Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ИНДУКЦИИ НАПРАВЛЕННОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В ИНСУЛИН-ПРОДУЦИРУЮЩИЕ β-КЛЕТКИ ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям и регенеративной медицине, и касается способа получения и индукции дифференцировки культуры мультипотентных прогениторных клеток поджелудочной железы в инсулин-продуцирующие β-клетки при сахарном диабете. Изобретение может быть использовано для решения практических задач регенеративной медицины: поиска потенциальных лекарственных средств, способных избирательно стимулировать дифференцировку панкреатических мультипотентных прогениторных клеток в продуцирующие инсулин β-клетки при сахарном диабете, что может стать альтернативой инсулинзамещающей терапии, трансплантации поджелудочной железы либо отдельных типов ее клеток.

Сахарный диабет объединяет заболевания разной этиологии, но ключевое звено патогенеза одинаковое: разрушение β-клеток, ухудшение усвоения глюкозы различными тканями. Недостаточная утилизация глюкозы приводит к нарушению не только углеводного, но и жирового, и белкового обмена. Накопление продуктов гликозилирования в сочетании с другими метаболическими сдвигами лежит в основе поздних осложнений сахарного диабета - диабетической ангиопатии, ретинопатии, невропатии и нефропатии [1; 2; 3]. Наиболее агрессивным и прогностически тяжелым считается сахарный диабет I типа (инсулинозависимый сахарный диабет). Инсулинозависимый сахарный диабет - хроническое аутоиммунное заболевание, вызванное разрушением β-клеток островков поджелудочной железы [4]. Болезнь поражает детей, подростков и молодых людей, но может начинаться в любом возрасте. Спонтанная аутоиммунная реакция возникает у лиц генетически предрасположенных к аутоиммунным нарушениям. Однако в подавляющем большинстве (более 90% всех случаев) сахарный диабет типа I возникает в силу вмешательства в иммунную систему различных провоцирующих факторов, в том числе токсических агентов.

Общепринятые методы терапии аутоиммунного сахарного диабета - иммунодепрессия и инсулинотерапия, не излечивают больных и лишь тормозят развитие поздних осложнений. При введении экзогенного инсулина снижается риск развития различных диабетических осложнений. Тем не менее, экзогенным инсулином не возможно поддерживать уровень глюкозы в крови в пределах узкого физиологического диапазона подобно тому, как регулирует уровень глюкозы эндогенный инсулин, секретируемый β-клетками поджелудочной железы. С теоретической точки зрения наиболее эффективным способом восстановления клеток эндогенной и экзогенной секреции поджелудочной железы при аутоиммунном сахарном диабете и других его формах является трансплантация островков поджелудочной железы, изолированных β-клеток и других клеток, способных восстанавливать глюкозозависимую продукцию инсулина [5]. Однако хроническая нехватка донорских органов и необходимость сопутствующей иммунносупрессивной терапии ограничивают широкое применение таких трансплантаций.

Альтернативой трансплантации поджелудочной железы и островков Лангерганса предлагается генерация инсулин-секретирующих клеток in vitro с последующей их трансплантацией больным диабетом I типа. Изучается вопрос о возможной генерации инсулин-секретирующих клеток из эмбриональных стволовых клеток (СК) [6], мезенхимальных СК костномозгового происхождения [7, 8] и поджелудочной железы [9]. В качестве кандидатов для клеточной терапии диабета рассматриваются взрослые панкреатические α-клетки [10] и предшественники ацинарных клеток [11]. Однако, несмотря на получение в результате трансдифференцировки стволовых/клеток-предшественников мононуклеаров с морфологией и фенотипом подобным β-клеткам, авторы признаются, что инсулиновый ответ на глюкозу у них значительно менее интенсивный, чем у родных β-клеток. Известно, что клеточно-популяционная организация поджелудочной железы представлена мультипотентными прогениторными клетками и олигопотентными предшественниками эндокринных клеток [12]. Вместе с тем вопрос о регенераторном потенциале этих клеток при диабете до конца не изучен.

