Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ СРОЧНОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ МЕТАСТАЗОВ РАКА В ЛИМФАТИЧЕСКИЕ УЗЛЫ И НЕХОДЖКИНСКОЙ ЛИМФОМЫ

Изобретение относится к лабораторной диагностике, а именно к срочному исследованию опухолевых клеток в измененных лимфатических узлах для дифференциальной диагностики метастазов рака и неходжкинских лимфом с использованием двух флуоресцентных иммуноцитохимических маркеров (эпителиального маркера Ber-EP4 FITC и CD45, общего лейкоцитарного маркера Leucocyte Common Antigen/FITC) во время эндоскопического исследования или операции.

Срочная дифференциальная флуоресцентная иммунопатологическая диагностика (ФИЦХ) во время операции или эндоскопического исследования между метастатическим поражением лимфатических узлов и неходжкинскими лимфомами позволяет принять правильное решение в отношении лечения больного, получить адекватный материал для планового морфологического, иммуноморфологического исследования.

Известен способ мультиплексной детекции опухолевых клеток с использованием панели агентов, связывающихся с внеклеточными маркерами. К образцу добавляют панель меченых агентов, которые связываются с двумя или более маркерами, экспрессируемыми на поверхности клетки, где, по меньшей мере, один из агентов является специфичным к раку и где панель содержит: один или нескольких агентов, связывающихся с рак специфичными маркерами, экспрессируемыми на поверхности раковой клетки толстой кишки, где один агент или один из агентов является агентом, связывающимся с СА 19-9, и один или нескольких агентов, связывающихся с тканеспецифичными маркерами, которые являются эпителиальными и/или мезенхимальными экспрессируемыми на поверхности клетки, где один агент или один из агентов является агентом, связывающимся с Ер-САМ. Набор, содержащий один или несколько агентов, связывающийся с внеклеточными рак специфичными маркерами, где один агент или один из агентов является антителом или фрагментом антитела, связывающимся с СА 19-9, и один или нескольких агентов, связывающихся с внеклеточными тканеспецифичными маркерами, которые являются эпителиальными маркерами и/или мезенхимальными маркерами, где один агент или один из агентов является антителом или фрагментом антитела, связывающимся с Ер-САМ (RU 2489720 С2).

Однако известный способ диагностики занимает много времени и является дорогостоящим, т.к. для исследования используют несколько традиционных нефлуоресцентных маркеров.

Самым близким к заявляемому является способ диагностики рака, в частности для идентификации и обнаружения метастазов, таких как рак молочной железы, яичника, матки, толстой кишки, легких. Исследование проводят с помощью иммунофлуоресцентного анализа по биологическим образцам крови, лимфы или лимфатических узлов и костного мозга (AU 2012201538). Используется ASC-зонд, являющееся моноклональным антителом, против антигенов рака. Данный маркер выявляется с помощью иммунофлуоресцентного анализа, поскольку может быть помечен флуоресцентной меткой. Для очистки антигена рака используют аффинную хроматографию.

Однако известный способ диагностики является весьма трудоемким и долгим по времени, поскольку предполагает самостоятельное получение антител к клеткам рака, использование аффинной хроматографии для выявления ракового антигена, присутствующего в смеси раковых клеток, что невозможно применить в условиях срочного исследования при проведении бронхоскопии или операции. Кроме того, данный способ диагностики не предусматривает использование двух антигенов для срочной дифференциальной диагностики метастазов рака и неходжкинских лимфом.

Задачей изобретения является разработка надежного и быстрого метода диагностики метастатического поражения лимфатических узлов и неходжкинских лимфом.

Указанная задача достигается тем, что для получения клеточной суспензии, клеточный материал помещают в питательную среду накопления, состоящую из раствора Хенкса, реоплиглюкина и альбумина, смешанных в равных объемах, клеточную суспензию вносят по 100 мл на дно двух пробирок, добавляют 5 мкл моноклонального антитела Ber ЕР4 FITC в одну пробирку и 5 мкл моноклонального антитела CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC в другую пробирку, материал 5 с перемешивают, инкубируют 20 мин при t° 2-8°C, затем взвесь клеток распределяют по 50-100 мкл и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, из осадка готовят препарат, которые окрашивают ядерным флюоресцентным красителем Dapi и осуществляют их флуоресцентную микроскопию, при положительной экспрессии на мембранах клеток эпителиального маркера Ber ЕР4 FITC - диагностируют метастазы рака, а в случае положительной экспрессии на мембранах клеток общего лейкоцитарного антигена CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC и отсутствия экспрессии на мембранах клеток эпителиального маркера Ber ЕР4 FITC - диагностируют неходжкинскую лимфому.

