Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА БОЗЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЗАКВАСКИ

В объем настоящего изобретения входят способ производства и бактериальный состав производимой бозы (Boza), представляющей собой микробиологически, физически, химически и сенсориально определенную бозу, которая может демонстрировать одинаковые характеристики в каждом производственном цикле.

В объем изобретения входит ферментированная боза, получаемая путем инокуляции Lactobacillus plantarum GE223 и Wiessella confusa GE213 неферментированной бозы, приготовленной в соответствии с методом ее получения.

Физически, химически, микробиологически и сенсориально стандартная боза не может быть получена вследствие того, что традиционная технология производства бозы осуществляется в результате заражения неферментированной бозы причинными (causal) микроорганизмами, ранее присутствовавшими в окружающей среде, или путем прибавления остатков ферментированной бозы от последнего производственного цикла.

Оптимальная ферментация бозы зависит от заражения окружающей микрофлорой и может быть осуществлена только в определенный период года. Из-за перерыва в производстве, боза, производимая в следующем сезоне производства, не может поставляться потребителям до достижения желательной микрофлоры в окружающей среде и желательного вкуса, что приводит к потере продукта. Поскольку производство зависит от условий окружающей среды, оно не может контролироваться надлежащим образом, и в магазинах может продаваться неферментированная или переферментированная скисшая боза.

Новизна настоящего изобретения заключается в предложенном решении этих технологических проблем, заключающемся в разработке способа производства стандартизированной бозы и использовании композиции бактерий, выделенных из натуральной турецкой бозы (Turkish Boza). В данном изобретении были исследованы бактерии, выделенные из турецкой бозы, и пригодные бактерии были выбраны для получения комбинации бактерий, позволяющей обеспечить производство бозы, стандартной с микробиологической, химической и сенсориальной точек зрения.

Использование пекарских дрожжей (Saccharomyces sp.) вместо молочнокислых бактерий упоминается в патентах BG101548 ""Состав бозы и способ ее производства" (Boza composition и method for its production) и BG326 "Композиция для изготовления напитка бозы" (Composition for making Boza drink), полученных болгарскими авторами.

Zorba et al. (2003) описывают исследования производства бозы с использованием заквасок в своей публикации, озаглавленной "Использование заквасок для ферментации бозы, традиционного напитка" (The use of starter cultures in the fermentation of Boza, a traditional beverage) (process Biochemistry, 2003, 38, 1405-1411), но, хотя для инокуляции применяются бактерии, выделенные из бозы, вследствие использования для инокуляции нестерилизованной бозы, она содержит многие другие (конкурирующие) бактерии, и исключается возможность производства стандартной бозы в промышленных масштабах. Другим важным моментом, отличающим настоящее изобретение от других, является использование Wiessella confusa и Lactobacillus plantarum, которые не применялись в других патентах.

В патенте №BG60703 "Установка для производства напитка бозы и автоклав для нее" (Installation for the production of Boza drink and an autoclave for it) автоклав использовался не для стерилизации неферментированной бозы, а для тепловой обработки напитка бозы. В патенте №BG102205 "Способ приготовления безалкогольного напитка из зерновых культур" (Method for preparation of a soft drink from cereal crops) пастеризация или стерилизация используется для уничтожения бактерий в бозе, уже подвергнутой ферментации и готовой к употреблению, для увеличения срока хранения, но не для неферментированной бозы. Описанная боза производится без использования закваски и не содержит живых бактерий в готовом продукте, в отличие от нашего изобретения.

Особенностью, отличающей бактериальный состав по настоящему изобретению от коммерческих заквасок, является то, что он выделен из природной микрофлоры коммерческой рыночной бозы, не содержит дрожжей и не содержит неестественных генетических изменений. Для продуктов на основе зерновых культур обычно используются дрожжи вида Saccharomyces cerevisea, принадлежащего к роду Saccharomyces.

Lactobacillus plantarum GE223 и Wiessella confusa GE213 были выделены из бозы и не подвергались каким-либо генетическим манипуляциям, ранее они не применялись в качестве заквасок бозы. Свежая боза стандартного качества может быть произведена в любое время года путем инокуляции этой комбинацией бактерий стерилизованной неферментированной бозы.

