Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПОЛИНЕВРОПАТИИ ТОНКИХ ВОЛОКОН У ПАЦИЕНТОВ С ЦЕЛИАКИЕЙ

Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностике, и может быть использовано в неврологии для диагностики полиневропатии тонких волокон у пациентов с целиакией.

В настоящее время уделяется огромное внимание разработке новых методов диагностики неврологических заболеваний. Одну из самых распространенных групп среди неврологических заболеваний занимают заболевания периферической нервной системы. Полиневропатия (ПНП) является одним из самых частых заболеваний периферической нервной системы. Несмотря на возможности современной диагностики, не удается определить этиологию в 30% случаев ПНП. Спектр заболеваний, сопровождающихся развитием полиневропатии, достаточно широк и включает в себя синдром Гийена-Барре, диабет, острую перемежающуюся порфирию, алкоголизм, целиакию и ряд других.

Например, количество больных с алкогольной зависимостью составляет 2 млн 658 тыс. человек или 1,5-2% от общей численности населения [1]. Частота встречаемости алкогольной полиневропатии достигает среди указанной категории больных 65,8% [2]. Количество больных генетически детерминированным аутоиммунным заболеванием с преимущественным поражением желудочно-кишечного тракта - целиакией - также составляет 1,5-2% от общей численности населения, частота развития глютеновой полиневропатии составляет в данной категории пациентов 50% [3]. Развитие любой формы полиневропатии усугубляет течение и прогноз основного заболевания и снижает качество жизни пациентов.

При большинстве ПНП в патологический процесс вовлекаются нервные волокна всех размеров, но в отдельных случаях поражение ограничивается преимущественно либо толстыми, либо тонкими волокнами. Боль и парестезии - наиболее частые жалобы пациентов с ПНП тонких волокон. Поражение тонких волокон сопровождается не только болезненной ПНП, но и периферической вегетативной недостаточностью, а это аритмия, ортостатическая гипотензия, запоры, боли в животе, эректильная дисфункция. Глютеновая ПНП является самым частым неврологическим синдромом целиакии. Целиакия - это генетически детерминированная аутоиммунная энтеропатия, возникающая при употреблении глютена. Согласно нашему исследованию из 200 пациентов с целиакией ПНП отмечается более чем у 50% пациентов. У большинства наших пациентов ПНП носит аксональный сенсорно-вегетативный характер. Известно, что поражение нервной системы при целиакии уже на ранних стадиях проявляется в виде полиневропатии тонких нервных волокон (С-волокон). С-волокна являются окончаниями симпатических ганглиев, ганглиев тройничного нерва и задних корешков. Определение С-волокон позволяет проводить объективную диагностику периферической вегетативной недостаточности, которая часто определяет прогноз пациента, а также объективно диагностировать невропатическую боль, резистентную к лечению обычными методами. Одним из надежных методов диагностики полиневропатии тонких нервных волокон является биопсия кожи. Достоверным методом оценки состояния тонких нервных волокон в биоптате является электронная микроскопия, недоступная большинству лабораторий в повседневной практике.

Однако в своей работе большинство врачей руководствуются только данными электронейромиографии, альгезиметрии и неврологического статуса. В случае с полиневропатией тонких волокон электронейромиография не показывает патологических изменений.

Так, известен способ дифференциальной диагностики полиневропатии вибрационного генеза и диабетической полиневропатии [4], в основе которого лежит метод альгезиметрии. Пациенту при помощи альгезиметра проводят исследование болевой чувствительности на различных участках тела: выступающей части скуловой кости, грудине, выступающей части локтя, фаланге 2-го пальца кисти, бугорке большеберцовой кости, выступающей части внутренней лодыжки, 1-м пальце стопы и при показателях альгезиметрии свыше 0,5 мм во всех исследуемых точках тела диагностируют полиневропатию вибрационного генеза, а при увеличении показателей альгезиметрии только на ногах диагностируют диабетическую полиневропатию. Способ позволяет повысить точность дифференциальной диагностики.

Известный способ отражает функциональное состояние периферической нервной системы, но не показывает структурные изменения тонких нервных волокон, в связи с чем способ не позволяет проводить диагностику полиневропатии тонких волокон и не может применяться для ранней диагностики полиневропатии у больных целиакией.

Также известен способ прогнозирования развития полиневропатии критических состояний у больных при ожоговой травме [5].

