СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ЖЕНСКОГО ЭНДОКРИННОГО БЕСПЛОДИЯ

Изобретение относится к медицине, а более конкретно к медицинской лабораторной диагностике, и может быть использовано в акушерстве и гинекологии.

Ранняя диагностика аномалий секреторной функции гонад, выражающаяся в нарушениях процессов овуляции, позволяет в значительной степени сократить количество бесплодных браков и улучшить демографическую ситуацию в популяции. Определение начальных признаков нарушений гормонального статуса и фертильности является актуальной проблемой современной медицины, поскольку естественная убыль населения только в России сегодня составляет около 1 млн. человек за три года.

Сегодня не вызывает сомнения и тот факт, что одним из главных факторов, ведущих к снижению рождаемости, является ухудшение репродуктивного здоровья женщин. Согласно данным ряда авторов за последние 10 лет число абсолютно здоровых с гинекологической точки зрения женщин снизилось до 6,3% от общего количества женщин детородного возраста (Кулаков В.И., Корнеева И.Е. Диагностика и лечение женского бесплодия // Практическая гинекология. / Под ред. В.И. Кулакова и В.Н. Прилепской. - М.: МЕДпресс-информ, 2001. - С. 298-317). Это приводит к тому, что около 20% пар, планирующих беременность, сталкивается с теми или иными проблемами, препятствующими зачатию.

Нарушение фертильности (бесплодие) диагностируется при неспособности женщины забеременеть в течение одного года активной половой жизни со здоровым мужчиной без применения контрацепции. Этиология женского бесплодия многообразна и, по мнению большинства авторов, на первое место выходят эндокринные нарушения. В некоторых случаях эти нарушения носят обратимый характер и поддаются коррекции, в других - требуют применения более радикальных методов, таких как ЭКО или суррогатное материнство.

Для прогнозирования бесплодия в настоящее время предложены различные биохимические и инструментальные методы диагностики.

Существует способ прогнозирования состояния фертильности у женщин репродуктивного возраста с миомой матки путем определения концентрации 2-гидроксиэстрона и 16α-гидроксиэстрона в моче, концентрацию прогестерона в сыворотке крови (Патент RU №2433411, G01N 33/74, 13.07.2009).

Сущность способа: в лютеиновую фазу менструального цикла определяют концентрации 2-гидроксиэстрона и 16α-гидроксиэстрона в моче, концентрацию прогестерона в сыворотке крови. Затем рассчитывают каноническую величину по формуле K=4,23-0,04×A+0,0016×B-0,18×C, где A - концентрация прогестерона в сыворотке крови на 20-21 дни менструального цикла (лютеиновая фаза) (нмоль/л), B - концентрация 2-гидроксиэстрона в моче (нмоль/л), C - концентрация 16α-гидроксиэстрона в моче (нмоль/л). При K больше -0,175 прогнозируют бесплодие, при K меньше -0,175 - сохранную фертильность. Использование способа повышает точность прогнозирования бесплодия и сохранной фертильности у женщин с миомой матки.

Недостатками данного способа являются возможность его применения у женщин с миомой матки, расчет показателей требует специальной математической подготовки и сложен в практическом применении. Метод привязан к лютеиновой фазе менструального цикла, что делает возможность его применения в очень ограниченный интервал времени (21-22 дни менструального цикла).

Еще одним способом для диагностики эндокринной формы бесплодия является допплерографический и ультразвуковой (Патент RU №2350272, A61B 8/00, 27.03.2009), который позволяет непосредственно отслеживать процессы овуляции.