Таким образом, наиболее эффективным подходом, позволяющим восстановить популяцию эндогенно и экзогенно секретируемых клеток поджелудочной железы, может выступить фармакологическая стимуляция дифференцировки эндогенных СК и прогениторных β-клеток в инсулин-продуцирующие клетки.

Адекватных аналогов предлагаемый способ не имеет.

Задачей данного изобретения является оценка способности мультипотентных прогениторных клеток поджелудочной железы дифференцироваться в инсулин-продуцирующие β-клетки, что может оптимизировать поиск лекарственных средств, способных избирательно стимулировать их дифференцировку в секретирующие инсулин β-клетки I типа и ускорять процессы регенерации при сахарном диабете.

Поставленная задача решается тем, что выделяют взвесь неадгезирующих мононуклеаров клеток из ткани поджелудочной железы при сахарном диабете, в полученной взвеси оценивают количество мультипотентных прогениторных клеток, олигопотентных прогениторных клеток и инсулин-продуцирующих β-клеток, затем в течение 30 дней в присутствии ростовых факторов, 4 нг/мл эпидермального фактора роста, 10 нг/мл фактора роста гепатоцитов, наращивают клеточную массу мультипотентных прогениторных клеток, по окончании цикла культивирования глюкагон-подобным пептидом GLP-1, в концентрации 6,7 мкл/мл, индуцируют дифференцировку полученных in vitro мультипотентных прогениторных клеток в β-клетки, у полученных β-клеток оценивают интенсивность секреции инсулина и реакцию на глюкозу.

Новым в предлагаемом способе является получение культуры мультипотентных прогениторных клеток диабетической поджелудочной железы, иммунофенотипическая и морфологическая оценка их способности дифференцироваться в β-клетки в присутствии специфических ростовых факторов, иммуноферментная оценка продукции и секреции инсулина у β-клеток, полученных в результате дифференцировки диабетических мультипотентных прогениторных клеток, в ответ на глюкозную нагрузку.

Разрушение инсулин-продуцирующих β-клеток имеет аутоиммунную природу и обусловлено врожденным отсутствием или потерей толерантности к аутоантигенам β-клеток. Причины аутоиммунного разрушения β-клеток до сих пор не выяснены. Однако совершенно ясно, что после запуска этого процесса активируется как клеточное, так и гуморальное звено иммунитета. К тому времени, когда обнаруживается гипергликемия, около 80-95% β-клеток погибает, возникает абсолютный дефицит инсулина. Оставшиеся и жизнеспособные β-клетки не способны обеспечивать требуемым для усвоения тканями глюкозы количеством инсулина. В результате этого развиваются тяжелые метаболические нарушения. В ряде случаев в качестве трансплантантов используют не островки, а предварительно культивированные микрофрагменты ткани поджелудочной железы. Алло- и ксетрансплантация микрофрагментов ткани поджелудочной железы у больных сахарном диабетом типа I мало эффективна.

В отличие от кроветворной ткани, печени, покровного эпителия и других быстро обновляющихся клеточных систем, поджелудочная железа - медленно обновляющаяся ткань. Генетическое отслеживание отдельных клонов клеток на разных стадиях панкреатогенеза позволило охарактеризовать мультипотентные прогениторные клетки, способные дифференцироваться в направлении клеток ацинусов, протоков и островков. Генетически мультипотентные прогениторные клетки представляли собой Pdx1⁺/Ptfla⁺/c-Myc⁺/Cpa1⁺-клетки [13]. Оценка экспрессии мембранных маркеров здоровых панкреатических клеток позволяет получать мультипотентные прогениторные клетки (экспрессия на поверхности рецептора к фактору роста гепатоцитов (c-Met), отсутствие антигенов гемопоэтических стволовых клеток и клеток эндотелия (Flk-1, c-Kit, CD45, TER119)) [12], олигопотентные предшественники с фенотипом CD133⁺/CD49f^low и экспрессирующие на поверхности Ngn3 [14], монопотентные предшественники β-клеток (некоторые авторы называют их транзиторными клетками) [1]. Рассматривается вопрос о возможности формирования здоровыми мультипотентными прогениторными клетками и олигопотентными предшественниками в культуре КОЕ и эндокринных, и экзокринных клеток. В силу высокого пролиферативного потенциала и возможности дифференцироваться в направлении секреторных клеток в условиях оптимальной жизнедеятельности, наиболее интересными для использования в качестве мишени для фармакологического воздействия при патологии поджелудочной железы являются панкреатические мультипотентные прогениторные клетки. Между тем, вопрос об их использовании при сахарном диабете остается открытым.

