Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Candida parapsilosis - ПРОДУЦЕНТ ЛИПАЗЫ

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Штамм Candida parapsilosis Μ10, обладающий высокой липолитической активностью депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУПГосНИИГенетика (г. Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) под регистрационным номером ВКПМ: Υ-4055 и может быть использован при получении ферментного препарата липазы. Изобретение позволяет получать штамм, обладающий высокой липазной активностью.

Липолитические ферменты - это гидролазы эфиров насыщенных и ненасыщенных алифатических кислот, содержащих не менее 12 атомов углерода.

Они имеют широкий спектр применения - в пищевой промышленности, бытовой химии, косметике, медицине. Значительный интерес к практическому использованию ферментов в медицине обусловлен важной ролью, которую они играют в биологических процессах, в частности в процессах пищеварения у человека и животных. Не меньший интерес представляет их практическое применение в пищевой промышленности - в сыроделии, в хлебопечении. Липазы микроорганизмов в сочетании с другими ферментами применяются для биологической очистки сточных вод.

Известен штамм Trichosporon fermentans WU-C12 (Chen J., Ishii Т., Shimura S., Kirimura K. and Usami S. Lipase production by Trichosporon fermentans WU-C12, a newly isolated yeast. Journal of Fermentation and Bioengineering, 1992, vol. 73, p. 412-414), обладающий липолитической активностью. Недостатком штамма является низкая активность липазы.

Известен рекомбинантный штамм Pichia pastoris (Catoni Ε., Schmidt-Dannert С, Brocca S., Schmid R. Overexpression of lipase A and В of Geotrichum candidum in Pichia pastoris: high-level production and some properties of functional expressed lipase B. Biotechnology Techniques, September 1997, vol. 11, no. 9, p. 689-695), обладающий липолитической активностью. Недостатком штамма является низкая активность липазы.

Известен дикий штамм Yarrowia lipolytica W29 (АТСС 20460), служивший родительским штаммом (J. Biotechnol., 2004, vol. 109 рр. 63-81) для ряда штаммов реципиентов, в том числе Yarrowia lipolytica Pold (CLIB 139) и Yarrowia lipolytica Polf (ATCC MYA-2613). Несмотря на то что они хорошо охарактеризованы биохимически и генетически, вышеуказанные продуценты не способны обеспечивать высокий уровень липолитической активности.

Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению является штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3600 (патент РФ №2475532). В патенте описан способ получения рекомбинантного штамм Y. lipolytica ВКПМ Y-3600 путем трансформации штамма Y. lipolytica Polf (leu+) экспрессионной плазмидой pY-Y1PIR1-LIP2. К недостаткам штамма можно отнести невысокую активность продуцента, а также затруднительное выделение и очистку ферментного препарата.

Задачей заявленного изобретения является получение нового дрожжевого штамма, обладающего высокой липолитической активностью.

Технический результат заявленного изобретения - улучшение биотехнологии липазы, возможность применения этого фермента в пищевой промышленности.

Технический результат достигается за счет применения нового штамма Candida parapsilosis М10, выделенного из образца сливочного масла. Критериями отбора микроорганизмов служили изменение цвета индикатора в составе селективной питательной среды при выращивании колоний дрожжей, величина зон просветления вокруг них и количество накапливаемой липазы в фильтрате культуральной жидкости по истечении срока ферментации.

За единицу активности липазы принимают такое количество фермента, которое при рН 7,0 и температуре 37°C в течение 1 часа катализирует гидролиз 40%-ной эмульсии оливкового масла с образованием 1 мкмоль олеиновой кислоты.

Предлагаемый штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУПГосНИИГенетика (г. Москва, 1-й Дорожный проезд, 1). Регистрационный номер ВКПМ: Y-4055.

Штамм Candida parapsilosis М10 характеризуется следующими признаками:

Принадлежность штамма Candida parapsilosis М10 к указанному виду была выявлена на основе генетического анализа секвенсов вариабельных участков 18S рРНК. Гомология составила 99%.

Морфология клетки.

При росте на жидкой среде Сабуро (пептон - 10 г/дм³, глюкоза - 40 г/дм^3, вода - остальное) суточная культура дрожжей представлена овальными, удлиненно-овальными, округлыми клетками. Размеры клеток колеблются от 2,5-4 мкм в ширину и 2,5-9 мкм в длину. Ко вторым суткам большинство клеток почкуются и образуют псевдомицелий. Клетки хорошо растут на простых питательных средах.

При росте на жидкой среде Candida parapsilosis Μ10: наблюдается помутнение, образуется осадок и кольцо на стенках пробирки, пигментации среды нет, выделения газа нет, запах - характерный дрожжевой.

Культуральные признаки Candida parapsilosis М10.

