Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ БАКТЕРИЙ Pseudomonas denitrificans, ОБЛАДАЮЩИЙ СВОЙСТВОМ УТИЛИЗИРОВАТЬ ФЕНАНТРЕН

Изобретение относится к области микробиологии и представляет собой новый бактериальный штамм, который может быть использован для очистки почвы, грунтовых и поверхностных вод при попадании в окружающую среду фенантрена.

Известны штаммы микроорганизмов: Pseudomonas alcaligenes Е7 [1], Trichoderma lignorum Л-1 ГКМ ВИЗР N 103 [2], Pseudomonas alcaligenes B-l [3], Mycobacterium flavescens EX-91 [4], Rhodococcus species 56Д [5], Pseudomonas putida 9 [6], Rhodococcus species MFN [7], которые могут разлагать углеводороды нефти, в том числе и ПАУ в почве и воде.

Недостатком вышеперечисленных штаммов является то, что они осуществляют деструкцию полициклических ароматических углеводородов, в том числе фенантрена, в течение длительного времени (от 5 до 20 суток).

Наиболее близким из указанных штаммов является Alteromonas sp. SN2. Его основным недостатком является то, что начало разрушения фенантрена фиксируется только на 2 сутки, на 5 сутки фиксируется разрушение 17% фенантрена, на 15 сутки фиксируется разрушение 50% фенантрена, а 100% разрушение достигается к 20 суткам.

Загрязнение окружающей среды ПАУ представляет серьезную угрозу здоровью населения и природе. Ароматические углеводороды - наиболее токсичные компоненты нефти [12]. Они являются хроническими токсикантами [13]. Наиболее опасна группа полиароматических углеводородов (ПАУ) [14, 15]. Источники ПАУ разнообразны. Они встречаются в нефти, отложениях смолы и каменного угля, а также выступают в роли побочных продуктов при сгорании топлива. В нефтях идентифицированы фенантрены, хризены, пирены, бензпирены, тетрафены [16]. Фенантрен - трициклический ароматический углеводород, класс опасности 2, обнаружена канцерогенность на мышах, вызывает тенденцию к лейкоцитозу, нарушению функции печени [17]. Предельно допустимая концентрация фенантрена в воздухе - 0,8 мг/м³. В исследовании 2010 года Стивена С. Хехта и его коллег [18] было показано, что фенантрен, содержащийся в сигаретном дыме, может разрушать ДНК после попадания в кровь.

Задача изобретения состоит в получении нового штамма микроорганизмов, быстро и эффективно утилизирующего in situ в почвах, грунтовых и поверхностных водах фенантрен при кислых и нейтральных условиях среды (рН 5-7)

Технический результат - получен штамм бактерий Pseudomonas denitrificans Fdl, эффективно утилизирующих in situ в почвах, грунтовых и поверхностных водах фенантрен при кислых и нейтральных условиях среды (рН 5-7) в течение 2 суток на 96,6-100%.

Штамм может быть использован для получения препарата для очистки почвы, грунтовых и поверхностных вод при попадании в окружающую среду фенантрена. Штамм может быть использован в качестве компонента при конструировании препаратов для биоремедиации загрязненных нефтью территорий, а также как источник ферментов для получения производных ароматических соединений в химической промышленности.

Источник выделения штамма

Предлагаемый штамм Pseudomonas denitrificans Fdl выделен из подзолистой нефтезагрязненной почвы, отобранной на юге ЯНАО (Пуровский район), путем культивирования навески почвы в жидкой минеральной среде, содержащей в 1 дм³: 1,0 г (NH₄)₂SO₄; 5,0 г КН₂РО₄; 0,1 г MgSO₄·7H2O; 5 мг Fe(NH₄)₂(SO₄)₂; 1 мл раствора микроэлементов, содержащего в 1 дм³: 23 мг MnCL₂·2H₂O; 31 мг Н₃ВO₃; 36 мг СоСl₂·6Н₂O; 10 мг СuСl₂·2Н₂O; 20 мг NiСl₂·6Н₂О; 50 мг ZnCl₂; 30 мг NaMoO₄·2H₂O. Вода дистиллированная - до 1 дм³; рН=7,0 в присутствии фенантрена в количестве 100 мг на 1 дм³ питательной среды.