В этой связи, необходимость изучения потенциала к самоподдержанию и дифференцировки мультипотентных прогениторных клеток при сахарном диабете возрастает многократно, так как потенциальные возможности регионарных прогениторных клеток взрослого организма могут определять стратегию лечения.

Отличительные признаки проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и неочевидные для специалиста.

Идентичной совокупности признаков не обнаружено в проанализированной патентной и научно-медицинской литературе.

Способ может быть использован для изучения регенераторного потенциала мультипотентных прогениторных клеток поджелудочной железы с целью поиска потенциальных лекарственных средств для регенеративной медицины, в частности для лечения хронических заболеваний поджелудочной железы, связанных с поражением секретирующих инсулин β-клетки, механизм действия которых связан с индукцией дифференцировки панкреатических мультипотентных прогениторных клеток. Исходя из вышеизложенного, заявляемое изобретение соответствует критериям патентоспособности изобретения «Новизна», «Изобретательский уровень» и «Промышленная применимость».

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на 5-недельных мышах линии С57В 1/6 в количестве 102 штук. Животные первой категории, инбредные мыши, получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования ФГБУ «НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» СО РАМН (сертификат имеется). Использование животных в экспериментах обосновано и согласовано с Комиссией по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН.

Изобретение будет понятно из следующего описания и приложенных к нему рисунков 1, 2.

На рис. 1 изображены дот-плоты, представляющие данные анализа количественной и качественной экспрессии CD45, TER119, c-Kit, Flk-1, CD133, CD491f^low, полученные с помощью флуоресцентной цитометрии, на неадгезирующих мононуклеарах поджелудочной железы мышей линии С57В 1/6 на 21-й день после последнего введения стрептозотоцина: 1 - интактные животные; 2 - животные с сахарным диабетом; A1, A2 - подтверждение фенотипа и качественный анализ экспрессии CD45/TER119 на двухмерных гистограммах; Б1, Б2 - подтверждение фенотипа и качественный анализ экспрессии CD45/TER119/c-Kit/Flk-1 на двухмерных гистограммах; B1, B2 - подтверждение фенотипа и качественный анализ экспрессии CD45/TER119/CD133/CD49f на двухмерных гистограммах.

На рис. 2 изображена морфология клеточных ассоциаций, полученных в результате культивирования неадгезирующих мононуклеаров поджелудочной железы мышей линии С57В 1/6 на 21-й день после введения стрептозотоцина: А - интактные животные; Б - животные с сахарным диабетом. Увеличение ×100.

Способ осуществляют следующим образом.

Диабет моделировали стрептозотоцином («Sigma», USA). Препарат вводили после 4-часовой голодовки животных внутрибрюшинно в дозе 40 мг/кг в 250 мкл фосфатного буфера 1 раз в сутки в течение 5-ти дней. Контролировался диабет по уровню глюкозы в крови при помощи глюкометра SencoCard («77 Электроника Кфт», Венгрия) и по количеству инсулин-продуцирующих клеток в поджелудочной железе [15]. Животным контрольной группы внутрибрюшинно вводили 250 мкл фосфатного буфера. Противоопухолевый препарат стрептозотоцин разрушает секреторные клетки поджелудочной железы (в том числе β-клетки).

