ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, РАССТРОЙСТВ ИЛИ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ ЛЕГКИХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПЛАЦЕНТАРНЫХ КЛЕТОК

Для данной заявки испрашивается приоритет по предварительной заявке США № 61/117004, поданной 21-го ноября 2008 года, полное описание которой, таким образом, включено в настоящий документ посредством ссылки.

1. ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится к способам и композициям для применения плацентарных клеток для лечения индивидуумов, имеющих заболевание, расстройство или патологическое состояние легких. В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание, расстройство или патологическое состояние вызваны или связаны с нежелательным или неблагоприятным иммунным ответом.

2. ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Заболевания легких занимают третье место среди причин смертности в Америке, отвечая за одну из шести смертей. Заболевания легких и другие дыхательные проблемы представляют собой одну из лидирующих причин смертности детей младше года. На сегодняшний день более 35 миллионов американцев живут с хроническими заболеваниями легких, такими как астма и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), известная также как эмфизема и хронический бронхит. (Данные веб-сайта Американской легочной ассоциации, http://www.lungusa.org/site/c.dvLUK9O0E/b.33316/ от 21-го ноября 2008 года). Существует недостаток эффективных методов лечения заболеваний легких, и срочно необходимы новые методы.

3. КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам и композициям для лечения, контроля, улучшения состояния или предупреждения заболеваний, расстройств и/или патологических состояний легких, включающим в себя введение плацентарных клеток или клеток пуповины нуждающемуся в этом индивидууму. В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание, расстройство или патологическое состояние ассоциированы с иммунным ответом или вызваны иммунным ответом, например, ассоциированы с воспалением, являются результатом воспаления или вызваны им. В некоторых вариантах осуществления изобретения плацентарные клетки или пуповинные клетки представляют собой прикрепленные к пластику для культивирования тканей, нетрофобластные мультипотентные клетки, именуемые в настоящем описании плацентарными стволовыми клетками, которые подробно описаны ниже в разделе 4.2.

В одном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения индивидуума, который имеет легочное заболевание, расстройство или патологическое состояние (предположительно имеет, либо имеет риск их развития), включающему в себя введение индивидууму плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, или кондиционной среды от плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, в результате которого возникает детектируемое улучшение одного или нескольких симптомов или замедляется развитие одного или нескольких симптомов указанного заболевания, расстройства или патологического состояния. В конкретном варианте осуществления изобретения указанное заболевание, расстройство или патологическое состояние вызвано иммунным ответом, например, воспалением. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанное заболевание, расстройство или патологическое состояние имеет дополнительную причину помимо иммунного ответа, например, воспаления. В конкретном варианте осуществления изобретения указанное заболевание, расстройство или патологическое состояние имеет причину, отличную от иммунного ответа, например, воспаления.

В конкретном варианте осуществления изобретения указанным легочным заболеванием, расстройством или патологическим состоянием является острое повреждение легких. В более конкретных вариантах осуществления изобретения указанное острое повреждение легких представляет собой одно или несколько из: физической травмы, химического поражения, например, химического ожога, вдыхания дыма или воздействия токсичного вещества. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанное легочное заболевание, расстройство или патологическое состояние представляет собой повреждение, вызванное неопластическим или паранеопластическим заболеванием.

В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание, расстройство или патологическое состояние является одним или несколькими из фиброзной болезни легких, острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС), хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), эмфиземы, астмы, вирусной или бактериальной инфекции легких, пневмонии (включая пневмонию, вызванную действием химического агента) или кистозный фиброз. В конкретном варианте осуществления изобретения фиброзной болезнью легких является интерстициальная болезнь легких (диффузная паренхиматозная болезнь легких). В более конкретных вариантах осуществления изобретения интерстициальной болезнью легких является силикоз, асбестоз, бериллиоз, системный склероз, полимиозит или дерматомиозит. В других более конкретных вариантах осуществления изобретения интерстициальная болезнь легких вызвана антибиотиком, химиотерапевтическим соединением, противоаритмическим соединением или инфекцией.