Индивидуальный штамм был выделен из полученной культуральной среды путем пересевов индивидуальных колоний на чашках с минимальным агаром А [8], который содержит в 1 дм³: 1,0 г (NH₄)₂SO₄; 5,0 г KН₂РO₄; 0,1 г MgSO₄·7H₂O; 5 мг Fe(NH₄)₂(SO₄)₂; 1 мл раствора микроэлементов, содержащего в 1 дм³: 23 мг МnСL₂·2Н₂O; 31 мг Н₃ВО₃; 36 мг СоСl₂·6Н₂O; 10 мг СuСl₂·2Н₂O; 20 мг NiCl₂·6H₂O; 50 мг ZnCl₂; 30 мг NaMoO₄·2H₂O; 25 г Агар-агар; Вода дистиллированная - до 1 дм³; рН=7,0 в присутствии фенантрена в количестве 100 мг на 1 дм³ питательной среды.

Штамм Pseudomonas denitrificans Fdl идентифицирован в соответствии с данными секвенирования участка 16s rRNA и с определителем Берга [9] и депонирован в «Коллекции бактерий, грибов и бактериофагов» ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», п. Кольцово, Новосибирская область под номером В-1299.

Предлагаемый штамм характеризуется следующими морфологическими и физиолого-биохимическими признаками. Клетки представляют собой грамотрицательные подвижные палочки, расположенные по 1-2, чаще одиночные, с размером 0,4-0,5×1,5-2,5 мкм, неспороносные, не формирующие эндоспор, оксидазо- и каталазо-положительные. На мясо-пептонном агаре (МПА) образует серовато-белые мелкоморщинистые колонии с волнистыми краями, слегка врастающими в агар, вязкой консистенции. Рост в жидкой среде сопровождается помутнением среды, образованием пленки серовато-белого цвета и осадка.

Культура ферментирует глюкозу, мальтозу, ксилозу. Не продуцирует амилазу, лецитиназу, желатиназу, уреазу. Не гидролизует казеин, не образует индол и сероводород. Утилизирует цитрат, восстанавливает нитрат. Реакция Фегес-Проскауэра отрицательная. При росте не происходит гемолиза, отсутствует плазмокоагулаза, фенилаланиндезаминаза. Отсутствует фибринолитическая активность.

Культура использует в качестве единственного источника углерода фенантрен, фенантрен с детергентом ТВИН-20.

Штамм хорошо растет на богатых питательных средах на основе мясопептонного бульона и ферментативного гидролизата рыбной муки.

Условия хранения: в лиофилизированном состоянии при 4°С - 3 года; на мясо-пептонном агаре при 4°С две недели, в пробирках на скошенном агаре под стерильным вазелиновым маслом при 4°С до года.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1

Штамм бактерий Pseudomonas denitrificans Fdl выращивают аэробно в жидкой среде на мясо-пептонном бульоне (рН=7.0) с 100 мг/дм³ фенантрена на качалке при 150 об/мин и температуре 35±2°С в течение 18 часов. Титр выросшей культуры составляет 5×10⁹ колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 см³ питательной среды.

Пример 2

Штамм Pseudomonas denitrificans Fdl выращивают на жидкой минеральной среде, содержащей в 1 дм³: 1,0 г (NH₄)₂SO₄; 5,0 г KН₂РO₄; 0,1 г MgSO₄·7H₂O; 5 мг Fe(NH₄)₂(SO₄)₂; 1 мл раствора микроэлементов, содержащего в 1 дм³: 23 мг MnCL₂·2H₂O; 31 мг Н₃ВО₃; 36 мг СоСl₂·6Н₂O; 10 мг СuСl₂·2Н₂O; 20 мг NiCl₂·6H₂O; 50 мг ZnCl₂; 30 мг Na₂MoO₄·2H₂O. Вода дистиллированная - до 1 дм³; рН=7,0. В присутствии фенантрена в количестве 100 мг на 1 дм³ питательной среды в качестве единственного источника углерода. Опыт проводят в четырех повторностях.

