Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО ВОСПАЛЕНИЯ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ У ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной инструментальной диагностике, и предназначено для диагностики неспецифического воспаления мышечной ткани у лабораторных животных.

Неспецифическое воспаление может вызываться различными флогогенными факторами - физическими, химическими факторами, условно-патогенной микрофлорой и т.д. (Литвицкий П.Ф. Патофизиология: учебник, IV издание, 2009 г., 496 с).

На сегодняшний день имеется множество способов диагностики воспаления. В клинической практики широко применяются исследования простейших лабораторных показателей, таких как повышение СОЭ, лейкоцитарный сдвиг в общем анализе крови (Ройтберг, Г.Е. Лабораторная и инструментальная диагностика заболеваний внутренних органов: учебное пособие для студентов медицинских вузов / Г.Е. Ройтберг, А.В. Струтынский. - М.: МЕДпресс-информ, 2011. - 17 с.). В литературе регулярно появляются данные о применении новых маркеров воспаления, например повышение в плазме крови пациента концентрации нитритов и N-нитрозосоединений (патент РФ 2461831). Однако лабораторные показатели хоть и могут быть индикаторами воспаления, но в большинстве своем неспецифичны и не способны указать локализацию воспалительного очага.

Инструментальные методы диагностики способны давать информацию не только о наличии воспаления, но и о его локализации. На сегодняшний день большой интерес представляет использование радионуклидной диагностики (сцинтиграфии) для определения локализации очагов воспаления (Сазонова С.И., Лишманов Ю.Б. Радиофармпрепараты для сцинтиграфической визуализации очагов воспаления // Медицинская радиология и радиационная безопасность. - 2007. - Т. 52. - №. 4. - С. 73-82). Имеются данные о применении радиофрампрепаратов, наиболее удобных для сцинтиграфической диагностики воспаления (патент РФ №2171691, патент РФ 2290952). Однако использование этих методов диагностики предполагает введение в организм радиоактивных изотопов, что неизбежно ассоциировано с лучевой нагрузкой, хоть и небольшой. Кроме того, радионуклидная диагностика - метод дорогостоящий.

Известны способы диагностики воспаления, основанные на применении лазеров, к которым относится и предлагаемое изобретение.

В результате проведенного патентно-информационного поиска ближайший аналог выявлен не был, однако наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является способ диагностики гнойного воспаления при помощи лазерного биофотометра (патент РФ 2092849). Так же, как и в предлагаемом нами способе, исследование основано на применении лазерной диагностики и сравнении показателей пораженной области и здорового участка. Метод основан на определении коэффициента отражения лазерного луча длиной волны, равной 0,89 мкм, от поверхности кожи в месте предполагаемого развития воспаления и в симметричном участке тела, при разнице в показателях лазерного биофотометра, равной 5 и более, диагностируют гнойное воспаление. Основные недостатки данного способа состоят в его недостаточной достоверности ввиду сильной зависимости коэффициента отражения на длине волны 0,89 мкм от разных исходных оптических характеристик поверхности кожи исследуемых, кровенаполнения, выраженности отека в зоне воспаления. Кроме того, способ применим для контроля только гнойного воспаления.

Техническим результатом изобретения является создание способа диагностики неспецифического воспаления мышечной ткани, простого, точного, достоверного, малотоксичного, не требующего больших материальных затрат, позволяющего наглядно отследить динамику неспецифических воспалительных процессов различной этиологии.

Для этого в способе диагностики неспецифического воспаления мышечной ткани у лабораторных животных, заключающемся в том, что лабораторному животному предварительно вводят фотосенсибилизатор, освещают область исследования мышечной ткани и соответствующую контралатеральную область тела низкоинтенсивным лазерным излучением и измеряют на поверхности ткани интенсивность излучения флюоресценции фотосенсебилизатора, не менее 5 значений в каждой области, рассчитывают индекс интенсивности воспаления по формуле ИИВ=I_{f ов}/I_{f кло}, где ИИВ - индекс интенсивности воспаления, I_{f ов} - средний показатель интенсивности флюоресценции области воспаления, I_{f кло} - средний показатель интенсивности флюоресценции контралатеральной области, и при значении ИИВ от 0,5 до 1,49 диагностируют отсутствие воспаления, при значении ИИВ от 1,50 до 1,99 диагностируют неактивный воспалительный процесс, при значении ИИВ от 2,00 до 5,50 диагностируют активный воспалительный процесс.

