Результат интеллектуальной деятельности: СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ И АНТИМЕТАСТАТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ, ПОВЫШАЮЩЕЕ ПРОТИВОМЕТАСТАТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ЦИКЛОФОСФАНА

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и может быть использовано для подавления развития опухолевого процесса и одновременного повышения эффективности цитостатического лечения онкологических больных.

Современные методы лечения больных со злокачественными новообразованиями зачастую не гарантируют полного выздоровления в связи с возможностью развития в дальнейшем вторичных опухолей и рецидивов. Кроме того, успех в лечении таких пациентов часто определяется наличием, распространенностью метастазов, их чувствительностью к антибластомным препаратам. Поэтому средства, обладающие способностью ингибировать рост опухоли и метастазов, а также повышающие эффективность химиотерапии, представляют большой интерес и могут найти применение на всех этапах лечения онкологических пациентов.

Наиболее близким по фармакологическим эффектам является экстракт родиолы розовой жидкий [1]. Экстракт родиолы розовой жидкий относится к группе препаратов, оказывающих тонизирующее действие на центральную нервную систему. К противопоказаниям экстракта родиолы розовой относятся состояния возбуждения, гипертонические кризы, лихорадочные состояния больного [2]. При применении данного экстракта могут наблюдаться возбуждение, бессонница, головная боль. Недостатком указанного средства является ограничение при назначении больным с сопутствующим заболеванием - гипертонической болезнью, вследствие способности повышать кровяное давление.

Задачей, решаемой настоящим изобретением, является расширение арсенала средств растительного происхождения, ингибирующих развитие опухолевого процесса и повышающих противометастатическое действие циклофосфана.

Для решения этой задачи используют жидкий спиртовый экстракт плодов рябины обыкновенной (Sorbus aucuparia L.), полученный методом динамической дробной мацерации. Для получения экстракта использовали лабораторный реактор с паровой рубашкой («Radleys», Германия), подключенный к погруженному циркуляционному блоку регулирования температуры «М01» («Термэкс», Россия), верхнеприводной мешалке RZR 2020 («Heidolph», Германия) и шариковому холодильнику. Плоды рябины измельчали до размера частиц диаметром 0,3-0,5 см. Навеску плодов помещали в реактор, добавляли 95% подкисленный этиловый спирт. Экстрагировали при температуре 80°C в течение 60 минут. Полученным извлечением экстрагировали новую порцию сырья.

Подкисленный этиловый спирт готовили из расчета 6,49 г концентрированной кислоты хлористоводородной на 200 мл 95% спирта этилового.

Готовый экстракт отстаивали при температуре не выше +10°C не менее 2 суток до получения прозрачной жидкости, затем фильтровали и хранили при температуре не выше +5°C, в защищенном от света месте.

Экстракт на 95% подкисленном спирте представляет собой темно-вишневую жидкость, со специфическим фруктовым запахом кисловато-горького вкуса.

Сухой остаток жидкого экстракта плодов рябины обыкновенной определяли с помощью весового влагомера MS-70 («AND», Япония). Сухой остаток исследуемого экстракта составляет 14±0,22%.

По данным химического анализа, проведенного общепринятыми методами [3], основными действующими веществами экстракта являются фенолокислоты и антоцианы. Количественное определение данных групп БАВ в исследуемом экстракте проводили методом прямой спектрофотометрии [4,5]. Содержание суммы фенолокислот, в пересчете на хлорогеновую кислоту, в экстракте рябины обыкновенной составляет 2,97±0,15%, а суммы антоцианов, в пересчете на цианид-3-о-глюкозид - 1,09±0,05%.

Новым в предлагаемом изобретении является свойство жидкого спиртового экстракта плодов рябины обыкновенной (Sorbus aucuparia L.) проявлять противоопухолевую и антиметастатическую активность и одновременно повышать противометастатическое действие циклофосфана.

Новое свойство явным образом не вытекает из уровня техники в данной области, не очевидно для специалиста и не обнаружено в патентной и научно-медицинской литературе. Предлагаемое в качестве изобретения средство может быть использовано в клинической онкологии.

Предлагаемое изобретение соответствует условиям патентоспособности «Новизна», «Изобретательский уровень» и «Промышленная применимость».

