, мг/мл:

при этом полученные частицы композита стабилизированы в забуференном физиологическом растворе рН 7,0-7,4 высокомолекулярными полимерами и неионными детергентами.

В заявляемом диагностикуме антиген F1 стабилизирован на поверхности матрицы композитных частиц путем ковалентных связей. Ковалентные связи значительно превосходят по силе адсорбционные связи и не позволяют антигену F1 находиться в диагностикуме в свободном состоянии, как в диагностикуме-прототипе. В результате предотвращается конкурентное взаимодействие свободных, несвязанных с углеродной меткой, молекул антигена F1 с антителами исследуемой сыворотки, фиксированными в виде пятна (реакционная зона) на мембране.

Кроме того, белковые молекулы, содержащиеся в жидкой части диагностикума для его стабилизации, могут неспецифически связываться с белками сыворотки крови в реакционной зоне за счет белок-белкового взаимодействия и экранировать тем самым активные центры специфичных к антигену F1 антител, выступая, таким образом, в роли конкурентов специфической реакции антиген-антитело в области реакционной зоны.

Ковалентно связанный антиген F1 позволяет вводить в диагностикум поверхностно-активные вещества, относящиеся к группе неионных детергентов (например, твин 20), обеспечивающие дополнительную стабилизацию композитных частиц диагностикума и предотвращающие указанные белок-белковые взаимодействия в реакционной зоне, что также приводит к повышению чувствительности предлагаемого диагностикума.

Приготовление композитного диагностикума состоит из нескольких этапов:

A. Приготовление оптической метки с частицами заданного размера;

Б. Приготовление композитного носителя путем создания на поверхности метки полимерной матрицы и его активация путем присоединения спейсера;

B. Формирование привитого сополимера чумного антигена F1 на поверхности активированного композита;

Г. Блокирование свободных активных групп спейсера;

Д. Очистка композитных частиц диагностикума и его стабилизация.

А) 0,5 г активированного таблетированного угля измельчают до мелкодисперсного порошка. Порошок увлажняют этанолом и взвешивают в дистиллированной воде в соотношении 1:20-1:30 и проводят ультразвуковую дезинтеграцию при частоте излучения 22 кГц и мощности 400 Вт в течение 10-20 мин.

Полученную угольную суспензию трижды отмывают дистиллированной водой от наполнителя, содержащегося в таблетированной форме угля, путем центрифугирования при 19000 g по 5 минут. Полученный осадок ресуспендируют в начальном количестве дистиллированной воды и повторно проводят ультразвуковую дезинтеграцию при указанном режиме.

Полученную угольную суспензию центрифугируют при 4700 g 5 мин для удаления крупных частиц угля. Супернатант содержит угольные частицы размером не более 500 нм (контролируется микроскопией).

Б) 5 мл угольной суспензии, приготовленной на первом этапе, содержащей 20-30 мг/мл угольных частиц, смешивают с 20 мл раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА), содержащего 5-10 мг/мл белка в 0,1 М фосфатно-солевом буфере (ФСБ) рН 7,0-7,4, при постоянном интенсивном перемешивании путем пипетирования. Полученную смесь обрабатывают ультразвуком 10 сек при 22 кГц и мощности 400 Вт. Смесь инкубируют при 4-10°С в течение 16-24 часов для физической адсорбции БСА на частицах оптической метки. По окончании адсорбции угольно-белковую суспензию отмывают трехкратно ФСБ рН 7,0-7,4 центрифугированием при 19000 g 20 мин. Осадок ресуспендируют в 5 мл 0,1 М ФСБ рН 7,0-7,4.

Для формирования полимерной матрицы 20 мл 25-50% глутарового альдегида (или иного бифункционального спейсера в подходящей концентрации) смешивают с полученной угольно-белковой суспензией при постоянном мягком перемешивании (переворачивание пробирки каждые 5-10 мин). При этом угольно-белковую суспензию добавляют в раствор глутарового альдегида небольшими порциями. Смесь инкубируют 3-5 часов при мягком перемешивании при комнатной температуре для формирования полимерной формы БСА на поверхности угольных частиц и формирования на поверхности функциональных групп (-СОН), способных связываться со свободными аминогруппами белков (- NH₂).