В период ожогового шока и септикотоксемии определяют в сыворотке крови содержание ионов калия и натрия, сравнивают их содержание с нормой и, если их величина выходит за пределы нормы, вычисляют коэффициенты отношения абсолютного значения калия на момент исследования к среднему значению нормы и отношение абсолютного значения натрия к среднему значению нормы и затем соотношение этих коэффициентов калия к натрию и при полученном значении меньше 0,80 в течение 48 ч и более прогнозируют развитие полиневропатии при ожоговой травме в период ожогового шока или септикотоксемии.

Способ основан на определении биохимических показателей крови пациента, что косвенно соотносится с прогнозом в отношении развития полиневропатий, в связи с чем способ не может быть применен для диагностики полиневропатий тонких волокон.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа диагностики полиневропатии тонких волокон у пациентов с целиакией, обладающего высокой точностью и специфичностью.

Поставленная задача решается предлагаемым способом диагностики полиневропатии тонких волокон у пациентов с целиакией, заключающимся в заборе трех образцов кожи с дистального участка нижней конечности (на 100 мм выше латеральной лодыжки), после чего биоптаты фиксируют в растворе для фиксации, при этом в качестве раствора для фиксации препаратов используют 2% параформальдегид-лизинпериодат или 2% парафармальдегид, пикриновая кислота (раствор Замбони) в 3 мл в течение 2 дней при температуре 4°С, после чего биоптаты промывают 10 минут в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М, затем выдерживают в криопротективном растворе, который приготавливают из расчета 20 мл глицерина, 2 мл DMSO и 78 мл раствора Соренсена, при температуре 4°С в течение 12 часов, замороженные биоптаты нарезают по 50 микрон, промывают в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М 2 раза по 10 минут, добавляют первичные антитела в нужном разведении (1:100, 1:200 или 1:500), выдерживают 12 часов при комнатной температуре во влажной камере, промывают биоптаты в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М 2 раза по 10 минут, после чего добавляют вторичные антитела в разведении 1:100, оставляют на столе при комнатной температуре на 1 час, промывают в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М 2 раза по 10 минут, выдерживают в 30% растворе метанола в натрий-фосфатном буфере в течение 30 минут при комнатной температуре, промывают биоптаты в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М 2 раза по 5 минут, затем выдерживают биоптаты в авидин-биотиновой смеси (АВ смеси), приготовленной из расчета 1 A:1 B:100 PBS, в течение 1 часа при комнатной температуре, промывают в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М 2 раза по 10 минут, после чего к биоптатам добавляют смесь, приготовленную путем перемешивания 5 мл раствора натрий-фосфатного буфера 0,08М, 3 капель SG хромогена и 3 капель гидрогенпероксидазы, через 5 секунд после этого промывают биоптаты в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М 3 раза по 10 минут, затем погружают биоптаты в эозин на 5-8 сек, вслед за этим проводят дегидратацию в 70% этаноле 3 раза по 1 минуте и в 96% этаноле 3 раза по 1 минуте, затем опускают биоптаты в ксилол-I на 1 минуту, затем в ксилол-II на 1 минуту, закрепляют покровным стеклом, дожидаются высыхания полученных препаратов и проводят исследование препаратов методом световой микроскопии, в ходе которого определяют линейную плотность интраэпидермальных тонких нервных волокон, их диаметр, и при значении линейной плотности менее 11 волокон в 1 мм у пациентов с целиакией диагностируют полиневропатию тонких волокон, при значении линейной плотности, большем или равном 11 волокон в 1 мм, диагностируют отсутствие у обследуемого полиневропатии тонких волокон.

Предлагаемый способ отвечает критерию изобретения «новизна» и «изобретательский уровень», так как проведенные патентно-информационные исследования не выявили источников научно-технической и патентной литературы, которые бы порочили новизну предлагаемого изобретения, равно как и технических решений с существенными признаками предлагаемого способа

Техническим результатом предлагаемого способа является то, что он позволяет с высокой точностью и специфичностью осуществлять диагностику полиневропатии тонких волокон у пациентов с целиакией, при его экономичности и простоте. Предлагаемым способом на базе Нижегородской областной больницы им. Н.А. Семашко было проведено диагностирование 40 пациентов с подозрением на глютеновую полиневропатию. Во всех случаях для подтверждения диагноза был использован объективный метод оценки состояния тонких нервных волокон - электронная микроскопия образцов кожи. С помощью предлагаемого способа у 31 пациентов был установлен диагноз полиневропатия тонких нервных волокон, у 9 обследуемых было установлено отсутствие полиневропатии тонких волокон. Во всех случаях электронная микроскопия подтверждала установленный диагноз.