Данное средство прошло экспериментальное исследование в лаборатории онкофармакологии НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга (Томск) и на кафедре фармакогнозии с курсами ботаники и экологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России.

Новые свойства жидкого спиртового экстракта плодов рябины обыкновенной были обнаружены экспериментальным путем. Изучение проведено на мышах-самках линии C57BL/6 массой 20-22 г в возрасте 3 мес. В качестве модели экспериментального злокачественного роста использовали гематогенно метастазирующую карциному легких Льюис (3LL), перевиваемую внутримышечно по 5 млн. опухолевых клеток на мышь.

Для проведения экспериментов животные (мыши-самки линии C57BL/6) были распределены на группы:

1. Контроль - животные с опухолью, которым зондом в желудок вводили 0,2 мл дистиллированной воды, начиная с 7 суток (сут) после перевивки в течение 12 сут. На 11 сут после перевивки опухоли животным однократно внутрибрюшинно инъецировали физиологический раствор в объеме 0,1 мл.

2. Циклофосфан (ЦФ) - животные с опухолью, которым зондом в желудок вводили 0,2 мл дистиллированной воды, начиная с 7 сут после перевивки в течение 12 сут. На 11 сут после перевивки опухоли мышам вводили однократно внутрибрюшинно ЦФ в дозе 125 мг/кг в 0,1 мл воды для инъекций.

3. Жидкий спиртовый экстракт плодов рябины обыкновенной (1 мл/кг) - животные с опухолью, которым вводили зондом в желудок жидкий экстракт плодов рябины обыкновенной в дозе 1 мл/кг в 0,2 мл дистиллированной воды, начиная с 7 сут после перевивки опухоли в течение 12 сут. На 11 сут после перевивки опухоли животным однократно внутрибрюшинно инъецировали физиологический раствор в объеме 0,1 мл.

4. Жидкий спиртовый экстракт плодов рябины обыкновенной (5 мл/кг) - животные с опухолью, которым вводили зондом в желудок жидкий экстракт плодов рябины обыкновенной в дозе 5 мл/кг в 0,2 мл дистиллированной воды в течение 11 сут, начиная с 7 сут после перевивки. На 11 сут после перевивки опухоли животным однократно внутрибрюшинно инъецировали физиологический раствор в объеме 0,1 мл.

5. ЦФ + жидкий спиртовый экстракт плодов рябины обыкновенной (1 мл/кг) - животные с опухолью, которым вводили зондом в желудок экстракт рябины обыкновенной в дозе 1 мл/кг в 0,2 мл дистиллированной воды, начиная с 7 сут после перевивки в течение 12 сут. На 11 сут после перевивки опухоли мышам вводили однократно внутрибрюшинно ЦФ в дозе 125 мг/кг в 0,1 мл воды для инъекций.

6. ЦФ + жидкий спиртовый экстракт плодов рябины обыкновенной (5 мл/кг) - животные с опухолью, которым вводили зондом в желудок жидкий экстракт плодов рябины обыкновенной в дозе 5 мл/кг в 0,2 мл дистиллированной воды в течение 11 сут, начиная с 7 сут после перевивки. На 11 сут после перевивки опухоли мышам вводили однократно внутрибрюшинно ЦФ в дозе 125 мг/кг в 0,1 мл воды для инъекций.

По окончании эксперимента (на 21 сут) животных умерщвляли, соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденные Министерством здравоохранения РФ. Проводили вскрытие животных, ревизию внутренних органов, выделение опухоли, подсчет метастазов. Эффективность проведенных курсов лечения оценивали по противоопухолевому и противометастатическому действию препаратов, определяя массу опухоли, процент торможения ее роста, частоту метастазирования, количество и площадь метастазов в легких [6, 7].

Обработку полученных результатов проводили с использованием непараметрических критериев Вилкоксона-Манна-Уитни (u) и углового преобразования Фишера (φ). Различия считали достоверными при Р<0,05 [8].

Для выявления фармакологического действия жидкого спиртового экстракта плодов рябины обыкновенной на развитие карциномы легких Льюис и эффективность лечения циклофосфаном мышей линии C57BL/6 был поставлен следующий эксперимент.