Заявленный нами способ основан на применении метода лазерной флюоресцентной диагностики для регистрации спектра вторичного излучения ткани при ее зондировании лазерным излучением.

Для исследования используют лабораторных животных, у которых смоделировано неспецифическое воспаление мышечной ткани любым известным способом (например, с помощью физического, химического фактора). Измерение проводится на комплексе многофункциональной лазерной диагностики «ЛАКК-М» (режим работы комплекса ЛАКК-М -«Флюоресценция»), для возбуждения флюоресценции применяется источник на длине волны 630 нм. Заблаговременно до проведения исследования (от нескольких часов до суток в зависимости от используемого фотосенсебилизатора) лабораторному животному парентерально вводят фотосенсибилизатор порфиринового или фталоцианинового ряда из расчета 0,5-2 мг/кг массы тела, освещают поверхность кожи над областью исследования воспаления мышечной ткани и соответствующую контралатеральную область тела низкоинтенсивным лазерным излучением и измеряют интенсивность излучения флюоресценции фотосенсебилизатора, не менее 5 значений в каждой области. Рассчитывают индекс интенсивности воспаления по формуле ИИВ=I_{f ов}/I_{f кло}, где ИИВ - индекс интенсивности воспаления, I_{f ов} - средний показатель интенсивности флюоресценции области воспаления, I_{f кло} - средний показатель интенсивности флюоресценции контралатеральной области. Вышеуказанные средние показатели рассчитывают как среднее арифметическое полученных значений интенсивности флюоресценции в каждой из областей. При значении ИИВ 0,5-1,49 диагностируют отсутствие воспаления, при значении ИИВ 1,50-1,99 диагностируют неактивный воспалительный процесс, при значении ИИВ 2,00-5,50 диагностируют активный воспалительный процесс.

Данный метод может быть использован как в качестве основного, так и в качестве вспомогательного метода для диагностики неспецифического воспаления мышечной ткани, вызванного воздействием различных флогогенных факторов. Интенсивность флюоресценции в исследуемой области отображает интенсивность накопления препарата, следовательно, может служить показателем активности метаболических процессов в пораженной ткани. Сравнение флюоресценции пораженной области со здоровым участком тела позволяет качественно и количественно оценить интенсивность неспецифического воспалительного процесса в пораженной области.

Сопоставление исследуемого показателя флюоресценции с показателями крови и данными гистологического исследования демонстрирует чувствительность заявляемой методики.

Пример 1. Лабораторной мыши произвели разрез в области латеральной части паховой складки, тупым методом отделили кожу от фасции, на расстоянии 7 мм от разреза произвели размозжение участка мышцы зажимом «Москит», объем поражения составил 3×3×3 мм. После чего внутрибрюшинно ввели фотосенсибилизатор (Фотосенс из расчет 2 мг/кг), все манипуляции проводились под общей анестезией (Золетил + Ксилазин).

