Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НАРУШЕНИЯ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО МЕТАБОЛИЗМА ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ВНЕБОЛЬНИЧНОЙ ПНЕВМОНИИ У ДЕТЕЙ

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, пульмонологии, и может быть использовано для оценки степени нарушения энергетического метаболизма лимфоцитов крови у детей с внебольничной пневмонией (ВП) по увеличению процента лимфоцитов со сниженным мембранным потенциалом митохондрий (Δψ) (МПМ).

Несмотря на совершенствование методов профилактики, диагностики и лечения, до настоящего времени существенных тенденций к снижению удельного веса внебольничных пневмоний (ВП) в заболеваемости детского населения не отмечается [В.К. Таточенко Пневмония у детей: диагностика и лечение // Лечащий врач. - 2008. - №8. - С. 5-9.].

Основным патогенетическим звеном заболеваний бронхолегочной системы является расстройство внешнего и тканевого дыхания, снижение окислительных процессов и развитие кислородной недостаточности, которая приводит к нарушению гемостаза и всех видов обмена веществ. Многочисленными исследованиями установлено, что развитие и течение многих заболеваний сопровождается снижением энергообеспечения лимфоцитов [Шабельникова Е.И. Морфо-функциональные характеристики митохондрий лимфоцитов у детей при различных формах недостаточности клеточного энергообмена: автореф. дис. … канд. мед. наук. - М., 2005. - 28 с.].

Установлено, что при многих заболеваниях у детей возникают нарушения окислительного фосфорилирования, связанные со снижением активности митохондриальной электронно-транспортной системы, и именно у этих детей острая бронхолегочная патология протекает с осложненным течением и бывает торпидной к стандартной этиопатогенетической терапии [Клембовский А.И., Сухоруков B.C. Митохондриальная недостаточность у детей // Арх. патологии. - 1997. - №5 (59). - С. 3-7]. Резервом улучшения течения заболевания у детей является ранняя диагностика нарушений энергообмена в лимфоцитах.

Рядом авторов выдвинуто предположение о наличии различных типов индивидуального энергетического статуса организма и существовании скрытой формы относительной индивидуальной его недостаточности - «энергодефицитного диатеза», что накладывает свой отпечаток на течение различных болезней и требует специфической энерготропной коррекции [Сухоруков B.C. Нарушение клеточного энергообмена у детей. - М.: Медицина, 2000. - 80 с.].

Известен способ диагностики нарушений энергообразования в митохондриях по активности ферментов аспартатаминотрансферазы (ACT), аланинами-нотрансферазы (АЛТ), креатинфосфокиназы (КФК), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в сыворотке крови подростков, проживающих [RU 2465599 C2, 27.08.2010]. Недостатком этого способа является то, что необходимо определять несколько ферментов, не позволяет оценить значимость изменения показателей для детей, больных ВП.

Имеется способ измерения митохондриальной активности лимфоцитов [RU 2302635 C1 28.12.2005], заключающийся в измерении активности сукцинатдегидрогеназы в отдельных популяциях лимфоцитов методом проточной цитометрии. Однако недостатком этого способа является необходимость больших экономических и временных затрат из-за необходимости использования большего количества реагентов для фенотипирования субпопуляций лимфоцитов.

Во внутренней мембране митохондрий находятся элементы дыхательной цепи, в том числе и сукцинатдегидрогеназа, поэтому нарушение процессов энергообразования может изменять трансмембранный протонный потенциал. Имеются данные о нарушении функционального состояния клеток, связанные с изменением МПМ [A. Perelman et al. JC-1: alternative excitation wavelengths facilitate mitochondrial membrane potential cytometry // Cell Death and Disease. - 2012. - 3. - C. 1-7.; Кондратьева E.B., Лобанова Е.Г. Влияние озона на мембранный потенциал митохондрий тромбоцитов // Медицинский альманах. - 2013. - №3 (27). - С. 58-59.; RU 2503003 C1 08.10.2012].

