Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФУКОЗЫ И ФУКОЗОСОДЕРЖАЩИХ ГИДРОЛИЗАТОВ ИЗ БИОМАССЫ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ

Изобретение относится к биотехнологии фукозы и фукоолигосахаридов из растительного сырья и может быть использовано в пищевой, фармацевтической промышленности и ветеринарии.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ комплексной переработки бурых водорослей с получением индивидуальных биологически активных полисахаридов, таких как ламинаран, фукоидан, полиманнуронат, которые могут найти применение в медицине и косметологии [Патент RU №2003123744 А, 27.01.2005, Бюл. №3].

Недостатком данного способа является то, что он не позволяет получать ценный моносахарид фукозу и фукоолигосахариды, обладающие иммуностимулирующими, противоопухолевыми, пребиотическими свойствами и улучшающими репродуктивные функции живого организма.

Техническая задача изобретения заключается в разработке способа получения фукозы и фукозосодержащих гидролизатов из биомассы бурых водорослей с применением ферментного препарата фукозидазы, позволяющего получать целевой продукт из доступного сырья с высоким выходом.

Для решения технической задачи изобретения предложен способ получения фукозы и фукозосодержащих гидролизатов из биомассы бурых водорослей, характеризующийся тем, что для этого используют свежую, замороженную или сушеную бурую водоросль рода Fucus, сначала из биомассы бурых водорослей выделяют фукоидан, для чего измельченную свежую или замороженную бурую водоросль рода Fucus заливают 96% этанолом в соотношении 1:1, в случае использования измельченной сушеной бурой водоросли рода Fucus ее заливают 96% этанолом в соотношении 1:3, затем проводят экстракцию в течение 22 ч при 50°C, экстракт отделяют, затем обработанную водоросль экстрагируют 0,1 М раствором соляной кислоты при pH 2,0-2,5 в течение 16 ч при 25°C, экстракт концентрируют до 1/5 первоначального объема на ультрафильтрационной установке, нейтрализуют, упаривают и получают концентрат, содержащий полисахарид-1, представляющий собой смесь ламинарана и фукоидана, из которого затем 96% этанолом осаждают фукоидан (F1), после выделения F1 обработанную водоросль дважды экстрагируют горячей водой при pH 3,5-5,0 в течение 4 и 2,5 ч, экстракты объединяют и концентрируют на ультрафильтрационной установке, полученный концентрат упаривают и получают полисахарид-2, представляющий смесь ламинарана, фукоидана и полиманнуроновой кислоты, доводят pH концентрата до значения 2,0-2,5, выпавший осадок полиманнуроновой кислоты отделяют центрифугированием, супернатант нейтрализуют и 96% этанолом осаждают фукоидан (F2), осадок промывают этанолом и высушивают, обе фракции фукоидана F1 и F2 соединяют и растворяют в дистиллированной воде, раствор фукоидана подвергают диализу для удаления минеральных солей, после диализа фукоидан осаждают двумя объемами 96% этанола, осадок дважды промывают 96% этанолом, высушивают, для получения фукозы высушенный фукоидан растворяют в дистиллированной воде до концентрации 10% и проводят ферментативный гидролиз, для чего в раствор фукоидана вносят ферментный препарат фукозидазы в количестве из расчета 6 ед/г фукоидана и осуществляют гидролиз при pH 7,0 и температуре 30°C в течение 5 ч, полученную фукозу сушат на лиофильной сушилке, для получения фукозосодержащих гидролизатов высушенный фукоидан растворяют в дистиллированной воде до концентрации 10% и проводят ферментативный гидролиз, для чего в раствор фукоидана вносят ферментный препарат фукозидазы в количестве из расчета 6 ед/г фукоидана и осуществляют гидролиз при pH 7,0 и температуре 30°C в течение 2 ч, полученные фукозосодержащие гидролизаты сушат на лиофильной сушилке.

Технический результат заявляемого способа заключается в том, что он позволяет получить в чистом виде с высоким выходом ценные биологически активные вещества фукозу и фукоолигосахариды из дешевого растительного сырья - бурых водорослей.

Фукоза является уникальным углеводом, играющим ключевую роль в процессах молекулярного и клеточного узнавания у всех живых организмов. Фукоза составляет основную часть углеводной компоненты иммуноглобулинов и обладает иммуностимулирующими свойствами. Содержание фукозы в организме и ее метаболизм определяет уровень протекания многих жизненно-важных процессов в организме человека и животных, она оказывает положительное влияние на репродуктивную функцию млекопитающих. Фукоолигосахариды обладают пребиотическим действием и могут применяться для поддержания нормобиоценоза кишечника.

В чистом виде фукоза в природе не встречается. Наиболее известными источниками фукозы и фукоиданов являются водоросли родов Fucus, Laminaria и Chlorella. L-фукоза является основным моносахаридным остатком в полисахаридах, синтезируемых этими растениями. Однако технологии гидролиза фукоиданов и выделения препаратов чистой фукозы отсутствуют. Известные химические способы получения фукозы малоэффективны и экологически небезопасны. Альтернативными являются биотехнологические способы ее получения. Ферментативный способ гидролиза фукозосодержащих полисахаридов является наиболее перспективным. В связи с этим представляется актуальным разработка способа получения препаратов как чистой фукозы, так и богатых фукозой олигосахаридов.