Уровень глюкозы в крови изучали за 24 ч до первого введения стрептозотоцина и на 21-й день после последнего введения стрептозотоцина. На 21-й день после последнего введения стрептозотоцина проводили эвтаназию мышей передозировкой СО₂, выделяли поджелудочную железу, получали неприлипающие мононуклеары. Неприлипающие мононуклеары разделяли на 3 группы. У клеток 1 группы цитометрически изучали экспрессию CD45, TER119, CD117 (c-Kit), CD49f, Flk-1, CD133. Для анализа использовался прибор FACS Canto II с программным обеспечением FACS Diva («Becton Dickinson», США). У мононуклеаров 2 группы прижизненным окрашиванием дитизоном выявляли инсулин-продуцирующие клетки (Pancreatic Cell DTZ Detection Assay, США). У мононуклеаров 3 группы изучали потенциал к самоподдержанию при длительном культивировании. Для этого мононуклеары в количестве 1×10⁶ вносили в культуральный флакон («ТРР Techno Plastic Products AG», Швейцария) и инкубировали в стандартных условиях (37°С, 5% СО₂, 100% влажность воздуха) в течение 30 дней в среду, содержащую 45% DMEM («Sigma», США), 45% DMEM/F-12 («Sigma», США), 10% инактивированной фетальной бычьей сывороткой («Sigma», США), 5 мг/л ITS+3 (смесь рекомбинантного человеческого инсулина, трансферина и селинита Na) («Sigma», США), 1×10^-7 М дексаметозона («Sigma», США), 10 ммоль/л никотиновой кислоты («Sigma», США), 5 ммоль/л фосфатного буфера (HEPES) («Sigma», США) раствор антибиотиков 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина («Sigma», США), 2 ммоль/л L-глутамина («Sigma», США), β-меркаптоэтанола 50 ммоль/л («Thermoscientific», США). Эпидермальный фактор роста 4 нг/мл («Sigma», США) и фактор роста гепатоцитов 10 нг/мл («Sigma», США) добавляли через 24 часа от начала культивирования. Каждые 3-4 дня проводили смену среды. По окончании цикла культивирования супернатанты от мононуклеаров собирали и исследовали уровень свободного инсулина. Инсулин измерялся методом иммуноферментного анализа («Monobind Inc», США).

Полученные в результате культивирования мононуклеаров 3 группы клеток разделили на две подгруппы. У клеток 1 подгруппы оценивали экспрессию CD45, TER119, CD117 (c-kit), CD49f, Flk-1, CD133. У 0,5×10⁶ клеток 2 подгруппы с использованием глюкагон-подобного пептида GLP-1 (7-37) («Sigma», США) (2 мг/кг) изучали дифференцировку в инсулин-продуцирующие клетки по методикам Bonner-Weir S. et al. (2000) и Suzuki A. et al. (2004), модифицированных для панкреатических мультипотентных прогениторных клеток. По окончании 30 дней у клеток 2 подгруппы прижизненным окрашиванием дитизоном выявляли инсулин-продуцирующие клетки и изучали секрецию инсулина. Оценивали базальный уровень секреции (при концентрации глюкозы в фосфатном буфере 3 ммоль/л) и секреторную активность в условиях повышения концентрации глюкозы до 20 ммоль/л у 1×10⁶ мононуклеаров [16, 17].

Математическую обработку результатов производили с применением стандартных методов вариационной статистики. Достоверность различий оценивали с использованием параметрического t критерия Стьюдента или непараметрического U критерия Манна-Уитни.

Пример

Проведенные эксперименты позволили показать, что курсовое введение стрептозотоцина вызывает изменения, свойственные для сахарного диабета I типа. Так, на 21-й день после последней инъекции препарата уровень глюкозы в крови у мышей С57В 1/6 поднимается до 18,0±1,7 ммоль/л (Р<0,001). Исходный уровень глюкозы составляет 7,5±0,8 ммоль/л. Окрашивание дитизоном демонстрирует разрушение панкреатических инсулин-продуцирующих клеток. По сравнению с животными интактного контроля их количество уменьшается в 5 раз (Р<0,01). Цитометрические исследования позволяют выявить во фракции неприлипающих мононуклеаров поджелудочной железы у интактных мышей и мышей при сахарном диабете клетки с фенотипом CD45^-, TER119^-, c-Kit^-, Flk-1^- (мультипотентные прогениторные клетки) и CD45^-, TER119^-, CD133⁺, CD49f^low (олигопотентные предшественники β-клеток) (рис. 1). У больных мышей наблюдается значительное расширение популяции олигопотентных предшественников. При этом стрептозотоцин не влияет на мультипотентные прогениторные клетки (таблица 1).