В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание, расстройство или патологическое состояние легких ассоциировано с или вызвано неблагоприятным, разрушительным, несоответствующим или нежелательным иммунным ответом, например, воспалением, причем указанное заболевание, расстройство или патологическое состояние затрагивают легкие или их симптомы проявляются в легких. В конкретных вариантах осуществления изобретения указанное заболевание, расстройство или патологическое состояние представляет собой один или несколько типов волчанки, например, волчаночный эритематоз, склеродерму, или ревматологическое заболевание (например, ревматоидный артрит).

В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанное заболевание, расстройство или патологическое состояние является ревматоидной болезнью легких (РБЛ), например, ревматоидной болезнью легких, ассоциированной с ревматоидным артритом. В другом конкретном варианте осуществления изобретения введение является достаточным для того, чтобы вызывать детектируемое улучшение одного или нескольких симптомов РБЛ, или достаточным для того, чтобы заметно снизить или замедлить развитие одного или нескольких симптомов РБЛ, например, в легких индивидуума. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанным симптомом РБЛ является состояние, сопутствующее РБЛ. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанным состоянием, сопутствующим РБЛ, является инфекция, например, вирусная инфекция легких, или фиброз легких (например, как следствие лечения метотрексатом).

В другом конкретном варианте осуществления способа лечения плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки, модифицированы с помощью генной инженерии для экспрессии слитого белка, включающего в себя IL-1Ra и DHFR.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения заболеванием, расстройством или патологическим состоянием является волчаночный эритематоз, например, системный волчаночный эритематоз (СВЭ). В более конкретном варианте осуществления изобретения указанным симптомом волчаночного эритематоза является один или несколько симптомов из легочного и/или плеврального воспаления, плеврита, плевральной эффузии, волчаночного пневмонита или хронической диффузной интерстициальной болезни легких.

В другом конкретном варианте осуществления любого из упомянутых способов, способ включает в себя введение индивидууму с заболеванием, расстройством или патологическим состоянием второго терапевтического агента. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанным вторым терапевтическим агентом является противовоспалительный агент, иммуномодулирующий агент, иммуносупрессирующий агент, обезболивающее средство или антибиотик. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанным вторым терапевтическим агентом является иммуномодулирующий агент. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения вторым агентом является анти-CD3 антитело (например, ОКТ3, мурономаб), антитело к рецептору IL-2 (например, базиликсимаб (СИМУЛЕКТ®) и даклизумаб (ЗЕНАПАКС®)), антитело к Т-клеточному рецептору (например, Муромонаб-CD3), азатиоприн, ингибитор кальциневрина, кортикостероид, циклоспорин, метотрексат, меркаптопурин, микофенолат мофетил, такролимус или сиролимус. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения второй терапевтический агент содержит стволовую клетку другого типа, например, мезенхимную клетку костного мозга, костный мозг или гематопоэтическую стволовую клетку.

В некоторых вариантах осуществления изобретения плацентарные клетки являются фибробластоидными, прикрепленными к пластику для культивирования тканей, и обладают способностью дифференцироваться в клетки, имеющие одну или несколько характеристик остеогенной клетки, хондрогенной клетки или нейрогенной клетки, могут реплицироваться 10-40 раз в культуре и/или имеют отличительные клеточные маркеры, описанные в настоящем документе. В конкретном варианте осуществления изобретения плацентарными клетками являются плацентарные стволовые клетки или мультипотентные плацентарные клетки.