Пример 1.

В эксперименте на мышах-самках линии C57BL/6 с карциномой легких Льюис обнаружено, что при изолированном назначении мышам жидкого спиртового экстракта плодов рябины обыкновенной в дозах 1 и 5 мл/кг достоверно тормозился рост первичной опухоли (12 и 20%). Кроме того, у мышей, получавших жидкий спиртовый экстракт плодов рябины обыкновенной в дозе 1 мл/кг, количество метастазов в легких и их площадь оказались в 1,8 и 3,4 (Р<0,01) раза меньше таковых у нелеченых животных контроля; индекс ингибирования метастазирования в этой группе животных составил 44% (табл. 1).

Под влиянием циклофосфана масса опухоли у мышей уменьшилась в 1,6 раза, количество метастазов снизилось в 3,3 раза, их площадь оказалась многократно меньше контрольных значений (Р<0,05), индекс ингибирования метастазирования составил 72% (табл. 1).

При добавлении в схему химиотерапии жидкого спиртового экстракта плодов рябины обыкновенной масса первичной опухоли 3LL у мышей достоверно не менялась, прослеживалась лишь тенденция к ее уменьшению по сравнению с таковой у животных, получавших циклофосфан. В то же время, совместное использование циклофосфана с жидким спиртовым экстрактом плодов рябины обыкновенной привело к достоверному повышению противометастатического действия цитостатика. Так, количество метастазов и их площадь у мышей, получавших совместно с циклофосфаном жидкий спиртовый экстракт плодов рябины обыкновенной в дозах 1 и 5 мл/кг, оказались многократно меньше (в 10,7 и 16,8 раза и 34,8 и 11,6 раза соответственно, Р<0,01), частота метастазирования составила 20 и 38% против 90% у животных, леченных только циклофосфаном. В этих группах животных, получавших в комбинации с циклофосфаном спиртовой экстракт плодов рябины обыкновенной в обеих дозах, индекс ингибирования метастазирования оказался наивысшим, достигая 99% (табл. 1).

Установлена способность жидкого спиртового экстракта плодов рябины обыкновенной тормозить рост опухоли.

Выявлена возможность уменьшения количества и площади метастазов в легочной ткани животных с опухолями с помощью жидкого спиртового экстракта плодов рябины обыкновенной.

Обнаружено повышение противометастатического действия циклофосфана при его совместном использовании с жидким спиртовым экстрактом плодов рябины обыкновенной.

Таким образом, в эксперименте на мышах-самках линии C57BL/6 с перевитой метастазирующей карциномой легких Льюис выявлена способность спиртового экстракта плодов рябины обыкновенной тормозить рост первичной опухоли, метастазов и одновременно повышать противометастатическое действие цитостатика.

Список использованной литературы

1. Пат. 2023446 Российская Федерация, МПК А61K 35/78. Антиметастатическое средство [Текст] Яременко К.В., Дементьева Л.А., Саратиков А.С.: заявитель и патентообладатель: Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра РАМН (RU). - №4082815/14; заявл. 13.05.1993; опубл. 30.11.1994.

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М., 2014. - С. 130.

3. Государственная фармакопея СССР. Вып.2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. - 11-е изд., доп. М., 1989. С. 160-161; 323-325.

4. Коломиец Н.Э., Калинкина Г.И., Сапронова Н.Н. Стандартизация листьев крапивы двудомной // Фармация. - 2011. - №6. - С. 22-24.

5. Андреева В.Ю., Калинкина Г.И., Коломиец Н.Э. и др. Методика определения антоцианов в плодах аронии черноплодной // Фармация. - 2013. - №3. - С. 19-21.

6. Архипов С.А., Юнкер В.М. Изменение интенсивности метастазирования в легкие перевиваемых опухолей мышей в зависимости от величины перевивочной дозы опухолевых клеток // Исследование по индукции и метастазированию опухолей у экспериментальных животных. - Новосибирск, 1984. - С. 14-32.

7. Софьина З.П. и др. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США. - М.: Медицина, 1980. - С. 131.

8. Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. - Л.: Медицина, 1978. - С. 210-211.