Способ получения фукозы и фукозосодержащих гидролизатов из биомассы бурых водорослей осуществляют следующим образом.

Подготовка растительной ткани

Способ предусматривает использование свежей, замороженной или сушеной водоросли рода Fucus vesiculosis. Свежую, сушеную или замороженную водоросль измельчают до прохода через сито с диаметром пор 2 мм.

Измельченную биомассу свежей или замороженной водоросли в количестве 10 кг помещают в экстрактор и заливают 96% этанолом в соотношении 1:1, сушеную измельченную водоросль в соотношении 1:3 для удаления низкомолекулярных биологически активных веществ и липидов, выдерживают при температуре 50°C в течение 22 ч. Этанольный экстракт сливают, этанол отгоняют, получают концентрат биологически активных низкомолекулярных соединений. Отгон этанола используют повторно.

Экстракция фукоидана раствором соляной кислоты

Обработанную водоросль высушивают на воздухе, заливают 0,1 М раствором соляной кислоты и экстрагируют 12 ч при 25°C в течение 2 ч при перемешивании. Затем экстракт концентрируют до 1/5 первоначального объема на ультрафильтрационной установке с мембраной, имеющей поры 5 кДа, нейтрализуют раствором гидроксида натрия и упаривают на роторном испарителе до объема 0,5 л.

Осаждение фукоидана

Полученный концентрат - полисахарид-1, представляющий собой смесь ламинарана и фукоидана, нейтрализуют до pH 7,0 и осаждают из него двумя объемами 96% этанола фукоидан (F1). Осадок дважды промывают 96% этанолом, высушивают на воздухе.

Экстракция фукоидана горячей водой.

Биомассу водоросли последовательно дважды экстрагируют горячей водой при перемешивании в течение 3 и 1,5 ч при pH 4,0. Экстракты объединяют, концентрируют до 1/10 первоначального объема на ультрафильтрационной установке с мембраной, имеющей поры 15 кДа, и упаривают до объема 0,5 л. Кислотность полученного концентрата - полисахарида-2, представляющего собой смесь ламинарана, фукоидана и полиманнуроновой кислоты, доводят до pH 2,5, отделяют осадок полиманнуроновой кислоты центрифугированием.

Осаждение фукоидана

Супернатант, образовавшийся после осаждения полиманнуроновой кислоты, нейтрализуют до pH 7,0 и осаждают из него фукоидан (F2) добавлением двух объемов 96% этанола, осадок дважды промывают 96% этанолом, высушивают.

Ферментативный гидролиз фукоидана

Для получения фукозы высушенный фукоидан растворяют в дистиллированной воде и проводят ферментативный гидролиз 10% раствора фукоидана, для чего в раствор фукоидана вносят ферментный препарат фукозидазы в количестве из расчета 6 ед/г фукоидана и осуществляют гидролиз при pH 7,0 и температуре 30°C в течение 5 ч, затем полученную фукозу сушат на лиофильной сушилке до влажности 7%.

Для получения фукозосодержащих гидролизатов высушенный фукоидан растворяют в дистиллированной воде и проводят ферментативный гидролиз 10% раствора фукоидана, для чего в раствор фукоидана вносят ферментный препарат фукозидазы в количестве из расчета 6 ед/г фукоидана и осуществляют гидролиз при pH 7,0 и температуре 30°C в течение 2 ч, затем полученные фукозосодержащие гидролизаты сушат на лиофильной сушилке до влажности 7%.

Способ получения фукозы и фукозосодержащих гидролизатов поясняется следующими примерами.

Пример 1. Для получения фукозы свежую водоросль Fucus vesiculosis измельчают до прохода через сито с диаметром пор 2 мм. Измельченную биомассу водоросли помещают в экстрактор и заливают этанолом в соотношении 1:1 по массе. Выдерживают при температуре 50°C 24 ч. Этанольный экстракт сливают, этанол отгоняют на вакуумном циркуляционном выпарном аппарате, получают концентрат биологически активных низкомолекулярных соединений. Отгон этанола используют повторно.

Обработанную водоросль высушивают на воздухе, 1 кг высушенной водоросли заливают 0,1 М раствором соляной кислоты до образования «зеркала» и экстрагируют 16 ч при 25°C при перемешивании. Экстракт концентрируют до 1/5 первоначального объема на ультрафильтрационной установке с мембраной, имеющей поры 5 кДа, и упаривают на роторном испарителе до 1 л.

Полученный концентрат - полисахарид-1, представляющий смесь ламинарана и фукоидана, нейтрализуют и осаждают двумя объемами этанола фукоидан (F1). Осадок дважды промывают 96% этанолом, высушивают на воздухе.

Остаток водоросли последовательно дважды экстрагируют горячей водой при перемешивании в течение 4 и 2,5 ч соответственно при pH 3,5. Экстракты объединяют, концентрируют до 1/10 первоначального объема на ультрафильтрационной установке с мембраной, имеющей поры 15 кДа, и упаривают до объема 1 л.