Как видно из представленных данных, на фоне гибели островковых β-клеток в поврежденной стрептозотоцином поджелудочной железе присутствуют мультипотентные прогениторные клетки и наблюдается расширение популяции олигопотентных предшественников β-клеток.

Клональный анализ показывает способность панкреатических неприлипающих мононуклеаров диабетических мышей образовывать клеточные агрегаты (колонии) при длительном культивировании - опытная группа (1 месяц) (рис. 2). Однако плотность колоний и клеточность в образцах опытной группы ниже (1 колония/240 клеток/см²), чем в культуре интактного контроля (7 колоний/602 клетки/см²) (Р<0,05). Мы проанализировали экспрессию антигенов стволовых и прогениторных β-клеток, полученных в результате культивирования. Оказалось, что содержание CD45^-, TER119^-, cKit^-, Flk-1^--клеток в культуре контрольной группы значительно больше, чем в свежевыделенной поджелудочной железе у мышей с сахарным диабетом (контрольная группа) (+29,24%, Р<0,05). При культивировании обогащение мультипотентными прогениторными клетками в образцах опытной группы происходит более интенсивно (+56,97%, Р<0,03), чем в образцах контрольной группы. В противоположность этому, популяция CD45^-, TER119^-, CD133⁺, CD49f^low-клеток в культуре опытной группы сокращается (-65,6%; Р<0,02) (таблица 1). Прижизненное окрашивание дитизоном мононуклеаров, полученных в результате культивирования, не выявило инсулин-продуцирующих клеток в контрольных и опытных образцах. В супернатантах не определяется инсулин.

Итак, культивирование позволяет наращивать панкреатические мультипотентные прогениторные клетки от мышей с диабетом, что указывает на их способность к самоподдержанию. При этом в образцах сокращается количество более зрелых олигопотентных предшественников β-клеток, не выявлены инсулин и инсулин-продуцирующие клетки.

У полученных в результате культивирования мультипотентных прогениторных клеток изучали способность дифференцироваться в инсулин-продуцирующие клетки (дитизон-положительные) в присутствии GLP-1 (7-37) in vitro. Полученные данные показывают, что по окончании цикла дифференцировки количество дитизон-положительных клеток в культуре опытной группы (предварительно обогащенной мультипотентными прогениторными клетками) более чем в 10 раз превышает (Р<0,001) их уровень в образцах интактного контроля (таблица 1). Биохимическое исследование позволило выявить инсулин в супернатантах от дитизон-положительных клеток контрольной и опытной группы под влиянием глюкозы в минимальной концентрации (3 ммоль/л). При повышении концентрации глюкозы до 20 ммоль/л увеличивается и уровень гормона в исследуемых жидкостях. Следует отметить, что базальный уровень инсулина и уровень инсулина при повышенной нагрузке в опытных образцах достоверно превосходит таковой в контрольной группе (таблица 2).

Таким образом, исследование демонстрирует, что мультипотентные предшественники β-клеток (CD45^-, TER119^-, c-Kit^-, Flk-1^-) поджелудочной железы мышей со стрептозотоцин-индуцированным диабетом могут дифференцироваться в направлении инсулин-продуцирующих клеток, способных секретировать гормон инсулин в ответ на глюкозную нагрузку.

Предлагаемый способ позволяет получить и определить способность к дифференцировке мультипотентных прогениторных клеток диабетической поджелудочной железы в секретирующие инсулин β-клетки, что поможет оценить выраженность поражения панкреатической железы и стратегию лечения сахарного диабета, основанную на избирательной стимуляции эндогенных мультипотентных прогениторных клеток больного.