Отличительной особенностью этой закваски является то, что она включает смесь двух молочнокислых бактерий с разными характеристиками. Из них L. plantarum GE213 является гомоферментативной, продуцирует кислотность, ацетоин и ароматические соединения, в то время как W. confusa GE213 является гетероферментативной и продуцирует разные органические кислоты и придает бозе характерный вкус. Кроме того, выбранные культуры имеют низкую скорость продуцирования кислот и газа. Боза, полученная в результате такого процесса, характеризуется как легкопьющийся напиток, имеющий слабокислый фруктовый вкус и вязкую (viscose) консистенцию.

Приготовление бозы

Пшеница, кукуруза, просо или другие зерновые культуры и их смеси, используемые в качестве сырьевого материала, измельчают в мельнице. Дробленое зерно кипятят в 4-5-кратном по отношению к используемому зерну объеме воды до его полного размягчения. Вареную смесь распределяют на поддонах и охлаждают до приблизительно 30°С до образования вязкой пасты. Пасту смешивают с 3 объемами добавленной воды, в зависимости от состава смеси и типа зерновых культур. Полученную жидкость, в которой не наблюдается разделение фаз, подвергают прямой фильтрации через сито с размером ячеек 0,2-0,5 мм или ее предварительно фильтруют через сито с более крупными ячейками для отделения крупных частиц пульпы и затем переносят на более мелкие сита. Полученная гомогенная вязкая жидкость представляет собой неферментированную бозу. Традиционно эту жидкость ферментируют путем смешения с сахаром в соотношении 10-15% в сосуде, в котором находятся остатки ферментированной бозы от предыдущего цикла производства бозы, и после достижения рН 5-5,5 ее дегустируют, охлаждают и потребляют.

В данном изобретении, для обеспечения возможности использования заквасок фильтрованную жидкую бозу пастеризуют (65-85°С в течение 10-30 минут) или стерилизуют (121°С в течение 5 минут) после прибавления сахара. После этого прибавляют в смесь закваску в соотношении половина-на-половину (half and half) (0,5+0,5%) в количестве 1% от общего объема бозы, так чтобы она содержала 10⁶ КОЕ/мл бактериальной смеси.

Эту комбинацию бактерий получают путем культивации двух бактерий (GE223 и GE213) раздельно на агаровой среде MRS (Ман-Рогоза-Шарп) в чашках петри и их смешения после раздельного доведения их концентраций с помощью стерильной физиологической воды, и прибавляют к неферментированной бозе. Бозу ферментируют при 25-30°С в течение максимум 16 часов до тех пор, пока ее значение рН не снизится до рН 4,5-5, и она будет готова к употреблению после достижения этой кислотности. После ферментации бозу хранят при 4-5°С. Боза сохраняет свой вкус до рН 3,9, и многие потребители считают ее скисшей при достижении значения рН 3,8.

Свойства выбранных микроорганизмов, используемых в бозе

Культуры, обозначенные L. plantarum GE223 и W. confusa GE213, были идентифицированы с использованием набора Biomerieux® Mini-API 50 СН. Тесты, выполненные с помощью этих наборов, показали, что GE223 утилизирует D-рибозу, D-галактозу, D-глюкозу, D-фруктозу, D-маннозу, D-маннит, метил-αD-маннопиранозид, N-ацетилглюкозамин, амигдалин (amygladin), арбутин, эскулин, салицин, D-целлобиозу, D-мальтозу, D-мелибиозу, сахарозу, D-трегалозу, D-мелецитозу, D-раффинозу, гентиобиозу и не утилизирует L-арабинозу, D-лактозу, D-туранозу, D-арабит и глюконат калия, и штамм G223 был идентифицирован как Lactobacillus plantarum 1.

В то же время GE213 утилизирует D-ксилозу, D-галактозу, D-глюкозу, D-фруктозу, D-маннозу, D-маннит, N-ацетилглюкозамин, амигдалин, арбутин, эскулин, салицин, D-целлобиозу, D-мальтозу, сахарозу, гентиобиозу и глюконат калия, и не утилизирует L-арабинозу, D-рибозу, метил-αD-глюкопиранозид, D-лактозу, D-мелибиозу и D-трегалозу, и штамм G213 идентифицирован как Wiessella confusa.

Были исследованы способности этих бактерий к продуцированию ацетоина и СО₂ из глюкозы и продуцированию декстрана из сахарозы, выживаемость при 60±1°С в течение 30 минут и рост в 4% NaCl, 6,5% NaCl при 5±1°C, 10±1°C, 15±1°C и 45±1°С, гидролиз аргинина, гидролиз эскулина, образование сгустка за 24 часа в лакмусовом молоке, утилизация углеводов и продуцирование короткоцепочечных жирных кислот. Из изолированных культур бозы, GE223 (Lb. plantarum) продуцирует ацетоин, но не продуцирует CO₂ из глюкозы и декстран из сахарозы, растет при концентрациях NaCl 4% и 6,5%, не гидролизует аргинин, но гидролизует эскулин, не растет при 5°С, 45°С, но растет при 10°С, 15°С.