Полученный концентрат - полисахарид-2, представляющий собой смесь ламинарана, фукоидана и полиманнуроновой кислоты. Доводят кислотность экстракта до pH 2,0 и отделяют осадок полиманнуроновой кислоты центрифугированием.

Супернатант, образовавшийся после осаждения полиманнуроновой кислоты, нейтрализуют до pH 7,0 и осаждают фукоидан (F2) добавлением двух объемов этанола, осадок дважды промывают 96% этанолом, высушивают.

Обе фракции фукоидана F1 и F2 растворяют в дистиллированной воде до достижения концентрации фукоидана 10%. Полученный раствор фукоидана подвергают диализу против проточной воды для удаления минеральных солей. После диализа фукоидан переосаждают двумя объемами этанола, осадок дважды промывают 96% этанолом, высушивают.

Высушенный фукоидан растворяют в дистиллированной воде до достижения концентрации фукоидана 10% и проводят ферментативный гидролиз полученного раствора фукоидана с целью выделения из него фукозы, для чего в раствор фукоидана вносят ферментный препарат фукозидазы в количестве из расчета 6 ед/г фукоидана и осуществляют гидролиз при pH 7,0 и температуре 30°C в течение 5 ч, затем полученную фукозу сушат на лиофильной сушилке до влажности 7%. Выход свободной фукозы к массе фукоидана составляет 83,5-85%, выход фукозы к массе воздушно-сухой водоросли составляет 4,4-4,6%.

Пример 2. Для получения фукозосодержащих гидролизатов свежую водоросль Fucus vesiculosis измельчают до прохода через сито с диаметром пор 2 мм. Измельченную биомассу водоросли помещают в экстрактор и заливают этанолом в соотношении 1:1 по массе. Выдерживают при температуре 50°C 24 ч. Этанольный экстракт сливают, этанол отгоняют на вакуумном циркуляционном выпарном аппарате, получают концентрат биологически активных низкомолекулярных соединений. Отгон этанола используют повторно.

Обработанную водоросль высушивают на воздухе, 1 кг высушенной водоросли заливают 0,1 М раствором соляной кислоты до образования «зеркала» и экстрагируют 16 ч при 25°C при перемешивании. Экстракт концентрируют до 1/5 первоначального объема на ультрафильтрационной установке с мембраной, имеющей поры 5 кДа, и упаривают на роторном испарителе до 1 л.

Полученный концентрат - полисахарид-1, представляющий смесь ламинарана и фукоидана, нейтрализуют и осаждают двумя объемами этанола фукоидан (F1). Осадок дважды промывают 96% этанолом, высушивают на воздухе.

Остаток водоросли последовательно дважды экстрагируют горячей водой при перемешивании в течение 4 и 2,5 ч соответственно при pH 3,5. Экстракты объединяют, концентрируют до 1/10 первоначального объема на ультрафильтрационной установке с мембраной, имеющей поры 15 кДа, и упаривают до объема 1 л.

Полученный концентрат - полисахарид-2, представляющий собой смесь ламинарана, фукоидана и полиманнуроновой кислоты. Доводят кислотность экстракта до pH 2,0 и отделяют осадок полиманнуроновой кислоты центрифугированием.

Супернатант, образовавшийся после осаждения полиманнуроновой кислоты, нейтрализуют до pH 7,0 и осаждают фукоидан (F2) добавлением двух объемов этанола, осадок дважды промывают 96% этанолом, высушивают.

Обе фракции фукоидана F1 и F2 растворяют в дистиллированной воде до достижения концентрации фукоидана 10%. Полученный раствор фукоидана подвергают диализу против проточной воды для удаления минеральных солей. После диализа фукоидан переосаждают двумя объемами этанола, осадок дважды промывают 96% этанолом, высушивают.

Высушенный фукоидан растворяют в дистиллированной воде до достижения концентрации фукоидана 10% и проводят ферментативный гидролиз полученного раствора фукоидана с целью выделения из него фукозосодержащих гидролизатов, для чего в раствор фукоидана вносят ферментный препарат фукозидазы в количестве из расчета 6 ед/г фукоидана и осуществляют гидролиз при pH 7,0 и температуре 30°C в течение 2 ч, затем полученные фукозосодержащие гидролизаты сушат на лиофильной сушилке до влажности 7%. Выход фукозосодержащих гидролизатов к массе воздушно-сухой водоросли составляет 5,7-6,0%.

Полученные побочные препараты ламинарана и полиманнуроната могут найти применение в медицине и парфюмерно-косметической промышленности.

Предложенный способ получения фукозы и фукозосодержащих гидролизатов из биомассы бурых водорослей позволяет:

- получать фукозу в чистом виде для нужд пищевой, косметической, фармацевтической промышленности и ветеринарии;

- увеличить выход фукозы к массе воздушно-сухой водоросли до 4,4-4,6%;

- снизить себестоимость фукозы по сравнению с существующими аналогами;

- получать фукозосодержащие гидролизаты для нужд пищевой и кормовой промышленности.