Изобретение поясняется подробным описанием, клиническими примерами и иллюстрацией, на которой изображено:

Фиг. 1 - Положительная экспрессия общего лейкоцитарного антитела Leucocyte Common Antigen/FITC клетками неходжкинской лимфомы, видно зеленое свечение мембран лимфоидных клеток при флуоресцентной микроскопии.

Фиг. 2 - Положительная экспрессия моноклонального антитела Ber ЕР4 FITC клетками рака при метастатическом поражении лимфатического узла, видно зеленое свечение мембран клеток рака при флуоресцентной микроскопии.

Объектом цитологического исследования служат интраоперационные соскобы с поверхности разреза лимфатического узла, либо тонкоигольные аспирационные биоптаты лимфатических узлов. Обязательными условиями адекватного исследования лимфатических узлов являются продольные многоступенчатые разрезы и соскоб со всей поверхности лимфатического узла. Пункцию лимфатических узлов осуществляет хирург под контролем эндоУЗИ при срочном эндоскопическом исследовании.

Соскобы получают с лимфатического узла скальпелем или ребром, либо углом предметного стекла с последующим равномерным распределением полученного материала на втором предметном стекле.

Часть мазков, приготовленных из лимфатических узлов, окрашивают азур-эозиновыми смесями методом срочной интраоперационной окраски для рутинного цитологического исследования.

Для успешного применения ФИЦХ необходимо соблюдение нескольких условий: полнота клинических сведений и достаточное количество опухолевых клеток - оптимально не менее 200 клеток в одном препарате.

С целью дифференциальной диагностики между метастазами рака в лимфатический узел и лимфомой применяют два флуоресцентных маркера: эпителиальный антиген Ber-EP4 FITC и общий лейкоцитарный антиген CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC. Эпителиальный антиген Ber-EP4 FITC представляет молекулу адгезии эпителиальных клеток и состоит из двух гликопротеинов молекулярной массой 34 и 39 кД, которые находятся преимущественно на поверхности клеточной мембраны почти всех эпителиальных клеток, за исключением некоторых видов плоского эпителия, гепатоцитов, проксимальных отделов эпителия почечных канальцев, желудочных париетальных и миоэпителиальных клеток. Элементы лимфатического узла и лимфомы Ber-ЕР4 - отрицательны. Ber-ЕР4 является маркером клеток эпителиальной природы, его экспрессия отмечается в клетках широкого спектра новообразований эпителиального происхождения, включая аденогенные, мелкоклеточные, недифференцированные раки и нейроэндокринные опухоли. Элементы лимфатического узла и лимфомы экспрессируют общий лейкоцитарный антиген CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC, представляющий поверхностный гликопротеид.

Для ФИЦХ исследования используют жидкостные препараты, приготовленные с помощью центрифуги Cytospin 3. Это позволяет получить монослой клеток и обеспечить сохранность клеточных структур, что снижает содержание в препарате элементов воспаления, концентрирует клеточные элементы на ограниченном участке и экономит дорогостоящие реактивы.

Для ФИЦХ в случае исследования лимфатических узлов взвесь клеток распределяют по 50-100 мкл в контейнеры центрифуги Cytospin 3 и центрифугируют при 1000 об./мин в течение 5 мин. Контроль качества проводят окрашиванием двух цитоспиновых препаратов методом срочной интраоперационной цитологической окраски. При наличии в мазках достаточного количества клеточного материала (200-300 клеток), проводят ФИЦХ-исследование оставшихся неокрашенных цитопрепаратов.

Способ срочной дифференциальной флуоресцентной иммуноцитохимической диагностики метастазов рака в лимфатические узлы и неходжкинской лимфомы выполняют следующим образом.

Клеточный материал после пункции или соскоба лимфатических узлов и неходжкинских лимфом помещают в специальную питательную среду (раствор Хенкса, реоплиглюкин и альбумин, смешанных в равных количествах) накопления, находящуюся в микропробирке (800 мкл), для получения клеточной суспензии. Хорошо перемешанную клеточную суспензию вносят по 100 мл на дно двух пробирок, добавляют 5 мкл моноклонального антитела Ber ЕР4 FITC (эпителиального маркера) в одну пробирку и 5 мкл моноклонального антитела CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC в другую пробирку, затем перемешивают 5 с на вортексе. Материал инкубируют 20 мин в темном холодном месте при t° 2-8°C. В процессе инкубации происходит реакция взаимодействия поверхностных антигенов со специфическими антителами Ber-EP4 FITC и CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC, меченными флуорохромным красителем, с образованием комплексов антиген + антитело. Затем взвесь клеток распределяют по 50-100 мкл в контейнеры центрифуги Cytospin 3 и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин. Полученные препараты окрашивают ядерным флуоресцентным красителем Dapi, после чего осуществляют микроскопию полученных препаратов.

