СПОСОБ ОЦЕНКИ ВЛИЯНИЯ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА АКТИВНОСТЬ NAD-ЗАВИСИМОЙ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В СИНЦИТИОТРОФОБЛАСТЕ ВОРСИНОК ПЛАЦЕНТЫ НА ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ БЕРЕМЕННОСТИ

1. Цель изобретения - выявить характер влияния цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации на активность NAD-зависимой малатдегидрогеназы в синцитиотрофобласте плаценты, приводящей к нарушению энергетических процессов в фетоплацентарном барьере.

2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке гистохимического способа диагностики снижения активности одного из этапов цикла трикарбоновых кислот - NAD-зависимой малатдегидрогеназы, доказывающего нарушение процессов клеточного энергообмена в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты при обострении цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре беременности.

3. Раскрытие изобретения

Малатдегидрогеназа является ключевым ферментом цикла трикарбоновых кислот, катализирующим окислительно-восстановительную реакцию превращения малата в оксалоацетат [7, 8]. Цикл трикарбоновых кислот считается центральным метаболическим процессом, который объединяет углеводный, липидный и аминокислотный обмен. Благодаря ему происходит образование восстановительных эквивалентов, которые поступают в дыхательную цепь, при функционировании которой синтезируется АТФ. Особого внимания малатдегидрогеназа заслуживает как наиболее активный источник NADH и участник челночного цикла переноса восстановительных эквивалентов через мембраны митохондрий, непроницаемые для NADH.

Снижение активности этого фермента указывает на уменьшение интенсивности работы цикла трикарбоновых кислот и, соответственно, аэробных энергетических процессов [6] в плаценте, что, в свою очередь, влияет на рост и развитие плода.

4. Новая техническая задача

Определять уровень активности NAD-малатдегидрогеназы, свидетельствующий о характере течения цикла трикарбоновых кислот, при обострении цитомегаловирусной инфекции у беременных на третьем триместре гестации с целью диагностировать состояние фетоплацентарного барьера во время беременности, от чего зависит нормальное развитие плода.

5. В доступной литературе имеются упоминания о способе прогноза тяжести обострения атопической бронхиальной астмы по активности НАД-зависимой малатдегидрогеназы в лимфоцитах периферической крови [5], способе дифференциальной диагностики нарушений ритма сердца у детей [2] по активности НАД-зависимой малатдегидрогеназы в лимфоцитах периферической крови, способе определения активности малатдегидрогеназы в гомогенате биологических тканей [3]. Особенности функционирования NAD-зависимой малатдегидрогеназы изучаются при ишемии миокарда [4]. Все они выполняются биохимическими методами.

В отличие от вышеприведенных прототипов в данной работе имеются существенные отличия: 1. Объектом исследования является плацента. 2. Изменения активности NAD-зависимой малатдегидрогеназы происходят под влиянием обострения цитомегаловирусной инфекции во время беременности. 3. Оценка активности NAD-зависимой малатдегидрогеназы выполняется гистохимическим методом. Метод прост в исполнении, не требует дорогостоящих реактивов, обладает хорошей разрешающей способностью и может быть рекомендован в проведении научно-исследовательских работ и лабораторной диагностики.

6. Осуществление изобретения

6.1. Обследованы 25 беременных женщин 18-25 лет с обострением хронической цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации, контрольную группу составили 20 беременных женщин с хронической цитомегаловирусной инфекцией в латентной стадии. У беременных женщин симптоматически цитомегаловирусная инфекция проявлялась в виде острого респираторного заболевания, сопровождающегося ринофарингитом. Клинический диагноз (обострение хронической цитомегаловирусной инфекции) устанавливается по результатам комплексного исследования периферической крови на наличие ДНК цитомегаловируса (ЦМВ), JgM или увеличение титра антител JgG в парных сыворотках (в 4 раза и более) в динамике через 10 суток, а также индекса авидности (более 65%). Исследования проводят с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с участием человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в РФ, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г.

6.2. Верификацию ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекса авидности осуществляют методами ИФА на спектрофотометре «Stat Fax-2100» с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), ДНК ЦМВ выявляют методами ПНР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).

6.3. Активность малатдегидрогеназы гистохимически определяют на криостатных срезах свежезамороженной нефиксированной ткани плаценты следующим методом. Метод основан на восстановлении соли тетразолия в формазан электронами, акцептируемыми от субстрата через кофермент НАД [1]. Субстратом служит 0,1 М раствор натриевой соли яблочной кислоты (Sigma). Инкубационный раствор готовится на основе 0,1М фосфатного буфера рН 7,2-7,4 с добавлением нитросинего тетразолия фирмы «ICN Biomedicals» (США) в конечной концентрации 5 мМоль, НАД⁺ фирмы «Applichem» (Германия) - 1 мМоль, в присутствии ионов Mg²⁺ (ОДМ MgCl₂·6H₂O).