Данный технический результат обусловлен тем, что вначале производится забор трех образцов кожи с дистального участка нижней конечности (на 100 мм выше латеральной лодыжки), после чего биоптаты фиксируют в растворе для фиксации, при этом в качестве раствора для фиксации препаратов используют 2% параформальдегид-лизинпериодат или 2% парафармальдегид, пикриновая кислота (раствор Замбони) в 3 мл в течение 2 дней при температуре 4°С, после чего биоптаты промывают 10 минут в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М, затем выдерживают в криопротективном растворе, который приготавливают из расчета 20 мл глицерина, 2 мл DMSO и 78 мл раствора Соренсена, при температуре 4°С в течение 12 часов, замороженные биоптаты нарезают по 50 микрон, промывают в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М 2 раза по 10 минут, добавляют первичные антитела в нужном разведении (1:100, 1:200 или 1:500), выдерживают 12 часов при комнатной температуре во влажной камере, промывают биоптаты в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М 2 раза по 10 минут, после чего добавляют вторичные антитела в разведении 1:100, оставляют на столе при комнатной температуре на 1 час, промывают в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М 2 раза по 10 минут, выдерживают в 30% растворе метанола в натрий-фосфатном буфере в течение 30 минут при комнатной температуре, промывают биоптаты в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М 2 раза по 5 минут, затем выдерживают биоптаты в авидин-биотиновой смеси (АВ смеси), приготовленной из расчета 1 А:1 В:100 PBS, в течение 1 часа при комнатной температуре, промывают в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М 2 раза по 10 минут, после чего к биоптатам добавляют смесь, приготовленную путем перемешивания 5 мл раствора натрий-фосфатного буфера 0,08М, 3 капель SG хромогена и 3 капель гидрогенпероксидазы, через 5 секунд после этого промывают биоптаты в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М 3 раза по 10 минут, затем погружают биоптаты в эозин на 5-8 сек, вслед за этим проводят дегидратацию в 70% этаноле 3 раза по 1 минуте и в 96% этаноле 3 раза по 1 минуте, затем опускают биоптаты в ксилол-I на 1 минуту, затем в ксилол-II на 1 минуту, закрепляют покровным стеклом, дожидаются высыхания полученных препаратов и проводят исследование препаратов методом световой микроскопии, в ходе которого определяют линейную плотность интраэпидермальных тонких нервных волокон, их диаметр, и при значении линейной плотности менее 11 волокон в 1 мм у пациентов с целиакией диагностируют полиневропатию тонких волокон, при значении линейной плотности, большем или равном 11 волокон в 1 мм, диагностируют отсутствие у обследуемого полиневропатии тонких волокон.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Пошаговый протокол исследования

День первый исследования:

1. Забор образцов кожи с помощью иглы для биопсии с дистального участка нижней конечности (на 100 мм выше латеральной лодыжки) - 3 образца

2. Биоптаты фиксируют в 2% параформальдегид-лизинпериодате (2% PLP) или в растворе Замбони (2% параформальдегид, пикриновая кислота) - 3 мл в течение 2 дней при температуре 4°С

День второй исследования:

1. Приготовить Соренсон фосфатный буфер 0,08М (PBS)

1 Таблетка PBS - 100 мл дистиллированной воды

2. Приготовить криопротективный раствор:

20 мл глицерина

2 мл DMSO

78 мл Соренсон

3. Промыть биоптаты в PBS 1 раз - 10 минут

4. Залить криопротективным раствором на ночь, оставить при температуре 4°С

День третий исследования:

1. Нарезать замороженные биоптаты по 50 микрон

2. Промыть нарезанные биоптаты в PBS 2 раза по 10 минут

3. Добавить первичные антитела в нужном разведении (1:100, 1:200 или 1:500)

4. Оставить на ночь при комнатной температуре во влажной камере

День четвертый исследования:

1. Промыть биоптаты в PBS 2 раза по 10 минут

2. Добавить вторичные антитела в разведении 1:100

3. Оставить на столе при комнатной температуре на 1 час

4. Промыть дважды в PBS по 10 минут

5. Положить биоптаты в 30% метанол на PBS с 1% Н₂О₂ на 30 минут при комнатной температуре

6. Промыть в PBS 2 раза по 5 минут

7. Приготовить АВ смесь (максимум за 30 минут до использования) ABC-vector (АВ смесь):

1А : 1В

1АВ : 100 PBS

8. Положить биоптаты в АВ смесь и оставить на 1 час при комнатной температуре

9. Промыть 2 раза по 10 минут в PBS

10. В 5 мл PBS добавить 3 капли SG хромогена и перемешать

11. Затем добавить 3 капли гидроген пероксидазы и перемешать

12. Полученную смесь напрямую добавить на биоптаты на несколько секунд

13. Промыть биоптаты 3 раза по 10 минут в PBS

14. Погрузить в эозин на 5-8 секунд для докрашивания

15. Дегидратация 3 раза по 1 минуте в 70% этаноле и 3 раза по 1 минуте в 96% этаноле