Оценку полученных результатов осуществляют следующим образом. При добавлении к клеточной суспензии моноклональных антител Ber-ЕР4 FITC, либо CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC, коньюгированных с флуорохромами, происходит связывание их с поверхностными антигенами клеток, возбуждение флуоресценции и последующая ее регистрация при длине волны 488 нм (в спектре Green). ФИЦХ-реакция оценивается качественно. Мембранное окрашивание клеток рака наблюдается при проведении реакции с эпителиальным антигеном Ber-EP4 FITC. Мембранное окрашивание лимфоидных элементов наблюдается и при проведении реакции с общим лейкоцитарным антигеном CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC. При оценке ФИЦХ реакция принимают во внимание интенсивность и полноту окрашивания. Были отмечены некоторые особенности экспрессии эпителиального маркера Ber-EP4 FITS, выявляемые при флуоресцентной микроскопии. Характерной особенностью является хорошо выраженная четкая мембранная реакция в виде секреторных вакуолей, которые располагаются на поверхности клетки иногда в виде своеобразного кружева. Иногда наблюдается отрыв цитоплазмы в виде секреторных вакуолей. Такой характер экспрессии характерен для клеток аденогенного рака. Наличие таких клеток не вызывает сомнений в их эпителиальной природе. Для предотвращения гипердиагностики метастазов рака в лимфатических узлах следует учитывать, что макрофагальные элементы, присутствующие в лимфатических узлах или экссудате, захватывают частицы красителя и выглядят как светящиеся включения в цитоплазме.

При осуществлении флуоресцентной микроскопии полученных препаратов, в случае положительной экспрессии на мембранах клеток эпителиального маркера Ber ЕР4 FITC диагностируют метастазы рака, а в случае положительной экспрессии на мембранах клеток общего лейкоцитарного антигена CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC и отсутствии экспрессии на мембранах клеток эпителиального маркера Ber ЕР4 FITC диагностируют неходжкинскую лимфому.

В отделении МНИОИ им. П.А. Герцена методом ФИЦХ срочно исследовано 30 лимфатических узлов с целью дифференциальной диагностики метастазов рака и неходжкинской лимфомы. Во всех наблюдениях при рутинном цитологическом исследовании возникли сложности в установлении характера поражения лимфатических узлов.

Положительная экспрессия эпителиального маркера Ber-ЕР4 отмечена в 12 наблюдениях при метастазах мелкоклеточного рака легкого, в 1 наблюдении при метастазе недифференцированного рака легкого в лимфатический узел. В 18 случаях был установлен диагноз неходжкинской лимфомы при этом опухолевые клетки не экспрессировали эпителиальный маркер Ber-ЕР4 и были положительными по экспрессии общего лейкоцитарного антигена CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC.

Достоверность срочной дифференциальной диагностики метастазов рака и лимфом с использованием ФИТЦ-исследования лимфатических узлов составляет 100%.

Клинические примеры

Клинический пример 1. Больной М. 53 года. У больного поражение легкого, измененные лимфатические узлы в корне легкого, средостении. Клинический диагноз - лимфома? рак легкого?

Проведено эндоскопическое исследование. Произвели пункцию лимфатических узлов в корне легкого. При цитологическом исследовании методами световой микроскопии был установлен диагноз злокачественного круглоклеточного мелкоклеточного новообразования, дифференциальный диагноз провели между неходжкинской лимфомой и мелкоклеточным раком легкого.

