СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИМОХИНОНА МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

Изобретение относится к аналитической химии хинонов, в частности к способам определения тимохинона в семенах чернушки посевной (Nigella Saliva), масле и CO₂-экстрактах из ее же семян.

Тимохинон относится к группе хинонов. Тимохинон обладает тонизирующим действием, улучшает мозговую деятельность, успокаивает нервную систему. В целом это мощный антиоксидант, способствующий выведению свободных радикалов из организма человека, для количественного определения тимохинона используют различные виды хроматографии.

Известно определение тимохинона методом тонкослойной хроматографии на алюминиевых пластинках, с нанесенным силикагелем. Разделение проводили в стеклянной камере в восходящих потоках подвижной фазы толуол-циклогексан (8:2 по объему). Для количественного анализа использовали спектроденситометрическое сканирование при 254 нм. Предлагаемый способ обеспечил необходимую точность, в результате проверки метода получено значение переоткрывания тимохинона выше 95% [Velho-Pereira, R.M. Validated high performance thin-layer chromatographic method for the quantification of thimoquinone in Nigella Sativa extracts and formulations / R.M. Velho-Pereira, Ch.R. Barhate, S.R. Kulkarni, A.G. Jagtap // Phytochemical analysis. - 2011. - V. 22. - №4. - Р. 367-373].

Недостатки: использование в анализе высокотоксичного и пожароопасного толуола, требующего соблюдений особых условий безопасности при работе, длительность определения и повышенные требования к чистоте экстракта, получаемого из пробы растительного сырья, для обеспечения требуемой точности количественного анализа.

Известен быстрый способ изократической жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим детектором, разработанный для одновременного анализа принципиальных антиоксидантов из Nigella Sativa - тимохинон, карвакрол, тимол. Для разделения компонентов использована подвижная фаза вода-метанол 40-60% по объему, скорость потока через колонку 1,5 см³/мин. Количественный анализ осуществляли, используя в градуировках площадь пика анализируемого вещества, при 254 нм. Метод пригоден для количественного определения тимохинона, в том числе при наличии его продуктов деградации - карвакрола и тимола - потенциально ядовитых веществ [Hadad, G.M. High performance liquid chromatography quantification of principal antioxidants in black seed (Nigella Sativa L.) phytopharmaceuticals / G.M. Hadad, R.A. Salam, P.M. Soliman, M.K. Mesbah // J. AOAC. - 2012. - V. 95. - №4. - P. 1043-1047].

Недостатки: использование в анализе ядовитого метанола, последующая утилизация использованной подвижной фазы приводит к загрязнению окружающей среды. При анализе более сложных по составу проб происходит быстрое загрязнение разделяющей колонки и соответственно снижение точности анализа.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ количественного определения тимохинона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в экстрактах и маслах, с использованием фотометрического детектора, аналитической колонки Zorbax SB-C18, подвижной фазы вода-метанол-изопропанол в соотношении по объему 50:45:5 при скорости потока 1,5 см³/мин. Перед анализом масло растворяли в изопропаноле, фильтровали эмульсию через мелкопористый фильтр и дозировали в систему жидкостного хроматографа [Ghosheh, О.A. High performance liquid chromatographic analysis of the pharmacologically active quinones and related compounds in the oil of the black seed Nigella Sativa L. / O.A. Ghosheh, A.A. Houdi, P.A. Crooks // J. Pharm. Biomed. Anal. - 1999. - V. 19. - №5. - P. 757-762].

Недостатки: использование в анализе ядовитого метанола, упрощенный процесс подготовки пробы приводит к помехам в анализе из-за значительного содержания масляной фракции, что является причиной загрязнения аналитической колонки и, как следствие, снижения точности анализа.

Задачей изобретения является эффективное разделение и количественное определение тимохинона методом высокоэффективного капиллярного электрофореза, обеспечение достоверных результатов при минимальных затратах на пробоподготовку и выполнение анализа.

Техническим результатом при использовании предлагаемого изобретения является экспрессность и достоверность количественного определения тимохинона методом капиллярного электрофореза с применением нетоксичных и доступных реактивов для проведения анализа.

Технический результат достигают за счет того, что способ предусматривает экстракционное извлечение тимохинона из пробы, фильтрацию, центрифугирование экстракта и выполнение анализа на системе капиллярного электрофореза в кварцевом капилляре, эффективной длиной 0,5 м, внутренним диаметром 75 мкм, отличается тем, что в анализе используют водный ведущий электролит, содержащий 0,4% борной кислоты, 0,05% тетрабората натрия, 6% изопропанола, 6% этанола при положительной полярности напряжения и длине волны детектирования - 254 нм.

Способ отличается тем, что с целью обеспечения экспрессности и достоверности анализа используют водный раствор ведущего электролита, состоящий из тетрабората натрия, борной кислоты, изопропанола, этанола, а сам анализ осуществляют при положительной полярности напряжения при использовании кварцевого капилляра.