16. Опустить биоптаты в ксилол-I на 1 минуту

17. Опустить биоптаты в ксилол-II на 1 минуту

18. Закрепить покровным стеклом

19. Дать высохнуть

Производят забор трех образцов кожи с дистального участка нижней конечности (на 100 мм выше латеральной лодыжки) с помощью стандартного хирургического набора для биопсии или с помощью иглы для биопсии, после чего биоптаты фиксируются в 3 мл 2% параформальдегид-лизинпериодате или в растворе Замбони (2% параформальдегид, пикриновая кислота) в течение 2 дней при температуре 4°С, после чего биоптаты промывают 10 минут в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М, затем выдерживают в криопротективном растворе, который приготавливают из расчета 20 мл глицерина, 2 мл диметилсульфоксида (DMSO) и 78 мл раствора Соренсен, при температуре 4°С в течение 12 часов, после чего замороженные биоптаты нарезают по 50 микрон, промывают в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М 2 раза по 10 минут, вслед за этим добавляют первичные антитела в нужном разведении (1:100, 1:200 или 1:500), выдерживают 12 часов при комнатной температуре во влажной камере, промывают биоптаты в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М 2 раза по 10 минут, после чего добавляют вторичные антитела в разведении 1:100, оставляют на столе при комнатной температуре на 1 час, промывают в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М 2 раза по 10 минут, выдерживают в 30% растворе метанола в натрий-фосфатном буфере в течение 30 минут при комнатной температуре, промывают биоптаты в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М 2 раза по 5 минут, затем выдерживают биоптаты в АВ смеси, приготовленной из расчета 1А : 1В : 100 PBS, в течение 1 часа при комнатной температуре, промывают в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М 2 раза по 10 минут, после чего к биоптатам добавляют смесь, приготовленную путем перемешивания 5 мл раствора натрий-фосфатного буфера 0,08М, 3 капель SG хромогена и 3 капель гидроген пероксидазы, через 5 секунд после этого промывают биоптаты в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М 3 раза по 10 минут, затем погружают биоптаты в эозин на 5-8 сек, вслед за этим проводят дегидратацию в 70% этаноле 3 раза по 1 минуте и в 96% этаноле 3 раза по 1 минуте, затем опускают биоптаты в ксилол-I на 1 минуту, затем в ксилол-II на 1 минуту, закрепляют покровным стеклом, дожидаются высыхания полученных препаратов и проводят исследование препаратов методом световой микроскопии, в ходе которого определяют линейную плотность интраэпидермальных тонких нервных волокон, их диаметр, и при значении линейной плотности менее 11 волокон в 1 мм у пациентов с целиакией диагностируют полиневропатию тонких волокон, при значении линейной плотности, большем или равном 11 волокон в 1 мм, диагностируют отсутствие у обследуемого полиневропатии тонких волокон. Предпочтительно, что выполнение биопсии возможно с помощью биопсийной иглы, что не требует наложения швов на место вмешательства.

Реализация предлагаемого способа занимает 1 неделю.

Примеры конкретного использования предлагаемого способа

Пример №1

Больная Р., 43 лет.

Клинически на основании выявленной акрогиперстезии, парестезии лица, туловища, конечностей, гипогидроза установлен предварительный диагноз полиневропатия глютеновой этиологии.

