Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ПРОСТОЙ И БЫСТРОРАСТУЩЕЙ МИОМЫ МАТКИ С НОРМАЛЬНЫМ СТРОЕНИЕМ ЭНДОМЕТРИЯ

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторным методам исследования, и может быть использовано для диагностики простой (Сидорова И.С. Миома матки, МИА, М., 2003) и быстрорастущей миомы матки.

Актуальность проблемы миомы матки (ММ) заключается в том, что она является наиболее распространенной опухолью гениталий. Последние масштабные патологоанатомические исследования свидетельствуют о том, что распространенность ее может достигать 85% (Тихомиров А.Л., 2010).

Особое место занимает вопрос быстрорастущей миомы матки (БММ), что обусловлено высокой вероятностью ее выявления во всех возрастных периодах, возможностью сочетания с гиперплазией эндометрия, предраком с раком эндометрия, опухолями яичников, а также трансформацией в лейомиосаркому (Calleri L.F., 2000; Сидорова И.С. Миома матки, МИА, М., 2003; Лазарева Н.И. и соавт., 2003; Дикарева Л.В. Гиперпластические процессы матки: клинико-диагностическое значение маркеров биологических жидкостей. - Автореф. диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук, Волгоград, 2009). Актуальность проблемы БММ связана также с возникшей в последние годы тенденцией к позднему планированию беременности (после 35 лет), когда ММ является причиной репродуктивных неудач (Benecke С., Kruger T.F., Siebert T.I., Merwe J.P. van der, Steyn D.W. Effect of fibroids on fertility in patients undergoing assisted reproduction. A structured literature review // Gynecol. Obstet, Invest 2005. Vol. 59 (4). P. 225-230).

Настораживает и тот факт, что у женщин молодого возраста (20-30 лет) чаще встречается именно быстрорастущая, пролиферирующая ММ с наличием множественных узлов (Сидорова И.С., Унанян А.Л., Коган Е.А., Гуриев Т.Д. Миома матки у больных молодого возраста: клинико-патогенетические особенности // Акушерство, гинекология и репродукция, 2010, N1, с. 16-20).

Для дифференциальной диагностики БММ в практической медицине используется несколько методов.

Известен способ прогнозирования роста ММ, заключающийся в том, что в тканях миоматозных узлов, получаемых методом трансцервикальной пункционной биопсии, иммуногистохимическим методом предлагается определять плотность и интенсивность окрашивания рецепторов к прогестерону, и при увеличении этих показателей прогнозируется рост миомы в течение 12 месяцев (Ichimura T., Kawamura Ν., Ito F., Shibata S., Minakuchi К., Tsujimura Α., Umesaki Ν., Ogita S. Correlation between the growth of uterine leiomyomata and estrigen and progesterone receptors in needle biopsy speciments // Fértil. Steril. - 1998. - V. 70. - P. 967-971).

Данный способ имеет ряд недостатков:

- плохая воспроизводимость результатов в связи с погрешностями при приготовлении срезов, неоднородным по интенсивности окрашиванием тканей, особенностями микроскопии (Иммунологические методы [под ред. Х. Фримеля] // М.: Мир. - 1979. - 518 с.);

- инвазивность и травматичность;

Известен способ дифференциальной диагностики БММ, отличающийся тем, что в биоптате эндометрия определяют содержание эпидермального фактора роста и при его значении, равном 6 нг/мл и менее, диагностируют ложный рост ММ, а при значении более 6 нг/мл - истинный рост ММ (Патент №2258222. Способ дифференциальной диагностики быстрорастущей лейомиомы матки / Посисеева Л.В., Малышкина А.И., Красильникова А.К.. Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Перетятко Л.П. // Изобретения. Полезные модели. - 2005. - №22).

Однако этот способ имеет ряд недостатков:

- способ является инвазивным;

- забор эндометрия происходит при проведении гистероскопии в стационарных условиях, что требует госпитализации пациентки и использования дорогостоящего оборудования;

- способ трудоемок, так как для его осуществления требуется выделение обогащенной популяции мононуклеарных клеток из ткани эндометрия с последующим культивированием клеток в течение 24 часов, при этом для культуральных исследований необходимы дорогостоящие питательные среды и CO₂-инкубатор.