Способ заключается в том, что проводят допплерографическое и ультразвуковое исследование до овуляции каждый день, начиная с седьмого дня цикла, с определением прироста эндометрия, доминантного фолликула и изменений показателей кровотока в аркуатных артериях матки и перифолликулярном кровотоке. Оценивают достижение размеров толщины эндометрия и доминантного фолликула, а также изменения показателей кровотока на 9, 11 день цикла и на момент овуляции с индивидуальным подбором гормональных препаратов. Проводят контрольное исследование через 7 и 14 дней после овуляции. Оценивают толщину эндометрия, размеры желтого тела, показатели кровотока в аркуатных артериях матки и желтом теле. Назначают индивидуальную гормональную терапию. Избирают дальнейшую тактику гормональной терапии при наличии или отсутствии беременности. Способ позволяет повысить точность диагностики нарушений овариально-менструального цикла у женщин, страдающих эндокринной формой бесплодия, и индивидуализировать подбор дозы гормональных препаратов за счет увеличения контролируемых параметров.

Недостатком способа является невозможность амбулаторного обследования, длительность исследования (поскольку даже у здоровых женщин по статистическим данным до 10% циклов могут быть ановуляторными), значительная дороговизна и субъективность в интерпретации данных УЗИ.

Известен также способ диагностики эндокринной формы бесплодия путем измерения реографических показателей ткани в течение менструального цикла (а.с. №1398821, A61B 5/02, 30.05.1988). Сущность способа заключается в том, что в канале шейки матки измеряют электрическое сопротивление биполярным датчиком (не описан авторами). При этом у женщин с нормальным менструальным циклом, при нанесении результатов измерения на циклограмму, выявлена четкая двухфазность полученной кривой, а у женщин с анавуляторным циклом графическое изображение отличалось не только своей величиной, но и отсутствием динамических изменений.

Недостатком данного способа является методическая сложность выполнения исследования и его травматичность для обследуемой женщины, невозможность динамического наблюдения, так как травмирование эпителия цервикального канала снижает диагностическую ценность показателей.

Существуют также известные общеклинические способы диагностики эндокринной формы бесплодия. Основным способом диагностики энодкринных нарушений является определение уровня половых гормонов в сыворотке крови (Карнищенко А.И. Медицинские лабораторные технологии и диагностика: справочник. Медицинские лабораторные технологии. - Санкт-Петербург: Интермедика, 1999. - 656 с.).

Показателями, по которым можно судить о гормональном статусе женщины, являются лютеинизирующий гормон (ЛГ), фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), пролактин, тестостерон, эстрадиол и дегидроэпиандростерон-сульфат (ДГЭА-сульфат).

Для определения гормональной регуляции менструального цикла проводится определение гормонов в крови строго по дням цикла.

3-5 день цикла: ЛГ ФСГ Пролактин

7-10 день цикла: Тестостерон Эстрадиол ДЭА-сульфат

20-21 день цикла: Эстрадиол Прогестерон

Все гормональные исследования сложны технологически и отличаются большой вариабельностью результатов из-за крайней лабильности регистрируемых показателей и длительности менструального цикла, на который могут влиять различные внешние и внутренние факторы - стресс, соматические острые и хронические заболевания и т.п.

Для оценки фертильности существуют так же различные функциональные тесты: кольпоцитологические, морфологические, биофизические. Они позволяют косвенно судить о характере гормональной секреции яичников (К.Н. Жмакин и др. Гинекологическая эндокринология, М., стр. 186., 1980) и процессов овуляции. Среди них наиболее распространены измерение базальной температуры, гистологические исследования влагалищных мазков и эндометрия, измерение вязкости цервикальной слизи.

Все эти тесты носят лишь ориентировочный характер и используются для формирования групп женщин для дальнейшего углубленного исследования. Выполнение этих исследований отличается инвазивностью, субъективной оценкой полученных результатов и, вследствие этого, относительно низкой точностью.

Анализ существующих способов диагностики эндокринного бесплодия показал, что ни один из них не может являться прототипом для способа, предлагаемого авторами.

Процессы овуляции, по последним данным (Gynecological Endocrinology 2011; 27 (1): 27-32 (doi: 10.3109/09513590.2010.493961) Elissavet Hatzi, Ioanna Bouba, Anna Galidi, Leandros Lazaros, Nectaria Xita, Prodromos Sakaloglou, Georgios Kolios, Eleni Bairaktari, Apostolos Kaponis et al.), регулируются в организме женщины кисспептином.