В колбы объемом 100 см³ вносят по 30 см³ минеральной среды и по 3 мг фенантрена. Колбы засевают клетками штамма Pseudomonas denitrificans Fdl до концентрации 1·10⁷ КОЕ/см³. В качестве контролей используют незасеянные колбы со средой, а также с фенантреном. Колбы культивируют на качалке при 150 об/мин и 35°С течение 14 суток. Эффективность биодеградации определяют после экстракции циклогексаном путем измерения оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 254 нм. Результаты эксперимента представлены в таблице 1. Полученные результаты показывают, что в течение 14 суток при 35°С штамм Fdl утилизирует фенантрен на 83,2±5,7% (таблица1).

Примечание: М - среднее четырех повторностей; m - доверительный интервал с вероятностью 95%

Пример 3

Штамм Pseudomonas denitrificans Fdl выращивают на жидкой минеральной среде, содержащей в 1 дм³: 1,0 г (NH₄)₂SO₄; 5,0 г KН₂РO₄; 0,1 г MgSO₄·7H₂O; 5 мг Fe(NH₄)₂(SO₄)₂; 1 мл раствора микроэлементов, содержащего в 1 дм³: 23 мг MnCL₂·2Н₂O; 31 мг Н₃ВО₃; 36 мг СоСl₂·6Н₂O; 10 мг СuСl₂·2Н₂O; 20 мг NiCl₂·6H₂O; 50 мг ZnCl₂; 30 мг NaMoO₄·2H₂O. Вода дистиллированная - до 1 дм³; рН=7,0. В присутствии 100 мг фенантрена и 7,5 г детергента ТВИН-20 на 1 дм³ питательной среды. Опыт проводят в четырех повторностях. В колбы объемом 100 см³ вносят по 30 см³ минеральной среды, по 3 мг фенантрена и по 250 мг детергента ТВИН-20. Колбы засевают клетками штамма Pseudomonas denitrificans Fdl до концентрации 1·10⁷ KOE/cм³. В качестве контролей используют незасеянные колбы со средой, а также с фенантреном. Колбы культивируют на качалке при 150 об/мин и 35°С в течение 24 часов. Эффективность биодеградации определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Результаты эксперимента представлены в таблице 2. Полученные результаты показывают, что в течение 24 часов при 35°С, рН=7.0 штамм Pseudomonas denitrificans Fdl утилизирует фенантрен на 100% (таблица 2).

Примечание: М - среднее четырех повторностей; m - доверительный интервал с вероятностью 95%

Пример 4

Штамм Pseudomonas denitrificans Fdl выращивают на жидкой минеральной среде, содержащей в 1 дм³: 1,0 г (NH₄)₂SO₄; 5,0 г KН₂РO₄; 0,1 г MgSO₄·7H₂O; 5 мг Fe(NH₄)₂(SO₄)₂; 1 мл раствора микроэлементов, содержащего в 1 дм³: 23 мг МnСL₂·2Н₂О; 31 мг Н₃ВО₃; 36 мг СоСl₂·6Н₂O; 10 мг СuСl₂·2Н₂O; 20 мг NiCl₂·6Н₂O; 50 мг ZnCl₂; 30 мг NaMoO₄·2H₂O. Вода дистиллированная - до 1 дм³; рН=5,0. В присутствии фенантрена в количестве 100 мг на 1 дм³ питательной среды в качестве единственного источника углерода. Опыт проводят в четырех повторностях. В колбы объемом 100 см³ вносят по 30 см³ минеральной среды и по 3 мг фенантрена. Колбы засевают клетками штамма Pseudomonas denitrificans Fdl до концентрации 1·10⁷ КОЕ/см³. В качестве контролей используют незасеянные колбы со средой, а также с фенантреном. Колбы культивируют на качалке при 150 об/мин и 35°С в течение 14 суток. Эффективность биодеградации определяют после экстракции циклогексаном путем измерения оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 254 нм. Результаты эксперимента представлены в таблице 3. Полученные результаты показывают, что в течение 14 суток при 35°С, рН=5,0 штамм Pseudomonas denitrificans Fdl утилизирует фенантрен на 76,6±4,5% (таблица 3).