Известны также способы дифференциальной диагностики простой и БММ, заключающиеся в эхографическом исследовании гениталий (А.И. Гус с соавт. Современные принципы ультразвуковой, клинической и лабораторной диагностики синдрома поликистозных яичников // Гинекология, 2002, №2, стр. 44-47; Демидов В.Н., Гус А.И. Современные принципы ультразвуковой диагностики генитального эндометриоза // Гинекология, 2002, №2, стр. 48-52; Ашрафян Л.А. с соавт. Современные принципы первичной и уточняющей диагностики рака эндометрия // Практическая онкология, 2004, №1, стр. 16-24).

Недостатками этих способов являются:

- необходимость наличия соответствующего оборудования для ультразвуковой диагностики и специальных условий для проведения исследования;

- сложность интерпретации эхо-картин у больных с объемными процессами внутренних гениталий.

Известные способы дифференциальной диагностики простой и БММ основаны на особенностях эхографической картины, иммуногистохимическом исследовании ткани миоматозных узлов и эндометрия.

Заявленный способ дифференциальной диагностики простой и БММ с нормальным строением эндометрия основан на определении и сравнении содержания в биологических жидкостях (менструальных выделениях и эндометриальных смывах) маркеров апоптоза и пролиферации с помощью иммуноферментного метода и не имеет аналогов.

Изобретение направлено на повышение точности дифференциальной диагностики простой и БММ с нормальным строением эндометрия.

Указанный технический результат достигается тем, что в менструальных выделениях иммуноферментным методом определяют уровень лиганда, индуцирующего пролиферацию - APRIL, и уровень лиганда, индуцирующего апоптоз - TRAIL.

Поставленной задачей было создание такого способа дифференциальной диагностики простой и БММ, который позволил бы на малых объемах биологических жидкостей оценить характер патологических процессов. Это достигается тем, что для дифференциальной диагностики простой и БММ с нормальным строением эндометрия определяют уровень лиганда, индуцирующего пролиферацию - APRIL, и уровень лиганда, индуцирующего апоптоз - TRAIL.

Выбор менструальных выделений в качестве исследуемого субстрата у женщин связан с тем, что целый ряд ферментов способен накапливаться в апикальных отделах железистых клеток, выделяться в эндометриальную слизь и полость матки (Шварев Е.Г. Опухолевые маркеры в диагностике и оценке эффективности гормонотерапии рака эндометрия. - Автореф. диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук, Санкт-Петербург, 1993; Дикарева Л.В., Шварев Е.Г., Абжалилова А.Р., Тишкова О.Г., Уханова Ю.Ю. Диагностическое значение менструальных выделений при гинекологической патологии // Астраханский медицинский журнал, 2013, №3, стр. 12-17). Описанная иммуногистохимическая особенность позволяет использовать иммуноферментный анализ биологических жидкостей в оценке темпов роста ММ.

Способ осуществляют следующим образом. Уровень лиганда, индуцирующего пролиферацию - APRIL, в менструальных выделениях (MB) определяют методом иммуноферментного анализа наборами фирмы BENDER MEDSYSTEMS.

Стандарты, рабочие и промывочный буферы, конъюгаты и раствор субстрата готовят в соответствии с инструкцией. Дважды промывают лунки планшета, покрытые поликлональными антителами к APRIL человека.

Титрованием 100 мкл стандарта APRIL в 100 мкл рабочего буфера готовят последовательные двукратные разведения стандартных проб в соответствующих лунках планшета. В остальные лунки добавляют по 50 мкл рабочего буфера и по 50 мкл опытных проб. Во все лунки вносят по 50 мкл приготовленного раствора конъюгата биотина с поликлональными антителами к APRIL человека. Инкубируют планшет в течение 2 часов при комнатной температуре на шейкере ST 3 (Латвия). Промывают планшет не указанной выше технологии. Во все лунки вносят по 100 мкл конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена. Инкубируют планшет в течение часа при комнатной температуре на шейкере. Промывают планшет как указано выше. Во все лунки вносят по 100 мкл приготовленного раствора субстрата и инкубируют планшет 10-20 минут при комнатной температуре, защищая от света. Останавливают цветную реакцию добавлением 100 мкл 1 М фосфорной кислоты в каждую лунку. Измерение оптической плотности при 450 нм и обсчет результатов проводят на фотометре MULTILABEL COUNTER 1420 (Финляндия).