Образовавшуюся суспензию активированного композита отмывают от не прореагировавших компонентов 0,1 М ФСБ рН 7,0-7,4 дополнительно содержащим 0,01 - 0,005% неионного детергента (например, Твин 20), путем центрифугирования при 19000g 20 мин не менее 3-4 раз. Осадок ресуспендируют пипетированием в 5 мл 0,1 М ФСБ рН 7,0-7,4, содержащим 0,01-0,005% неионного детергента (Твин 20).

Добавление неионного детергента способствует стабилизации композитных частиц, что позволяет проводить многократное центрифугирование и ресуспендирование, обеспечивающее возможность полноценной очистки диагностикума от непрореагировавших реагентов.

В) К 5 мл полученной суспензии активированного композита добавляют 1 мл раствора чумного F1-антигена (концентрация 1-5 мг/мл) при постоянном перемешивании. Полученную смесь инкубируют при комнатной температуре 3-5 часов при мягком перемешивании (не использовать вортекс или ультразвук). При увеличении времени инкубации увеличивается количество ковалентно связанного антигена.

Г) К 5 мл полученных композитных частиц, содержащих полимерную матрицу в виде привитого сополимера F1, для блокировки свободных активных групп спейсера добавляют 3 мл 1М раствора лизина (рН 7,0). Смесь инкубируют 2-5 часов при мягком перемешивании.

Д) Полученную взвесь композитных частиц диагностикума отмывают от несвязавшихся реагентов центрифугированием при 19000g 20 мин (не менее 3-4 раз) 0,1 М ФСБ, рН 7,0 - 7,4, содержащим 0,01-0,005% Твина 20.

После отмывки частиц диагностикума осадок ресуспендируют пипетированием в 5 мл забуференного физиологического раствора, рН 7,2-7,4, содержащего 0,5% БСА и 0,01-0,005% Твина 20, а для консервации добавляют мертиолят натрия в конечном разведении 1:10000.

Возможность использования антигенного диагностикума подтверждается примерами его конкретного выполнения.

Пример 1. Использование приготовленного диагностикума для выявления антител к антигену F1 в сыворотке крови.

Исследуемую сыворотку крови разводят забуференным физиологическим раствором до разведения 1:400. 2-3 мкл разведенной сыворотки крови наносят на стрип из нитроцеллюлозной мембраны (Владисарт, Россия) с размером пор 0,2 мкм. Стрип высушивают на воздухе в течение 15 минут. Высушенный стрип помещают в блокирующий раствор (1-3% раствор БСА в 0,1 М ФСБ) на 30 минут при комнатной температуре. Заблокированный стрип промывают физиологическим раствором с 0,05% Твина 20. На стрип наливают готовый диагностикум и инкубируют при комнатной температуре 30-60 мин. По окончании инкубации стрип промывают дистиллированной водой и высушивают на фильтровальной бумаге. При наличии в исследуемой сыворотке крови антител, специфичных к чумному капсульному антигену F1, на месте нанесения сыворотки крови образуется серое пятно, отличное от фона (фиг. 1). На фигуре 1 приведен дот-иммуноанализ с использованием заявляемого диагностикума. Цифрами обозначены ряды дот-иммуноанализа с различными образцами сыворотки крови. Ряд 1 - дот-иммуноанализ с образцами сыворотки крови, содержащими антитела к антигену F1 чумного микроба, Ряд 2 - дот-иммуноанализ с образцами сыворотки крови, не содержащими указанных антител.

На стрип может быть нанесено несколько проб сывороток крови от различных животных или людей.

Пример 2. Определение титра антител в сыворотке крови.

Готовят двукратные разведения исследуемой сыворотки крови. На нитроцеллюлозный стрип аликвотами по 2 мкл наносят каждое разведение сыворотки крови. Все дальнейшие манипуляции проведения дот-иммуноанализа идентичны примеру 1.

Результат приведен на фигуре 2. На фигуре цифрами обозначены столбцы проб, содержащих различные разведения испытуемой сыворотки. Верхний ряд содержит двухкратные разведения сыворотки, (слева направо) от 1:50 до 1:800, нижний ряд - разведения сыворотки от 1:1600 до 1:25000.