Литература

1. Биология стволовых клеток и клеточные технологии. Том 2 / Под ред. М.А. Пальцева. - М.: ОАО Издательство «Медицина», издательство «Шико», 2009. - 456 с.: ил. (Учеб. Лит. Для студ. Мед. вузов).

2. Дедов И.И. Сахарный диабет - опаснейший вызов мировому сообществу // Вестник РАМН. - 2012. - Т. 1. - С. 7-13.

3. Готье С.В. Сахарный диабет 1 типа, диабетическая невропатия: возможности трансплантологии. Вестник РАМН. - 2012. - Т. 1. - С. 54-60.

4. Atkinson М.А., Eisenbarth G.S. Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment. // Lancet. - 2001. - V. 358. - P. 221-229.

5. Inverardi L., Kenyon N.S., Ricordi C. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: A user′s guide. // Stem Cells. - 2010. - Dev19. - P. 1449-1470.

6. Minami К., Seino S. Current status of regeneration of pancreatic β-cells. // Journal of Diabetes investigation. - 2013. - V. 4 (2). - P. 131-141.

7. Dominguez-Bendala J., Lanzoni G., Inverardi L., Ricordi C. Concise Review: Mesenchymal Stem Cells for Diabetes. // Stem cells Translation Medicine. - 2012. - V. 1. - P. 59-63.

8. Zanini С., Bruno S., Mandili G., Baci D., Cerutti F., Cenacchi G., Izzi L., Camussi G., Forni M. Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Derived from Pancreatic Islets and Bone Marrow into Islet-Like Cell Phenotype. // PLoS One. - 2011. - V. 6(12). - e28175.

9. Gopurappilly R., Bhat V., Bhonde R. Pancreatic tissue resident mesenchymal stromal cell (MSC)-like cells as a source of in vitro islet neogenesis. // J Cell biochem. - 2013. - Apr 19. Doi: 10. 1002/jcb. 24572. [Epub ahead of print].

10. Chung C.H., Levine F. Adult Pancreatic Alpha-Cells: A New Soorce of Cells for Beta-Cells Regeneration. // Rev Diabet Stud. - 2010. - V. 7(2). - P. 124-131.

11. Okuno M., Minami K., Okumachi A., Miyawaki К., Yokoi N., Toyokuni S., Seino S. Generation of insulin-secreting cells from pancreatic acinar cells of animal models of type 1 diabetes. // Am J Physiol Endocrinol Metab. - 2007. - V. 292(1). - P. 158-165.

12. Suzuki A., Nakauchi H., Taniguchi H. Prospective Isolation of Multipotent Pancreatic Progenitors Using Flow-Cytometric Cell Sorting. // Diabetes. - 2004. - V. 53, N8. - P. 2143-2152.

13. Zhou Q., Law A.C., Rajagopal J. et al. A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis // Dev. Cell. - 2007. - Vol. 13. - P. 103-114.

14. Sugiyama Т., Rodriguez R.T., McLean G.W., Kim S.K. Conserved markers of fetal pancreatic epithelium permit prospective isolation of islet progenitor cells by FASC // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2007. - Vol. 104. - P. 175-180.

15. Akira S., Masahide Y., Hiroshi Y. et al., Identification of insulinproducing cells derived from embryonic stem cells by zinc-chelating dithizone. // Stem Cells. - 2002. - V. 20. - P. 284-292.

16. Minami К., Okuno M., Miyawaki K., Okumachi A., Ishizaki K., Oyama K., Kawaquchi M., Ishizuka N., Iwanaqa Т., Seino S. Lineage tracing and characterization of insulin-secreting cells generated from adult pancreatic acinar cells. // Proc Natl Acad Sci USA. - 2005. - V. 102(42). - P. 15116-15121.

17. Okuno M., Minami K., Okumachi A., Miyawaki K., Yokoi N., Toyokuni S., Seino S. Generation of insulin-secreting cells from pancreatic acinar cells of animal models of type 1 diabetes. // Am J Physiol Endocrinol Metab. - 2007. - V. 292(1). - P. 158-165.