Уровень лиганда, индуцирующего апоптоз - TRAIL, в MB определяют методом иммуноферментного анализа наборами фирмы BENDER MEDSYSTEMS.

Стандарты, рабочие и промывочный буферы, конъюгаты и раствор субстрата готовят в соответствии с инструкцией к набору.

После двукратной промывки лунок 300 мкл буфера на 1 цикл промывки, вносят по 100 мкл рабочего буфера в лунки, предназначенные для стандартов. Добавляют по 100 мкл растворенного стандарта. Перемешивают содержимое лунок и готовят последовательные двукратные разведения стандартных проб в соответствующих лунках планшета. После приготовления биотинового конъюгата добавляют по 50 мкл готового биотинового конъюгата во все лунки.

Закрывают планшет пленкой и инкубируют 2 часа при комнатной температуре (18-25°С) на орбитальном шейкере, установленном на 100 об/мин. Затем полностью удаляют содержимое лунок аспирапией или декантированием (сливом). Промывают лунки 3 раза. После приготовления Стрептавидин-HRP вносят по 100 мкл готового Стрептавидин-HRP во все лунки. Закрывают планшет пленкой и инкубируют 1 час при комнатной температуре (18-25°С) на микропланшетном шейкере, установленном на 100 об/мин.

Снимают пленку. Полностью удаляют содержимое лунок аспирацией или декантированием (сливом). Промывают лунки 3 раза. Вносят по 100 мкл субстратного раствора тетраметил-бензидина (ТМБ) во все лунки. Инкубируют при комнатной температуре (18°-25°С) в темноте в течение приблизительно 20 минут. Добавляют по 100 мкл стоп-раствора во все лунки, чтобы полностью инактивировать фермент в лунках.

Измерение оптической плотности при длине волны 620 нм и обсчет результатов проводят на фотометре MULTILABEL COUNTER 1420 (Финляндия).

При уровне APRIL от 4,8 до 6,4 нг/мл и уровне TRAIL от 24,0 до 27,0 пг/мл диагностируют простую ММ, а при уровне APRIL от 11,1 до 14,7 нг/мл и уровне TRAIL от 20,0 до 22,5 пг/мл диагностируют БММ. В контрольной группе, в которую были включены здоровые женщины, уровень APRIL составляет от 3,0 до 4,8 нг/мл, TRAIL от 35,1 до 36,8 пг/мл.

Изложенная сущность изобретения поясняется таблицей 1.

Предлагаемый способ был успешно апробирован в гинекологических отделениях Александро-Мариинской областной клинической больницы Городского бюджетного учреждения здравоохранения Астраханской области «Клинический родильный дом», Городского бюджетного учреждения здравоохранения Астраханской области «Городская поликлиника №1» г. Астрахани в 2011-2013 гг.

Обследовано 111 женщин в возрасте от 18 до 49 лет. Все пациентки были разделены по нозологическому признаку (контрольная группа, простая ММ с нормальным строением эндометрия, БММ с нормальным строением эндометрия).

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример 1. Больная О., 41 год. Наблюдалась в женской консультации по поводу ММ миомы матки малых размеров - 5-6 недель - на протяжении 2-х лет. В течение последнего года стала отмечать обильные, нерегулярные менструации, продолжительностью 4-5 дней. В анамнезе 1 срочные роды без осложнений. Метод контрацепции - барьерный. При влагалищном исследовании: шейка цилиндрическая, без дефектов слизистой оболочки, матка увеличена соответственно 5-6 неделям беременности, плотная при пальпации, подвижная, безболезненная, придатки не пальпируются, своды свободные. По данным ультразвукового сканирования (УЗС): тело матки размерами 47×44×48 мм неоднородной структуры. Из передней стенки исходит интрамурально-субсерозный узел на широком основании размерами 10×20 мм, пониженной эхогенности, неоднородной структуры, из задней стенки исходит интрамуральный узел размерами 15×20 мм, пониженной эхогенности, неоднородной структуры. Полость матки не деформирована. М-эхо 7 мм. Правый яичник 40×31 мм, нормальной структуры, левый яичник отсутствует (левосторонняя аднексэктомия в 2006 г.).