Учет результатов: Титр антител в сыворотке крови определяется по последнему разведению, в котором выявляется пятно серого цвета, хорошо отличимое от фона стрипа.

Пример 3. Сравнение чувствительности дот-иммуноанализа с использованием заявляемого композитного диагностикума и диагностикума-прототипа.

Готовят двукратные разведения сыворотки крови, содержащей антитела к фракции 1 (F1) чумного микроба. Из каждого разведения сыворотки по 2-3 мкл наносят на два стрипа из нитроцеллюлозной мембраны (Владисарт, Россия) с размером пор 0,2 мкм. Все дальнейшие манипуляции проведения дот-иммуноанализа идентичны примеру 1. За исключением того, что один стрип обрабатывается предлагаемым диагностикумом, а второй обрабатывается диагностикумом-прототипом. По окончании инкубации стрипов, их промывки и высушивания учитывают результат. Результат приведен в таблице, из которой видно, что полученный композитный чумной антигенный F1-диагностикум характеризуется более высокой чувствительностью в дот-иммуноанализе, чем прототип, позволяя выявлять специфические антитела в более высоких титрах.

Таким образом, за счет повышения стабильности диагностикума, достигаемого в результате включения чумного антигена F1 в состав матрицы композита в качестве привитого сополимера, чувствительность метода дот-иммуноанализа повышается в 4 раза, а эффективность выявления антител возрастает.

Источники патентной и научно-технической информации

1. Зайцев А.А. Теоретическое и научно-методическое обоснование использования белковых фракций чумного микроба при создании новых диагностических препаратов и тест-систем / Автореферат на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.23 Биотехнология.- Ставрополь, 2006.

2. Патент РФ 2493871. - Способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) с целью индикации бруцелл в патматериале /Яникова Э.А., Юсупов О.Ю., Хаиров С.Г. - Опубликовано 27.09.2013.

3. ТУ 9388-041-01898109-2011 «Тест-система иммуноферментная для выявления антител к чумному микробу (ИФА-Ат_Ф1 Yersinia pestis».

4. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител к чумному микробу / Девдариани З.Л., Терешкина Н.Е., Голова А.Б., Шарова И.Н., Аленкина Т.В., Лобовикова О.А., Шульгина И.В., Ермаков Н.М., Терехова И.В., Полунина Т.А., Тараненко Т.М., Киреев М.Н. // Метериалы конференции 3-ей научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности».- 31 мая-2 июня, 2011 г. - Оболенск, 2011.- с. 178 - 180.

5. Результаты модельных экспериментов по конструированию тест-системы иммуноферментной для выявления антител к Ф1 чумного микроба (ИФА-Ат_Ф1 Yersinia pestis) / Девдариани З.Л., Терешкина Н.Е., Тараненко Т.М., Киреев М.Н., Терехова И.В., Григорьева Г.В., Исляева М.Н., Ермаков Н.М., Виноградова Н.А., Малахаева А.Н./ Проблемы особо опасных инфекций.- вып. 1, 2013.- с. 74-77.

6. Патент РФ 2199750. Способ получения диагностикума суспензионного антигенного на основе фракции 1. / Зайцев А.А. - Опубликовано 27.02.2003.

7. Патент РФ 2298798. Способ контроля биологической пробы в реакции латекс-агглютинации и аналитическая система осуществления./ Зимина Т.М. с соавт.- Опубликовано 10.05.2007.

8. Патент РФ 2231366. Иммунодиагностикум на основе полистирольного латекса./ Леонова В.Б., Розенфельд М.А. - Опубликован 27.06.2004.

9. Вершигора А.Е. Общая иммунология //Киев «Выща школа».- 1990.- 736 с.

10. Использование дот-иммуноанализа с углеродной меткой для тестирования специфических антител к возбудителям чумы и холеры / Полунина Т.А., Киреев М.Н., Тараненко Т.М., Громова О.В., Захарова Т.Л. //Биотехнология.- 2007.-№6.- С. 72-75.

Композитный чумной антигенный

F1-диагностикум для индикации

специфических антител