Наиболее близким аналогом заявляемого изобретения является способ определения клеточного энергообмена у детей с пневмониями, заключающийся в цитохимическом определении активности окислительно-восстановительных ферментов - сукцинатдегидрогеназы (СДГ), глутаматдегидрогеназа (ГДГ), альфа-глицерофосфатдегидрогеназы (α-ГФДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в иммунокомпетентных клетках крови [Кондратова И.Ю., Сенаторова А.С. Клеточный энергетический обмен у детей первого года жизни при осложненных пневмониях // Международный медицинский журнал. - 2008. - №4. - С. 36-39].

Недостатком данного способа является:

- субъективность производных измерений;

- требование более длительных временных и финансовых затрат, так как необходимо определение нескольких ферментов, участвующих в системе окислительно-восстановительных реакций в цикле Кребса;

- отсутствие дифференцирования степени нарушения энергетического метаболизма лимфоцитов для необходимости коррекции энергодефицита и достижения максимальной эффективности терапии внебольничной пневмонии у детей.

Задача изобретения: улучшение диагностики, упрощение интерпретации данных и повышение точности определения нарушения энергетического метаболизма лимфоцитов при внебольничной пневмонии у детей.

Технический результат - возможность более быстрой диагностики нарушений энергообеспеченности лимфоцитов у детей с ВП путем учета процента лимфоцитов с пониженным МПМ (Δψ) методом проточной цитометрии для своевременной коррекции выявленных нарушений.

Положительный эффект: способ более точный, объективный - позволяет проанализировать от 5 тыс. до 25 тыс. лимфоцитов, в отличие от световой микроскопии, где учет ведется в 50-200 клетках, является интегральным показателем нарушения энергообеспеченности лимфоцитов, дает возможность обосновать назначения препаратов, улучшающих функциональную активность митохондрий.

Технический результат достигается тем, что у детей в гепаринизированной крови определяли процент лимфоцитов с пониженным МПМ с использованием красителя JC-1 (5,5′,6,6′-тетрахлор-1,1′,3,3′ тетраэтилбензимидазолкарбоцанин иодид/хлорид) (Bector Dikcenson, США). JC-1 является катионным красителем, поглощение которого митохондриями напрямую связано с величиной митохондриального мембранного потенциала [Michael Е. Widlansky et al., ltered Mitochondrial Membrane Potential, Mass, and Morphology n the Mononuclear Cells of Humans with Type 2 Diabetes // Transl. Res. - 2010. - 156(1). - P. 15-25].

Способ осуществляют следующим образом: из локтевой вены утром, натощак, спустя 12-14 ч после последнего приема пищи берут 1 мл крови в гепаринизированную пробирку. 800 мкл крови наслаивается на 400 мкл фиколл-верографина, центрифугируется при 1500 об/мин в течение 15 минут, собирается лимфоцитарное кольцо, которое центрифугируется 5 минут при 1000 об./мин, надосадочная жидкость сливается.

Клетки окрашиваются красителем JC-1, после чего инкубируются 15 минут при температуре 37°C, затем дважды промываются буфером, после чего подвергаются анализу на цитометре BD FACS Calibur (США) в программе Cell Quest Pro.

На основании полученных результатов осуществлен анализ градации показателей и рассчитаны диапазоны значений МПМ.

В зависимости от степени понижения МПМ разделяют детей на 3 степени:

1 степень - уровень МПМ от 0 до 35% (норма);

2 степень - уровень МПМ от 36 до 75% (субкомпенсированные нарушения, не требующие специфической энерготерапии);

3 степень - уровень МПМ от 76% и более (декомпенсированные нарушения, требующие в комплексном лечении ВП назначения энерготропов).

Для раскрытия сущности изобретения приведены результаты исследования процента выявления лимфоцитов со сниженным МПМ в периферической крови при поступлении в стационар у 55 детей с ВП, контролем послужили показатели у 30 здоровых детей, сопоставимых по полу и возрасту.

Параллельно проведено исследование активности ферментов сукцинатдегидрогеназы (СДГ), альфа-глицерофосфатдегидрогеназы (α-ГФДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в лимфоцитах периферической крови количественным методом [Нарциссов Р.П. Применение паранитротетразолия фиолетового для количественного цитохимического определения дегидрогеназ лимфоцитов человека // Архив анатомии, гистологии, эмбриологии. - 1969. - №5. - С. 85-91], основанным на реакции восстановления солей тетразолия и выпадения осадка диформазана в местах активности фермента. Активность дегидрогеназ выражалась средним числом гранул в одной клетке. За норму принимали показатели: СДГ - 20-24 гранул/клетке, α-ГФДГ - 11-15 гранул/клетке, ЛДГ - 11-17 гранул/клетке (табл. 1).