В то же время GE213 (W. confusa) не продуцирует ацетоин, продуцирует CO₂ из глюкозы и декстран из сахарозы, гидролизует аргинин и эскулин. Кроме того, он растет при 10°С, 45°С, устойчив к термообработке при 60°С в течение 30 минут и растет при концентрациях соли 4% и 6,5%.

Измерение антибактериального эффекта

Ингибирующий эффект выбранных бактерий на ингибирование роста патогенов определяли с помощью устройства Bioscreen®C. Для этого, выбранные бактерии (L. plantarum и W. confusa) культивировали в жидкой среде MRS при 30±1°С в течение 72 часов и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут, отбирали верхнюю фазу (супернатант), которая, как считается, обладает антимикробной активностью, и затем удаляли микроорганизмы путем пропускания супернатанта через стерильный фильтр 0,45 мкм. Значение рН фильтрата, обладающего антимикробной активностью, доводили до рН 4,6±0,1 для того, чтобы низкое значение рН фильтрата не ингибировало рост патогенов. Патогенные бактерии Bacillus cereus, Staphylococcus aureus и Escherichia coli активировали путем размножения при 37±1°С в течение 48 часов в сердечно-мозговом бульоне (бульон BHI).

В лунки планшета системы Bioscreen® загружали 240 мкл бульона BHI, 30 мкл патогенной культуры с разбавлением 10¹ и 30 мкл стерильного фильтрата, который, как считается, обладает антимикробной активностью. Параллельно, в качестве контроля загружали смесь не содержащей антимикробных средств и глюкозы MRS, добавленной к бульону BHI, содержащему разбавленные культуры. Рост патогенных бактерий определяли путем турбидометрических измерений при 580 нм через каждые 15 минут после короткого встряхивания при сравнении с лунками без антимикробного раствора (контроль). После эксперимента, продолжавшегося в течение 7 часов, определяли время, требующееся для роста патогенных бактерий до предварительно заданного значения оптической плотности культуральной среды (для Е. coli и S. aureus: до оптической плотности 0,1; для В. cereus: 0.2). Предшествующие исследования показали, что увеличение этого времени было пропорционально логарифму (log) уменьшения числа бактерий. С помощью ранее полученных калибровочных кривых рассчитывали процент уменьшения числа патогенных бактерий.

При прибавлении L. plantarum GE223 к культуре Е. coli, такое же значение оптической плотности достигалось за 320 минут вместо 227, к S. aureus - за 255 минут вместо 245, к культуре В. cereus - за 401 минут вместо 272. Сравнение этих коэффициентов задержки с ранее определенными калибровочными кривыми позволило рассчитать, что L. plantarum GE223 снижал число Е. coli на 88%, S. aureus - на 8% и В. cereus - на 99%.

Было рассчитано, что при добавлении W. confusa GE213 в культуру Е. coli то же самое значение оптической плотности достигалось за 280 минут вместо 228, с уменьшением численности на 71%, и антимикробный эффект против S. aureus и В. cereus отсутствовал.

Таким образом, было определено, что при совместном использовании бактерий по настоящему изобретению они обладают активностью ингибирования роста, особенно, против Е. coli и В. cereus.

В случае загрязнения бозы, бактерии, используемые в данном изобретении, будут защищать бозу благодаря их антимикробному эффекту, эффекту снижения рН и также будут создавать конкуренцию за питательные вещества.

Определение срока хранения

Готовили образцы бозы и помещали для хранения в холодильник при 5±1°С для проведения исследований срока хранения. Для исследований срока хранения отбирали по два параллельных образца бозы в дни 1, 7, 14, 21, 28, 35, 42 и 60 и проводили микробиологические подсчеты и определения рН, кислотности, сенсориальный анализ, определения вязкости, состава органических кислот и распределения сахаров.