Примечание: М - среднее четырех повторностей; m - доверительный интервал с вероятностью 95%

Таким образом, преимуществом предлагаемого штамма является то, что он при температуре 35°С, рН=7.0 утилизирует фенантрен за 14 суток на 83,2±5,7% (100 мг/л), в присутствии детергента ТВИН-20 за 1 сутки на 100% (100 мг/л).

Источники информации

1. Патент России №2134723, кл. С12N 1/20. Штамм Pseudomonas alcaligenes Е7, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. - 1999.

2. Патент России №2157842, кл. С12N 1/26. Штамм Trichoderma lignorum Л-1 ГКМ ВИЗР №103 для окисления углеводородов нефти и нефтепродуктов. - 2000.

3. Патент России №2133770, кл. С12N 1/20. Штамм Pseudomonas alcaligenes В-1, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. - 1999.

4. Патент России №92005971, кл. С12N 1/20. Штамм Mycobacterium flavescens ЕХ-91, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. - 1996.

5. Патент России №95119734, кл. С12N 1/20. Штамм Rhodococcus species 56D, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. - 1998.

6. Патент России №2134722, кл. С12N 1/20. Штамм Pseudomonas putida 9, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. - 1999.

7. Патент России №2133769, кл. С12N 1/20. Штамм Rhodococcus species MFN, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. - 1998.

8. Дэвис Р., Бодстайн Д., Рот Дж. Методы генетической инженерии. Генетика бактерий. Пер. с англ. под редакцией чл. - корр. АН СССР Р.Б. Хесина. - М.: Мир, 1984-176 с.

9. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Ninth Edition. Baltimore, Maryland: Williams&Wilkins, 1994. - 787 p.

10. Патент Республики Корея KR 20110059478 (А), кл. A62D 3/02; B09C 1/10; C12N 1/20. NEW MICROBIAL STRAIN ALTEROMONAS SP. SN2 FOR DEGRADING POLYCYCLIC AROMATIC HYDROCARBON. - 2011.

11. Патент США US 6503746 (B1), кл. B09B 3/00; B09C 1/10; C02F 3/34; C12N 1/20. Biologically pure Paenibacillus validus bacterial strains that degrade polyaromatic hydrocarbons. - 2003.

12. Mitchell R., Togel S., Chet I. Bacterial chemoreception. An important ecological phenomenon inhibited by hydrocarbons. 1972, Water Res. 6: 1137-1140.

13. Baker, J.M. Growth stimulation following oil pollution. In: Cowell EB (ed.) The ecological effects of oil on pollution and littoral communities. 1971, London Inst, of Petroleum, 72-77.

14. Ильницкий А.П., Лемвик Ж.Л., Шабад Л.М. О распределении канцерогенных углеводородов в пресноводных водоемах. - В кн. Канцерогенные вещества в окружающей среде. 1979, М. с. 48-53.

15. Шабад Л.М. О циркуляции канцерогенов в окружающей среде. 1973, М.: Медицина. 300 с.

16. Алексеева Т.А., Теплицкая Т.А. Спектрофлуориметрические методы анализа ароматических углеводородов в природных и техногенных средах. Под ред. Ф. Я. Ровинского. 1981, Л. Гидрометеоиздат, 215 с.

17. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ по измерению концентраций 3,4-бензпирена и некоторых других полиароматических углеводородов (ПАУ) (нафталин, фенантрен, антрацен, 1,2-бензантрацен, пирен, 3-метилхолантрен, 1,12-бензперилен) в воздухе рабочей зоны методом жидкостной хроматографии. №5879-91 от 10.09.1991.

18. Zhong Y., Carmella S.G., Upadhyaya P., Hochalter J.B., Rauch D., Oliver A., Jensen J., Hatsukami D., Wang J., Zimmerman C, Hecht S.S. Immediate Consequences of Cigarette Smoking: Rapid Formation of Polycyclic Aromatic Hydrocarbon Diol Epoxides // Chemical Research in Toxicology, 2010; 101227010050010. DOI: 10.1021 / tx100345x.