В 1 день поступления у детей с ВП сниженный МПМ 1 степени выявлен у 1 ребенка (1,8%), 2 степени - у 35 чел. (63,7%), 3 степени - у 19 чел. (34,5%), т.е. в 98,2% случаев выявлено снижение М1ТМ лимфоцитов.

Снижение активности СДГ в 1 день госпитализации выявлено у 61% больных, α-ГФДГ - у 45,5%, ЛДГ - у 30,9% больных.

Использование заявляемого способа по определению процента лимфоцитов со сниженным МПМ, отражающим функциональное и энергетическое состояние лимфоцита, позволяет выявить среди больных ВП детей, имеющих нарушение энергообеспеченности лимфоцитов для ранней диагностики нарушений энергообмена, необходимости и своевременного назначения энергокорригирующей терапии.

В результате обработки аналитических данных было установлено, что способ является более простым в сравнении с известными аналогами и позволяет определить нарушения энергетического метаболизма лимфоцитов с повышенной точностью.

Преимущества предлагаемого способа:

1. Увеличение процента лимфоцитов со сниженным МПМ позволяет судить о нарушении энергетического состояния лимфоцитов на ранней стадии заболевания.

2. Изменение МПМ опережает изменение показателей окислительно-восстановительных ферментов по данным цитохимических исследований.

3. Позволяет проанализировать одномоментно от 5 тыс. до 25 тыс. лимфоцитов.

4. Является интегральным показателем энергетического состояния лимфоцитов и позволяет выделить состояния, требующие метаболической поддержки.

Клинические примеры:

Пример 1. Ребенок Ксения П., 4 года. Жалоб не предъявляет. По органам без особенностей. Диагноз: здорова. При цитохимическом исследовании: СДГ 26,7 гр/кл, α-ГФДГ 12,0 гр/кл, ЛДГ 11,1 гр/кл. Доля лимфоцитов со сниженным МПМ - 24,7%. Заключение: нарушений энергетического метаболизма лимфоцитов не выявлено.

Пример 2. Ребенок Даниил Т., 4 года. Поступил в клинику НИИ ОМиД с диагнозом: Пневмония внебольничная, острого течения, очаговая в нижней доле справа, неуточненной этиологии, средней степени тяжести. Жалобы на малопродуктивный кашель, насморк, повышение температуры тела до 39°C, снижение аппетита. Заболел остро, когда появился малопродуктивный частый кашель, насморк и повышение температуры тела до фебрильных цифр. Получал симптоматическую терапию. При поступлении состояние средней степени тяжести. Кожные покровы бледные, выражен периорбитальный цианоз. Аускультативно в легких дыхание жесткое, с двух сторон влажные мелкопузырчатые хрипы, больше справа. ЧД 26 в минуту. ЧСС 110 в минуту. В гемограмме Hb - 118 г/л, Er - 4,4·10¹²/л, Le - 6,0·10⁹/л, п - 7%, с - 55%, э - 0%, 6 - 0%, л - 32%, м - 4%, плазматические клетки - 2%, СОЭ - 14 мм/ч. При цитохимическом исследовании: СДГ 37,6 гр/кл., α-ГФДГ 19,9 гр/кл., ЛДГ 20,4 гр/кл. - регистрировалось увеличение показателей активности окислительно-восстановительных ферментов. При обследовании выявлено 93,9% лимфоцитов со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий, что соответствует 3 степени нарушения энергообмена - «декомпенсированный энергодефицит» лимфоцитов. На 10 день лечения улучшения цитохимических показателей не наступило: СДГ - 15,2 гр/кл., α-ГФДГ - 8,8 гр/кл., ЛДГ - 17,7 гр/кл. при сниженном МПМ, что потребовало назначения энерготропной терапии.