Гормон кисспептин («белок поцелуев»), кодируемый геном kiSS-1, был открыт в 1999 году. Было установлено, что это естественным образом вырабатываемое в организме вещество запускает процесс полового созревания в подростковом возрасте и в дальнейшем отвечает за регуляцию репродуктивной функции организма. Взаимодействие кисспептина и его клеточного рецептора GPR54 в гипоталамусе является определяющим фактором в активации нейронов, высвобождающих гонадолиберин, который, в свою очередь, управляет уровнем секреции ЛГ и ФСГ, от которых зависит возникновение овуляции и возможность зачатия. Система кисспептин/GPR54 активирует гипоталамо-гипофизарно-яичниковую систему, но механизмы этого влияния до конца не ясны (Ann Endocrinol (Paris). 2012 Nov; 73(5):448-58. doi: 10.1016 / j.ando. 2012.07.680. Epub 2012 Sep 20. «Overview of the impact of kisspeptin on reproductive function.)) Sonigo CI, Binart N.)

Задачей данного изобретения является определение первичного звена поражения репродуктивной системы женщины, а также оперативность, высокая точность исследования и упрощение процесса диагностики женского эндокринного бесплодия по сравнению с существующими.

Поставленная задача достигается тем, что у женщин репродуктивного возраста натощак из кубитальной вены, вне зависимости от фазы менструального цикла, берут 5-10 мл венозной крови и в полученной сыворотке определяют уровень кисспептина, при этом нормальным считают уровень 2,5÷12,0 нг/мл, а эндокринное бесплодие достоверно диагностируют при его значении ниже 1,7 нг/мл.

Способ, предложенный авторами, является пионерным, т.к. определение уровня гормона кисспептина как предикт эндокринного бесплодия до настоящего времени не проводилось.

На практике способ осуществляют следующим образом. Берут кровь у женщины натощак из кубитальной вены. Количество исследуемого материала 5-10 мл. Взятие крови у пациенток из группы исследования осуществляют вакуумным методом. На пробирке указывают ФИО, дату забора крови. Затем пробирки ставят на плоскую поверхность и оставляют на 20-30 минут до образования сгустка. В лаборатории проводят центрифугирование исследуемого материала при скорости 2000 об/мин в течение 10 минут. Полученную сыворотку помещают в пустую стерильную

пластмассовую пробирку. Сыворотку можно при необходимости заморозить при температуре -20 °C и хранить до 4-х месяцев.

Для определения кисспептина применяют Иммуноферментный анализ (сокращенно ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) - известный и широко применяемый лабораторный иммунологический метод качественного и количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала. Для исследования сыворотки крови на уровень кисспептина используют набор реагентов Кисспептин-54, метастин, 96 (Производство: ВСМ (Boots Contract Manufacturing, Великобритания); Метод: ELISA; Объем: 96; Кат.номер: S-1308) пептидная тест-система. Данный набор реагентов рассчитан на 96 определений.

Результат исследования - уровень кисспептина у пациентки из группы исследования известен в тот же день.

Т.к. кисспептин является генетически запрограмированым, то на его показатель не влияет день менструального цикла, что позволяет производить исследование однократно в любую фазу. Полученный результат считается достоверным.

Для обследования были отобраны группы женщин, у которых по классификации ВОЗ можно было подозревать бесплодие - отсутствие беременности после одного года регулярной половой жизни со здоровым партнером при исключении других причин бесплодия.

Для получения референтных диагностических концентраций уровня кисспептина в норме и при патологии были обследованы следующие группы женщин:

1. Женщины в возрасте 18-35 лет, имеющие детей, которые не имеют проблем с наступлением беременности, = 212 человек;

2. Женщины в возрасте 18-35 лет, имеющие детей, которые не могли забеременить более одного года при регулярной половой жизни со здоровым партнером и у которых были после комплексного обследования исключены все причины бесплодия, кроме эндокринного, = 171 человек;

3. Женщины в возрасте 18-35 лет, не имеющие детей, которые были после тщательного обследования отнесены в группу эндокринного бесплодия и проходили процедуру ЭКО, = 46 человек.