Измерение флюоресценции проводили до введения фотосенсибилизатора, и на 1, 2, 5, 7, 9, 12, 15 сутки после введения Фотосенса (Фиг. 1). Измеряли флюоресценцию непосредственно над местом воспаления и на симметричном здоровом участке тела, снимали по 5 показателей с каждой точки, высчитывали индекс интенсивности воспаления по формуле ИИВ=I_{f ов}/I_{f кло}, где ИИВ - индекс интенсивности воспаления, I_{f ов} - средний показатель интенсивности флюоресценции области воспаления, I_{f кло} - средний показатель интенсивности флюоресценции контралатеральной области (Фиг. 2). Временные изменения показателя ИИВ предельно точно отражают динамику асептического воспалительного процесса, вызванного механическим повреждением: следующая за инициацией воспаления альтерация, занимающая период около часа, когда на месте травмы воспаления еще нет (1) но значение ИИВ существенно меняется, с 1,35 до 1,49, короткая фаза неактивного воспалительного процесса (2), занимающая около 5 часов (значение ИИВ меняется от 1,50 до 1,99), быстрый переход неактивного воспалительного процесса в активный (3) (значение ИИВ возрастает с 2,00 до 3,70 к началу вторых суток после инициации), продолжающийся в течение недели (значение ИИВ постепенно снижается с 3,70 до 2,00), и последующее стихание воспаления (переход в неактивный воспалительный процесс (2′)) за последующие 5 суток (снижение значения ИИВ до 1,48), полное заживление, воспаления нет (1′).

Пример 2. Лабораторной мыши произвели разрез в области латеральной части паховой складки, тупым методом отделили кожу от фасции, на расстоянии 7 мм от разреза произвели термическое поражение мышцы (площадь повреждения 3×3×3 мм), чем инициировали местное неспецифическое воспаление. После чего внутрибрюшинно ввели фотосенсибилизатор (использовали Фотосенс из расчет 0,5 мг/кг). Все манипуляции проводились под общей анестезией (Золетил + Ксилазин) -внутрибрюшинное введение.

Измерение флюоресценции проводили до введения фотосенсибилизатора и на 2, 6, 9, 13 сутки после введения Фотосенса. Измеряли флюоресценцию непосредственно над местом воспаления и на симметричном здоровом участке тела, снимали не менее 5 показателей с каждой точки (Фиг. 3). Рассчитывали индекс интенсивности воспаления по формуле ИИВ=I_{f ов}/I_{f кло}, где ИИВ - индекс интенсивности воспаления, I_{f ов} - средний показатель интенсивности флюоресценции области воспаления, I_{f кло} - средний показатель интенсивности флюоресценции контралатеральной области (Фиг. 4). Временные изменения показателя ИИВ предельно точно отражают динамику неспецифического воспалительного процесса в мышечной ткани, вызванного физическим (термическим) фактором: длительная альтерация, когда воспаления как такового еще нет (1), неактивный воспалительный процесс (2) развивается постепенно, занимая около суток, плавно переходя в длительный активный (3), устойчиво продолжающийся и зафиксированный на 13 сутки после инициации воспаления.

Способ был отработан на 20 лабораторных белых мышах (экспериментальная группа). У животных забирали цельную кровь для клинического анализа до эксперимента, на 3 и 10 сутки после инициации воспаления. На 10 лабораторных белых мышах (контрольная группа) было смоделировано неспецифическое воспаление мышечной ткани (5 животных с травматическим размозжением мышцы, 5 - с термическим поражением). Животные из группы контроля были выведены из эксперимента в сроки, при которых в экспериментальной группе были получены граничные значения ИИВ (переход неактивного воспалительного процесса в активный и наоборот) для последующего забора образцов тканей области воспаления и контралатеральной области.

Все интерпретированные результаты анализа полученных предлагаемым способом данных были сравнены с результатами клинического анализа крови, полученными в экспериментальной группе и гистологическим исследованием образцов мышечной ткани в контрольной группе для подтверждения корреляции параметров, наличия воспаления и интенсивности воспалительного процесса. На основании данной группы исследований нами получено достоверное подтверждение диагностики неспецифического воспаления предлагаемым способом.

Таким образом, способ диагностики неспецифического воспаления мышечной ткани прост, обладает высокой точностью, не требует больших материальных затрат, позволяет определить интенсивность воспалительного процесса и, при необходимости, наглядно отследить динамику неспецифических воспалительных процессов различной этиологии в мышечной ткани.