Анализ крови: Hb - 104 г/л, эритроциты - 3,26×10 г/л, цветной показатель 0,8, лейкоциты - 3,7×109 г/л, эозинофилы - 5, сегментоядерные нейтрофилы - 62, моноциты - 7, лимфоциты - 26, СОЭ - 6 мм/ч.

Клинический диагноз: миома матки малых размеров.

18.03.2013 г. выполнена аспирация менструальных выделений из заднего свода влагалища с использованием зонда Пайпеля.

22.03.2013 г. выполнено раздельное диагностическое выскабливание стенок полости матки и цервикального канала.

Гистологическое исследование (получено 29.03.2013):

фрагменты эндометрия, соответствующие фазе пролиферации менструального цикла.

Морфологическое исследование супернатанта MB.

Способ забора материала: после осмотра женщины на зеркалах в асептических условиях зондом Пайпеля аспирировали MB из заднего свода влагалища. Полученную биологическую жидкость центрифугировали в течение 15 минут с частотой 3000 об/мин. Супернатант (надосадочную жидкость) MB, взятых зондом Пайпеля, использовали для проведения вышеуказанного исследования.

Заключение: при значении APRIL 5,67 нг/мл, TRAIL 25,83 пт/мл дифференцировали простую миому матки.

Пример 2. Больная З., 49 лет. Наблюдалась в женской консультации по поводу ММ небольших размеров - 6-7 недель - в течение 2 лет. В течение последнего года менструации стали более обильными, отмечен рост ММ до 12 недель беременности согласно данным УЗС и бимануального осмотра. В анамнезе 1 срочные роды без осложнений. Метод контрацепции - барьерный. При влагалищном исследовании: шейка цилиндрическая, без дефектов слизистой оболочки, матка увеличена соответственно 12-недельной беременности, плотная при пальпации, ограниченно подвижная, безболезненная, придатки не пальпируются, своды свободные.

По данным УЗС: тело матки размерами 70×77×63 мм неоднородной структуры. Из передней стенки исходят 2 интрамурально-субсерозных узла на широком основании размерами 32×34 мм, 30×27 мм, пониженной эхогенности, неоднородной структуры, из задней стенки исходит интрамуральный узел размерами 24×24 мм, пониженной эхогенности, неоднородной структуры, из дна матки - интрамурально-субсерозный узел 30×31 мм, пониженной эхогенности, неоднородной структуры. Полость матки не деформирована. М-эхо 11 мм. Правый яичник 31×28 мм, нормальной структуры, левый яичник 34×29 мм, нормальной структуры.

Анализ крови: Hb - 129 г/л, эритроциты - 3,9×10¹² г/л, цветной показатель 0,9, лейкоциты - 4,0×10⁹ г/л, эозинофилы - 1, сегментоядерные нейтрофилы - 67, моноциты - 7, лимфоциты - 25, СОЭ - 5 мм/ч.

09.03.2013 г. выполнена аспирация MB из заднего свода влагалища зондом Пайпеля.

13.03.2013 г. выполнена операция: лапаротомия, надвлагалищная ампутация матки без придатков.

Гистологическое исследование удаленного органа (получено 20.03.2013): узлы лейомиомы, эндометрий фазы пролиферации.

Морфологическое исследование супернатанта MB.

Забор и приготовление материала производился так же, как и в примере №1.

Заключение: при значении APRIL 12,31 нг/мл, TRAIL 21,3 пг/мл дифференцировали быстрорастущую миому матки. Статистическая обработка данных осуществлялась с использованием лицензионных пакетов Statistica 8.0, Microsoft Excel 2010.

Чувствительность метода определения APRIL составила 97,66% при специфичности 100%, чувствительность метода определения TRAIL составила 95,77% при 100% специфичности.

Применение предлагаемого способа позволяет повысить точность диагностики простой и БММ. Забор исследуемого материала технически прост, легко переносится больными, исключает риск развития частых и тяжелых осложнений, вызываемых травматизацией при диагностическом выскабливании. Атравматичность забора материала открывает широкую возможность проведения повторных анализов, что является необходимым условием для динамической оценки состояния ММ на фоне проводимого лечения.

Данный метод позволяет оценить темпы роста миомы матки, эффективность проводимой гормонотерапии, оптимизировать индивидуальный план ведения больных ММ и выбирать тактику ведения таких пациенток.