По результатам обследования были установлены референтные значения уровня кисспептина для диагностики эндокринного бесплодия, которые указаны в таблице:

В результате проведенного исследования сделаны выводы, что при концентрации кисспептина в сыворотке крови имеются следующие значения:

- 2,5-12 нг/мл - нормальное содержание;

- 1,7-2,5 нг/мл - умеренное снижение;

-<1,7 нг/мл - значительное снижение.

В зависимости от показателей кисспептина в сыворотки крови, можно сделать вывод об этиологии бесплодия у женщины. Преимуществом способа являются:

- определение первичного звена причины патологии эндокринного бесплодия;

- возможность диагностики в амбулаторных условиях;

- отсутствие привязки исследования к дням менструального цикла;

- невозможность получения ложноположительных или ложноотрицательных результатов на фоне влияния внешних и внутренних факторов на репродуктивную сферу из-за генетической детерминированности секреции кисспептина в организме женщины;

- простота методики: не требуется никаких дополнительных реагентов, специальных установок для забора крови и проведения иммуноферментного анализа (ИФА). Результат возможно получить пациентке и врачу в день исследования.

Этот способ позволяет быстро и достоверно определить причину бесплодия и провести дифференциальную диагностику между большим количеством причин эндокринного бесплодия.

Клинический пример 1:

Пациентка С., 33 лет. Обратилась с жалобами на отсутствие беременностей в течение 5 лет. Находится замужем в течение 15 лет, ведет регулярную половую жизнь с мужем, который, по заключению андрологического обследования, не имеет отклонений в функционировании репродуктивной сферы. Не предохраняется 5 лет, но ни разу за эти годы не была беременна. Из анамнеза С: менструации начались в 17 лет, не регулярные, длительностью 1-3 дня. Общие заболевания отрицает. Гинекологические заболевания отрицает. Туберкулезом, гепатитами не болела. Объективно: женщина астенической конституции, оволосение по женскому типу, молочные железы развиты слабо, узкий таз.

АД 100 и 60 мм рт.ст. Пульс 70 уд. в минуту.

Влагалищное исследование: Наружные половые органы развиты правильно, влагалище узкое. Шейка матки отклонена кзади, плотная, длиной 3 см. Матка не увеличена. Придатки не пальпируются с двух сторон. Своды глубокие, параметрии свободные.

Измерение ректальной температуры показало монофазную кривую, что подтверждает ановуляторный цикл. Анализ на ФСГ и ЛГ показал снижение их уровня независимо от фазы цикла.

Уровень кисспептина составил 1,43 нг/мл.

Клинический пример 2:

Женщина К., 30 лет. Жалоб нет. Находится замужем в течение 10 лет. Ведет регулярную половую жизнь. Имеет двоих детей.

Из анамнеза К.: месячные с 14 лет по 5 дней регулярные. Воспалительных заболеваний нет .Хронических соматических заболеваний нет. Гинекологические заболевания отрицает.

Первые роды срочные самопроизвольные, без особенностей. Родился мальчик 3430/55 см. Вторые роды через два года срочные самопроизвольные, без особенностей. Родился мальчик 3500/56 см. Оба ребенка здоровы.

Объективно: женщина нормального телосложения, оволосение по женскому типу. Молочные железы развиты правильно. АД 120 и 80 мм рт.ст. Пульс 65 уд. в минуту.

Влагалищное исследование: Наружные половые органы развиты правильно, влагалище узкое. Шейка матки отклонена кзади, плотная, длиной 3 см. Матка не увеличена. Придатки не пальпируются с двух сторон. Своды глубокие, параметрии свободные.

Анализ ФСГ и ЛГ показал их нормальное значение.

Уровень кисспептина у женщины составил 8,7 нг/мл.