Состав инкубационной среды:

- 0,1 М фосфатный буфер рН 7,2-7,4 - 1 мл;

- нитросиний тетразолий - 1 мг;

- НАД⁺ - 1 мг;

- MgCl₂·6H₂O - 2 мг;

- натриевая соль яблочной кислоты - 17,8 мг.

6.4. В 1 мл инкубационного раствора помещают свежеприготовленные срезы ткани. Инкубацию проводят при 37°C в течение 30 минут. По окончании инкубации срезы промывают дистиллированной водой, фиксируют в 10%-м нейтральном формалине при комнатной температуре, вновь промывают дистиллированной водой, подсушивают и заключают в глицерин-желатин. Контрольные срезы инкубировали в среде, содержащей вместо раствора малата натрия адекватное количество фосфатного буфера. Полученные гистологические препараты изучают цитофотометрическим компьютерным методом с помощью программы Scion (США) на цифровом микроскопе МТ (Япония).

6.5. Статистический анализ и обработка данных проводится с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0». Характеристика вариационных рядов: средняя арифметическая (М), стандартная ошибка (m), коэффициент вариации 95%, доверительный интервал для средних значений М±m, где t определялось по таблице граничных значений критерия Стьюдента при доверительном уровне 95% и числе степеней свободы F=n₁+n₂-2. Для определения достоверности различий используется непарный параметрический критерий Стьюдента. Принимаются во внимание р<0,05; 0,01; 0,001. Для определения достоверности различий в случае негауссовых распределений - непараметрические критерии Колмогорова-Смирнова и Манна-Уитни.

7. Полученные данные

В процессе исследования получены следующие результаты. Гистохимическая реакция выявления активности NAD-зависимой малатдегидрогеназы является достаточно специфичной, так как в отсутствие субстрата в инкубационной среде выпадение гранул формазана в тканевых структурах не наблюдается. На гистохимических препаратах плаценты женщин, перенесших обострение хронической цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации, при регистрации роста титра антител класса G к цитомегаловирусу до 1:1600 отмечается снижение активности NAD-зависимой малатдегидрогеназы до 41,6±2,81 усл. ед. (контроль - 65,4±2,98 усл. ед.) (фигура 1, 2).

Таким образом, снижение активности малатдегидрогеназы при нарастании титра антител класса G к цитомегаловирусу 1:1600 указывает на нарушение энергообмена в синцитиотрофобласте плаценты, влияющего на рост и развитие плода.

На фигуре 2 изображена гистохимическая реакция на NAD-малатдегидрогеназу в плаценте женщины контрольной группы (не болевшей на всем протяжении гестации). Интенсивность гистохимической реакции - 65,4±2,98 усл. ед. Увеличение - 10×100.

На фигуре 1 изображена гистохимическая реакция на NAD-малатдегидрогеназу в плаценте женщины, перенесшей на третьем триместре гестации обострение цитомегаловирусной инфекции с титром антител класса G 1:1600. Отмечается снижение активности гистохимической реакции до 41,6±2,81 усл. ед. Увеличение - 10×100.

Литература

1. Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы: пер. с англ. М.: Мир, 1982, 272 с.

2. Мякишев Е.В., Савченко А.А., Манчук В.Т. Способ дифференциальной диагностики нарушений ритма сердца у детей. Патент №2270448 РФ. Опубл. 20.02.2006. Бюл. №5.

3. Пахомова В.А., Крюкова Г.И., Козлянина Н.П. Способ определения активности малатдегидрогеназы в биологических тканях. Патент А.С. 930122 СССР. МКИ G01 33/48. Опубл. 23.05.82. Бюл. №19. 2 с.

4. Сафонова О.А., Попова Т.Н., Артюхов В.Г., Матасова Л.В. Особенности функционирования цитоплазматической NAD-малатдегидрогеназы из миокарда крысы в условиях ишемии // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2005. №7. С. 31-34.

5. Собко Е.А., Булыгин Г.В., Камзалакова Н.И. Способ прогноза тяжести обострения атопической бронхиальной астмы. Патент №2190217 РФ. Опубл. 27.09.2002.

6. Daniš P., Farkas R. Hormone-dependent and hormone-independent control of metabolic and developmental functions of malate dehydrogenase - review // Endocrine regulations. 2009. Vol. 43. 39-52.

7. Minárik P., Tomaskova N., Kollárová M., Antalík M. Malate dehydrogenases-structure and function // Gen Physiol. Biophys. 2002. Vol. 21, №3. P. 257-265.

8. Musrati R.A., Kollárová M., Mernik N., Mikulásová D. Malate dehydrogenase: distribution, function and properties // Gen Physiol. Biophys. 1998. Vol. 17, №3. P. 193-210.