Часть полученного при пункции клеточного материала поместили в специальную, питательную среду накопления, в две микропробирки, содержащие по 800 мкл питательной среды. К взвеси клеток в одну микропробирку добавляли эпителиальный маркер Ber-EP4 FITS, а во вторую общий лейкоцитарный антиген CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC и оставляли на 20 мин в темном месте для прохождения флюоресцентной иммуноцитохимической реакции. Затем взвесь клеток распределяли по 50-100 мкл в контейнеры центрифуги системы Cytospin (Shandon, UK) и центрифугировали в режиме 1000 об./мин в течение 5 мин. Изготовили жидкостные цитологические препараты. Для визуализации ядер клеток препараты окрашивали DAPI. Микроскопию осуществляли на флуоресцентном микроскопе Imager M1 фирмы «Karl Zeiss». Флуоресцентная иммуноцитохимическое исследование заняло 25 минут. При проведении срочной флуоресцентной иммуноцитохимии с эпителиальным маркером Ber-ЕР4 и общим лейкоцитарным антигеном CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC был установлен диагноз неходжкинской лимфомы. В лимфатическом узле были обнаружена неходжкинская лимфома, поскольку опухолевые клетки экспрессировали общий лейкоцитарный антиген CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC и не экспрессировали эпителиальный маркер Ber-EP4 FITS, что было определено при исследовании с помощью флуоресцентного микроскопа. В лимфатических узлах в спектре эмиссии FITC (520-524 нм) хорошо была видна мембранная экспрессия общего лейкоцитарного антигена CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC на клетках опухоли (Фиг. 1). Установлен диагноз - неходжкинская лимфома, что было подтверждено последующим гистологическим исследованием.

Клинический пример 2. Больная Ж. 51 год. В правой околоушной слюнной железе выявлено узловое образование, также определялось поражение лимфатических узлов в проекции правой околоушной слюнной железы.

Под контролем УЗИ была проведена пункция образования околоушной слюнной железы и лимфатических узлов. При цитологическом исследовании методами световой микроскопии материала тонкоигольной аспирационной биопсии был установлен диагноз злокачественного круглоклеточного мелкоклеточного новообразования, дифференциальный диагноз проводили между неходжкинской лимфомой и недифференцированным раком слюнной железы.

Часть полученного при пункции клеточного материала поместили в специальную, питательную среду накопления в микропробирку, содержащую 800 мкл питательной среды. К взвеси клеток в микропробирку добавляли эпителиальный маркер Ber-EP4 FITS и оставляли на 20 мин в темном месте для прохождения флуоресцентной иммуноцитохимической реакции. Затем взвесь клеток распределяли по 50-100 мкл в контейнеры центрифуги системы Cytospin (Shandon, UK) и центрифугировали в режиме 1000 об./мин в течение 5 мин. Изготовили жидкостные цитологические препараты. Для визуализации ядер клеток препараты окрашивали DAPI. Микроскопию осуществляли на флуоресцентном микроскопе Imager M1 фирмы «Karl Zeiss», исследование заняло 25 минут. При проведении интраоперационной флуоресцентной иммуноцитохимии с эпителиальным маркером Ber-ЕР4 в этом же лимфатическом узле были обнаружены клетки рака с положительной экспрессией эпителиального маркера, что определили при исследовании с помощью флуоресцентного микроскопа. В метастатических лимфатических узлах и слюнной железе в спектре эмиссии FITC (520-524 нм) хорошо была видна мембранная экспрессия эпителиального маркера Ber-ЕР4 на клетках рака. Отмечалась четкая выраженная мембранная реакция, характеризующая экспрессию эпителиального маркера Ber-EP4 FITS, выявляемая при флуоресцентной микроскопии на клетках рака слюнной железы и его метастазах (Фиг. 2). Диагноз - недифференцированный рак слюнной железы с метастазами в лимфатические узы в проекции правой околоушной слюнной железы.

Проведенные исследования показали, что ФИЦХ является новым надежным и быстрым методом дифференциальной диагностики метастатического поражения лимфатических узлов и неходжкинских лимфом. Особенно перспективно применение этого метода при срочных исследованиях лимфатических узлов, так как не требует сложной предподготовки материала и значительных временных затрат: исследование занимает 20-25 минут. Эпителиальный маркер Ber-ЕР4 является гликопротеином и находится на поверхности клеточной мембраны. Общий лейкоцитарный антиген также является гликопротеином и находится на поверхности клеточной мембраны. ИЦХ реакция прямая: флуорохром непосредственно коньюгирован с антителом. Все это способствует сокращению времени инкубации антитела с антигеном и применению эпителиального маркера Ber-ЕР4 и общего лейкоцитарного антигена CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC в срочной дифференциальной диагностике метастазов рака в лимфатические узлы и лимфом.

Таким образом, была показана высокая эффективность и быстрота ФИЦХ при срочной дифференциальной диагностике в исследованиях лимфатических узлов с целью установления распространенности опухолевого процесса и дифференциальной диагностики метастазов рака и лимфом.