На поверхности плотных питательных сред типа Сабуро Candida parapsilosis М10 образует колонии, имеющие следующие признаки:

- форма - круглая с фестончатым краем;

- размер (диаметр) - от 1 до 7 мм;

- поверхность - крупно-складчатая;

- профиль - плоский, врастающий в субстрат;

- блеск и прозрачность - колония блестящая, непрозрачная;

- цвет - светлый грязновато-бежевый;

- край - волнистый;

- структура - крупнозернистая;

- консистенция - плотная кожистая.

Особенности роста по штриху Candida parapsilosis М10: штрих обильный, сплошной с волнистым краем, поверхность крупно-складчатая, блестящая, светлого грязновато-бежевого цвета. Спор не образует.

Физиолого-биохимические признаки.

Облигатный аэроб. Сбраживает глюкозу. Ассимилирует: глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, D-ксилозу, D-рибозу, глицерин, лимонную и янтарную кислоты. Не ассимилирует: целлобиозу, лактозу, раффинозу, инулин, D-арабинозу, L-рамнозу, молочную кислоту. Не ассимилирует нитраты. Растет в безвитаминной среде, однако биотин является сильным стимулятором роста.

Разжижает желатин. Гидролизует мочевину.

Отношение Candida parapsilosis M10 к концентрации хлористого натрия в питательной среде: на средах с добавлением NaCl (8%, 10%, 12%) наблюдался интенсивный рост культуры.

Отношение Candida parapsilosis М10 к рН среды: рост культуры наблюдается в области рН от 3 до 9.

Отношение Candida parapsilosis М10 к температуре культивирования:

- при 20°C - слабый рост;

- при 25°C - обильный рост;

- при 30°C - обильный рост;

- при 37°C - обильный рост;

- при 50°C - слабый рост.

Условия и состав среды для длительного хранения штамма: агаризованная питательная среда Сабуро с добавлением трибутирина - 0,1%, ионов Са²⁺ - 0,03-0,08%, t 4-6°C. Пересевы на свежие среды - один раз в три месяца.

Условия и состав среды для размножения штамма: скошенная агаризованная питательная среда Сабуро, температура инкубирования 28-30°C, длительность инкубирования 48 ч.

Активность ферментного препарата липазы Г20Х, полученного на основе культивирования предлагаемого штамма достигает 30400-30500 ед/г.

Примеры осуществления изобретения.

Пример 1.

Субстратом для выделения дрожжей-продуцентов липаз служили образцы почвы, фруктов, масел, мясные и молочные продукты, содержащие повышенное количество липидов. С момента отбора материал хранили при температуре +4°C не более 1 месяца.

Отобранные образцы суспендировали в физиологическом растворе с добавлением гентамицина и выдерживали в термостате при температуре 30°C в течение 1 ч. Использование антибиотических препаратов на начальных этапах скрининга позволило исключить прорастание сопутствующих бактериальных культур.

Полученную накопительную культуру пересевали в чашки Петри на плотную обогащенную питательную среду М9 следующего состава (г/дм³): Na₂HPO₄ - 6; KH₂PO₄ - 3; NaCl - 0,5; NH₄Cl - 1; оливковое масло - 10; агар - 20. Инкубирование проводили в термостате при температуре 30°C в течение 72 ч. По истечении срока инкубирования проводили отбор активных дрожжевых колоний, способных усваивать в качестве единственного источника углерода оливковое масло. Чистые культуры пересевали на селективную питательную среду следующего состава (г/дм³): Na₂HPO₄ - 6; KH₂РO₄ - 3; NaCl - 0,5; NH₄Cl - 1; трибутирин - 3; агар - 20; в присутствии красителя метиловый красный.

О наличии липолитической активности судили по величине зон просветления вокруг колоний, и по переходу цвета плотной питательной среды от желтого к оранжевому и далее к красному.

В результате проведенного скрининга был отобран штамм дрожжей, обладающий липолитической активностью.

Пример 2.

Культивирование штамма Candida parapsilosis Μ10, полученного в результате скрининга, на питательной среде следующего состава (г/дм³): горчичное масло - 26; глюкоза - 5; дрожжевой экстракт - 18; соевая мука - 10; KH₂РO₄ - 0,3; MgSO₄·7H₂O - 0,2; CaCO₃ - 3; твин-80 - 4,2; вода - до 1 дм³, в течение 48 ч при 30°C при постоянном перемешивании позволяет достичь в фильтрате КЖ активности фермента 235-240 ед/см³. Возраст посевного материала - 36-48 ч, доза - 5% от объема питательной среды (количество клеток 5·10⁷ кл/см³.

Выделение и концентрирование ферментного препарата липазы из фугата культуральной жидкости Candida parapsilosis Μ10 проведенное методами ультрафильтрации и стерилизующей фильтрации позволяет получить ферментный препарат с активностью липазы 30400-30500 ед/г.