Пример 3. Ребенок Кирилл В., 5 лет. Поступил в клинику НИИ ОМиД с диагнозом: Пневмония внебольничная, острого течения, левосторонняя нижнедолевая, неуточненной этиологии, средней степени тяжести. Жалобы на длительный кашель, частый малопродуктивный в дневное время, заложенность носа. Заболевание началось с подъема температуры до 38,7°C, кашля, насморка. Получал симптоматическую терапию без эффекта. При поступлении: состояние средней степени тяжести. Кожные покровы бледные, периорбитальный цианоз. Тоны сердца громкие, ритмичные. ЧСС 92 в минуту. Аускультативно в легких дыхание жесткое, с двух сторон влажные хрипы. ЧД 24 в минуту. В гемограмме: Hb - 143 г/л, Er - 5,11·10¹²/л, Le - 15,9·10⁹, п - 1%, с - 51%, э - 2%, 6-0%, л - 39%, м - 7%, СОЭ - 5 мм/ч. При цитохимическом исследовании: СДГ - 24,56 гр/кл., α-ГФДГ - 13,12 гр/кл., ЛДГ - 26,56 гр/кл. - показатели СДГ и α-ГФДГ в пределах нормы, увеличение ЛДГ свидетельствует о начале активации компенсаторного анаэробного пути получения энергии. При обследовании выявлено 78,3% лимфоцитов со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий, что соответствует 3 степени нарушения энергообмена «декомпен-сированный энергодефицит». На 10 день лечения: СДГ - 17,1 гр/кл., α-ГФДГ - 16,4 гр/кл., ЛДГ 23,7 гр/кл. - снижение активности окислительно-восстановительных ферментов потребовало назначения энерготропной терапии.

Пример 4. Ребенок Анастасия К., 7 лет. Поступила в клинику НИИ ОМиД с диагнозом: Пневмония внебольничная, двусторонняя, в нижней доле слева, в S7,8 справа, очаговая, острого течения, средней степени тяжести, микоплазменной этиологии. Жалобы: подъем температуры тела до 37,4°-38,0°C, малопродуктивный частый кашель, слабость, снижение аппетита. При поступлении стояние степени тяжести. Кожные покровы: бледные, периорбитальные тени. ЧСС 96 в 1 минуту. ЧД 26 в 1 минуту. Перкуссия легких: легочный звук. Аускультация легких: жесткое дыхание, ослаблено в нижних отделах, выслушиваются влажные, крепитирующие хрипы с обеих сторон в нижних отделах, единичные сухие хрипы. В гемограмме: Hb - 140 г/л; Er - 5,07·10¹²/л; Le - 13,3·10⁹/л; п - 4%; с - 64%; л - 30%; м - 1%; баз - 1%; СОЭ - 35 мм/ч, токсическая зернистость нейтрофилов ++. При цитохимическом исследовании: СДГ - 19,4 гр/кл., α-ГФДГ - 12,28 гр/кл., ЛДГ - 21,68 гр/кл. При обследовании выявлено 59,4% лимфоцитов со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий, что соответствует 2 степени энергодефицита «субкомпенсированные нарушения». На 10 день лечения улучшение цитохимических показателей: СДГ - 21,5 гр/кл., α-ГФДГ - 16,5 гр/кл., ЛДГ 21,8 гр/кл., при МПМ - 48,39% свидетельствует об отсутствии необходимости назначения энерготропной терапии.

Таким образом, способ позволяет достоверно определить нарушения энергообеспеченности клеток на более раннем этапе при отсутствии изменений активности СДГ, что позволяет использовать его в клинической практике для выделения групп риска детей с ВП, требующих метаболической коррекции. Данный метод непродолжителен, легко воспроизводим, высокочувствителен.

Литература

Курашвили Л.В., Булавкин Ю.В. Кондратова И.Ю., Сенаторова А.С. Клеточный энергетический обмен у детей первого года жизни при осложненных пневмониях // Международный медицинский журнал. - 2008. - №4. - С. 36-39.

Сенаторова А.С., Сухоруков В.С., Кондратова И.Ю. Энергодефицитные состояния как фактор риска осложненного течения пневмоний у детей первого года жизни // Одеський медичний журнал. - 2009. - №4(114). - С. 43-47.