Поставленная задача решается за счет того, что предлагаемый состав ведущего электролита позволяет использовать упрощенный процесс подготовки пробы и обеспечить определение анализируемого компонента.

Преимущества заявляемого способа заключаются в использовании нетоксичных и доступных реактивов при осуществлении анализа на системах капиллярного электрофореза, оборудованных фотометрическим детектором, например, серии «Капель», обеспечении объективности и достоверности анализа реальных проб, стабильности во времени состава ведущего электролита и возможности анализа экстрактов с низким содержанием масляных фракций, благодаря наличию в составе водного электролита 12% смеси спиртов - этилового и изопропилового. При использовании изопропилового спирта следует обращать внимание на срок его хранения и степень загрязненности кротоновым альдегидом. Избыточное содержание кротонового альдегида (более 0,05% массовых) может искажать результаты количественного определения тимохинона.

Использование предлагаемой совокупности существенных признаков, изложенных в формуле изобретения, позволяет достичь желаемого технического результата - объективного и экспрессного определения массового содержания тимохинона как в градуировочных растворах, так и в пробах семян чернушки, масла из нее и углекислотных экстрактах семян.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1

Пробу воздушно-сухих семян чернушки посевной массой 1,00 г помещали в фарфоровую ступку и растирали до степени частичного повреждения оболочек. Затем добавляли 5 см³ 50%-ного водного раствора этанола и растирали семена до кашеобразного состояния. Далее добавляли еще 5 см³ 50%-ного этанола, перемешивали, настаивали в течение 1 часа, перемешивали, переносили в бюкс с крышкой, после отстоя смеси отбирали 2-3 см³ верхней фазы настоя, фильтровали, центрифугировали, разбавляли еще в 2-5 раз 50%-ным этанолом и подвергали анализу. Итоговое разбавление составляло 22-55 раз.

Анализ осуществляли в следующих условиях. Система капиллярного электрофореза с источником питания положительной полярности, например, серии «Капель», оборудованная фотометрическим детектором с установленной длиной волны 254 нм, кварцевым капилляром внутренним диаметром 75 мкм, эффективной длиной 0,5 м; положительное напряжение на капилляре 16 кВ; рекомендуется термостатирование капилляра при +25°C; ввод пробы - пневматический - 30 мбар в течение 10 секунд; время анализа - 10 мин. Для проведения анализа используют водный раствор ведущего электролита следующего состава: 0,4% борной кислоты, 0,05% тетрабората натрия, 6% изопропанола, 6% этанола. Срок хранения ведущего электролита не более 14 суток. Контролем служило определение тимохинона в этой же пробе, согласно способу-прототипу.

Пример 2

Анализ осуществляли в условиях согласно примеру 1, кроме того, что экстракционной подготовке подвергали масло из семян чернушки посевной. Экстракцию проводили следующим образом: к 5 см³ масла добавляли 2,5 см³ 50%-ного этанола, перемешивали, настаивали в течение 10 минут, отбирали спиртовую фазу в бюкс с крышкой. Процесс повторяли дважды, объединенный экстракт фильтровали, центрифугировали и подвергали анализу.

Пример 3

Аналогично примеру 2, кроме того, что экстракционной подготовке подвергали CO₂-экстракт из семян чернушки посевной.

Пример 4

Аналогично примеру 2, кроме того, что экстракционной подготовке подвергали масло из семян чернушки посевной, в которое предварительно вносили тимохинон из расчета увеличения его концентрации в 2 раза.

Электрофореграмма определения тимохинона в пробе масла из семян чернушки посевной согласно примеру 2 показана на фиг. 1, электрофореграмма стандартного раствора тимохинона - на фиг. 2.

Полученные результаты, характеризующие способ определения тимохинона, отражены в таблице.

Анализ полученных результатов показал, что:

в случае анализа семян Nigella Sativa предлагаемый способ и прототип обеспечили одинаковую точность при определении тимохинона, пример 1;

в случае анализа объектов согласно примеров 2 и 3 с более сложным составом: масло и углекислотный экстракт, получены заниженные данные для выполнения анализа согласно прототипу на 30-40%. Подвижная жидкая фаза способа-прототипа не обеспечивала устранение помехи в анализе сложных биологических объектов - масла и углекислотного экстракта. Искажение результатов определения тимохинона в масле согласно способу-прототипу связано с существенным загрязнением разделяющей колонки и соответственно ухудшением качества определения компонента;

проверка работоспособности и качества анализа предлагаемого способа определения тимохинона согласно примеру 4 показала его достоверность и получение результатов, превосходящих по своему качеству способ-прототип, - с добавкой анализируемого вещества получены данные количественного анализа, равные 98% ожидаемой концентрации, а для прототипа - 85%. Учитывая более высокое качество анализа методом капиллярного электрофореза и более простую подготовку пробы следует отметить, что это делает его более удобным при проведении массовых анализов.

При реализации предлагаемого способа получены количественные результаты определения массовой концентрации тимохинона, превосходящие по своему качеству прототип.