Произвели забор трех образцов кожи с дистального участка нижней конечности (на 100 мм выше латеральной лодыжки) с помощью иглы для биопсии, после чего биоптаты фиксировали в 3 мл 2% параформальдегид-лизинпериодате в течение 2 дней при температуре 4°С, после чего биоптаты промыли 10 минут в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М, затем выдержали в криопротективном растворе, который приготовили из расчета 20 мл глицерина, 2 мл DMSO и 78 мл раствора Соренсен, при температуре 4°С в течение 12 часов, после чего замороженные биоптаты нарезали по 50 микрон, промыли в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М 2 раза по 10 минут, вслед за этим добавили первичные антитела в 1:100 разведении, выдержали 12 часов при комнатной температуре во влажной камере, промыли биоптаты в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М 2 раза по 10 минут, после чего добавили вторичные антитела в разведении 1:100, оставили на столе при комнатной температуре на 1 час, промыли в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М 2 раза по 10 минут, выдержали в 30% растворе метанола в натрий-фосфатном буфере в течение 30 минут при комнатной температуре, промыли биоптаты в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М 2 раза по 5 минут, затем выдержали биоптаты в АВ смеси, приготовленной из расчета 1А : 1В: 100 PBS, в течение 1 часа при комнатной температуре, промыли в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М 2 раза по 10 минут, после чего к биоптатам добавили смесь, приготовленную путем перемешивания 5 мл раствора натрий-фосфатного буфера 0,08М, 3 капель SG хромогена и 3 капель гидрогенпероксидазы, через 5 секунд после этого промыли биоптаты в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М 3 раза по 10 минут, затем погрузили биоптаты в эозин на 5-8 секунд, вслед за этим провели дегидратацию в 70% этаноле 3 раза по 1 минуте и в 96% этаноле 3 раза по 1 минуте, затем опустили биоптаты в ксилол-I на 1 минуту, затем в ксилол-II на 1 минуту, закрепили покровным стеклом, дождались высыхания полученных препаратов и провели исследование препаратов методом световой микроскопии, в ходе которого определили линейную плотность интраэпидермальных тонких нервных волокон, равную 6,3 в 1 мм.

На основании полученных данных был поставлен диагноз: полиневропатия тонких нервных волокон. Данный диагноз позволил лечащему врачу провести посистемную диагностику периферической вегетативной недостаточности, назначить нейропротективную терапию.

Пример №2

Больная М., 60 лет.

Клинически установлен предварительный диагноз полиневропатия глютеновой этиологии.

Произвели забор трех образцов кожи с дистального участка нижней конечности (на 100 мм выше латеральной лодыжки) с помощью иглы для биопсии, после чего биоптаты фиксировали в 3 мл в растворе Замбони (2% параформальдегид, пикриновая кислота) в течение 2 дней при температуре 4°С, после чего биоптаты промыли 10 минут в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М, затем выдержали в криопротективном растворе, который приготовили из расчета 20 мл глицерина, 2 мл DMSO и 78 мл раствора Соренсен, при температуре 4°С в течение 12 часов, после чего замороженные биоптаты нарезали по 50 микрон, промыли в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М 2 раза по 10 минут, вслед за этим добавили первичные антитела в 1:100 разведении, выдержали 12 часов при комнатной температуре во влажной камере, промыли биоптаты в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М 2 раза по 10 минут, после чего добавили вторичные антитела в разведении 1:100, оставили на столе при комнатной температуре на 1 час, промыли в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М 2 раза по 10 минут, выдержали в 30% растворе метанола в натрий-фосфатном буфере в течение 30 минут при комнатной температуре, промыли биоптаты в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М 2 раза по 5 минут, затем выдержали биоптаты в АВ смеси, приготовленной из расчета 1А : 1В : 100 PBS, в течение 1 часа при комнатной температуре, промыли в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М 2 раза по 10 минут, после чего к биоптатам добавили смесь, приготовленную путем перемешивания 5 мл раствора натрий-фосфатного буфера 0,08М, 3 капель SG хромогена и 3 капель гидрогенпероксидазы, через 5 секунд после этого промыли биоптаты в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08М 3 раза по 10 минут, затем погрузили биоптаты в эозин на 5-8 секунд, вслед за этим провели дегидратацию в 70% этаноле 3 раза по 1 минуте и в 96% этаноле 3 раза по 1 минуте, затем опустили биоптаты в ксилол-I на 1 минуту, затем в ксилол-I1 на 1 минуту, закрепили покровным стеклом, дождались высыхания полученных препаратов и провели исследование препаратов методом световой микроскопии, в ходе которого определили линейную плотность интраэпидермальных тонких нервных волокон, равную 14,7 в 1 мм.

На основании полученных данных был поставлен диагноз: астеноневротическое состояние. Данный диагноз позволил лечащему врачу рекомендовать консультацию психотерапевта.

Источники информации

1. Кравцова Т.В., Великанова Л.П. Алкогольная аддикция - современное состояние проблемы. Астраханский медицинский журнал 2012; Т. 7. №2: 13-18.

2. Шнайдер Н.А. Частота встречаемости алкогольной полинейропатии среди больных хроническим алкоголизмом в ЗАТО Железногорск. Вестник Клинической больницы №51 2010; т.III (11): 42-45

3. Freeman HJ. Neurological disorders in adult celiac disease. Can. J. Gastroenterol. - 2008; 22(11): 909-911.

4. Патент РФ №2367338 Способ дифференциальной диагностики полиневропатии вибрационного генеза и диабетической полиневропатии.

5. Патент РФ №2225010 Способ прогнозирования развития полиневропатии критических состояний у больных при ожоговой травме.