Поскольку боза представляет собой продукт на основе крахмала, содержащий жизнеспособные бактерии, то на протяжении ее срока хранения крахмал подвергается как деградации, так и перекристаллизации, и ее вкус непрерывно изменяется под воздействием жизнеспособных микроорганизмов. Когда боза хранится на холоде для замедления микробиологического роста, ее срок хранения уменьшается, поскольку крахмал в бозе подвергается превращениям, приводящим к загущению и разделению фаз. Недостаточно контролировать скисание бозы путем ограничения роста микроорганизмов, необходимы дополнительно ферменты, деградирующие крахмал, для предотвращения загущения крахмала и разделения фаз. Таким образом, как было описано ранее, приготовленную бозу помещали в холодильник при +5°С и предотвращали скисание, в то время как загущению консистенции препятствовала способность добавленных бактерий деградировать крахмал. Проводились наблюдения бозы для определения ее сенсориальных свойств, рН и микробиологических критериев на протяжении срока хранения. Было определено, что при правильно отрегулированной консистенции бозы в начальный момент времени увеличение густоты бозы или разделение фаз не наблюдалось вследствие способности бактерий, используемых в производстве бозы, частично деградировать крахмал, и величина рН не опускалась ниже приемлемого предела, равного рН 3,9. Содержание уксусной кислоты и этанола не превышало предельных значений (в соответствии со стандартом бозы TS 9778, летучая кислотность не должна превышать 0,2%, а алкоголя - 2%).

Сенсориальный анализ

По результатам сенсориального анализа, проводимого на протяжении срока хранения, внешний вид бозы был определен как прозрачный, яркого от светло-желтого до кремового цвета, без разделения фаз, без пузырьков газа или трещин и со специфической консистенцией гомогенной вязкой жидкости. Вкус и запах бозы были определены как слабо-кислый, фруктовый, со специфическим приятным запахом и похожим слабо-кислым вкусом, с характерным сладко-кислым ароматом сушеных фруктов.

Свойства культур ферментации бозы

Биохимические свойства бактериальных культур, упоминаемых в данном изобретении, приведены в разделе, озаглавленном "Свойства выбранных микроорганизмов, используемых в бозе".

Наиболее важным свойством культур для приготовления бозы является то, что эти культуры были выделены из бозы и не были генетически модифицированы.

Культуры, указанные в данном изобретении, способствуют получению ароматной бозы путем продуцирования одновременно широкого разнообразия органических кислот и ацетоина, который слегка обжигает полость носа, без превышения пределов содержания уксусной кислоты и алкоголя, при ферментации сахара бозы в течение короткого периода времени. Они увеличивают безопасность и срок хранения бозы путем проявления антимикробного эффекта против Е. coli и В. cereus, которые могут быть загрязнениями, попадающими в бозу из окружающей среды, и могут присутствовать в неферментированной бозе.

Содержание органических кислот, придающих бозе вкус, продуцируемых бактериями, упоминаемыми в данном изобретении, анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), причем содержание молочной кислоты оставалось на уровне 1,5-2 г/л, уксусной кислоты - 0,5-1 г/л, пропионовой и масляной кислот, создающих нежелательный вкус при высоких концентрациях, оставалось на уровне следовых концентраций на протяжении 2-месячного срока хранения бозы.

L. plantarum GE223, присутствующий в бозе, может деградировать крахмал, в то время как W. confusa GE113 не деградирует крахмал, и проблема загустевания бозы, производимой классическим способом, при хранении в холодильнике, устраняется вследствие частичной деградации крахмала.

Путем проведения анализа состава cахаров неферментированной бозы было определено, что в начале состав cахаров включал 9888 мг/л сахарозы, 156 мг/л фруктозы, 68 мг/л глюкозы со снижением до 8780 мг/л сахарозы, 371 мг/л фруктозы, 271 мг/л глюкозы после 2 месяцев хранения бозы и при сохранении ее сладости.

Культуры, образующие бозу, демонстрируют рост при 15°С и отсутствие роста ниже 10°С. Это создает возможность для ферментации бозы в прохладных условиях окружающей среды без подогрева и увеличения сроков хранения при хранении бозы в холодных условиях для остановки ферментации.

Другое свойство данной бозы с закваской заключается в том, что пробиотические свойства могут быть созданы путем прибавления культур (дрожжи/бактерии) с подтвержденными пробиотическими свойствами.

Бактерии L. plantarum GE223 и W. confusa GE213, описанные в данном изобретении, депонированы под номером LMG Р-26178 в Бельгийских координированных коллекциях микроорганизмов (ВССМ)/Коллекции LMG (BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICROORGANISMS-BCCM/LMG COLLECTION) (международный депозитарный орган).