В конкретном варианте осуществления изобретения плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки, являются CD10⁺, CD34^-, CD105⁺. В другом варианте осуществления изобретения плацентарные клетки дополнительно являются CD200⁺. В еще одном варианте осуществления изобретения плацентарные клетки являются CD10⁺, CD34^-, CD105⁺ и, имеют, по меньшей мере, одну из следующих характеристик: CD200⁺, CD44⁺, CD45^-, CD90⁺, CD117^-, CD133^-, KDR^-, CD80^-, CD86^-, HLA-ABC⁺, HLA-DR^- или PDL⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения плацентарные клетки экспрессируют CD200 и HLA-G, или экспрессируют CD73, CD105 и CD200, или экспрессируют CD200 и OCT-4 (также известный как Октамер-4; октамер-связывающий белок 4; POU5F1), или экспрессируют CD73, CD105 и HLA-G, или экспрессируют CD73 и CD105 и способствуют образованию одного или нескольких эмбрионоподобных тел в популяции плацентарных клеток, включающей в себя указанную стволовую клетку, при культивировании указанной популяции в условиях, позволяющих образование эмбрионоподобных тел, или экспрессируют OCT-4 и способствуют образованию одного или нескольких эмбрионоподобных тел в популяции плацентарных клеток, включающей в себя указанную стволовую клетку, при культивировании указанной популяции в условиях, позволяющих образование эмбрионоподобных тел. В более конкретном варианте осуществления изобретения плацентарные клетки подавляют активность иммунной клетки, например, подавляют пролиферацию Т-клеток, например, CD4⁺ T-клеток или CD8⁺ T-клеток.

Плацентарные клетки, плацентарные стволовые клетки или кондиционную среду от плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, можно вводить однократной дозой или несколькими дозами. При введении несколькими дозами, дозировки могут представлять собой часть терапевтической схемы, направленной на уменьшение одного или нескольких острых симптомов заболевания, расстройства или патологического состояния, причем заболевание, расстройство или патологическое состояние вызвано или ассоциировано с несоответствующим или нежелательным иммунным ответом, или могут являться частью длительной терапевтической схемы, направленной на предупреждение или снижение тяжести хронического течения такого заболевания, расстройства или патологического состояния. При введении второго терапевтического агента введение двух агентов можно осуществлять одновременно или последовательно.

3.1 ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Используемый в настоящем описании термин «SH2» относится к антителу, которое связывает эпитоп на маркере CD105. Поэтому, клетки, именуемые SH2⁺, представляют собой CD105⁺.

Используемые в настоящем описании термины «SH3» и «SH4» относятся к антителам, которые связывают эпитопы, присутствующие на маркере CD73. Поэтому, клетки, именуемые SH3⁺ и/или SH4⁺, представляют собой CD73⁺.

Используемый в настоящем описании термин «выделенная клетка», например, выделенная стволовая клетка, означает клетку, которая по существу отделена от других клеток ткани, например, плаценты или пуповины, из которой получена клетка, например, стволовая клетка. Клетка считается «выделенной», если от клетки удалены, по меньшей мере, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или, по меньшей мере, 99% клеток, с которыми клетка ассоциирована в природе, например, в ходе сбора или культивирования клетки.

Используемый в настоящем описании термин «выделенная популяция клеток» означает популяцию клеток, которые по существу отделены от других клеток ткани, например, плаценты, из которой получена популяция клеток. Популяция, например, стволовых клеток считается «выделенной», если от популяции стволовых клеток удалены, по меньшей мере, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или, по меньшей мере, 99% клеток, с которыми популяция стволовых клеток ассоциирована в природе, например, в ходе сбора или культивирования популяции стволовых клеток.

Используемый в настоящем описании термин «плацентарная стволовая клетка» относится к стволовой клетке или клетке-предшественнику, которые получены из плаценты или пуповины млекопитающих, вне зависимости от морфологии, маркеров клеточной поверхности или числа пассажей после первичной культуры, которые прикрепляются к субстрату для культивирования тканей (например, пластику для культивирования тканей или покрытому фибронектином планшету для культивирования тканей). В этом контексте термин «полученный» включает первично выделенные плацентарные стволовые клетки или плацентарные стволовые клетки, размноженные в культуре. Однако используемый в настоящем описании термин «плацентарная стволовая клетка» не относится к трофобласту, цитотрофобласту, эмбриональной зародышевой клетке или эмбриональной стволовой клетке, как эти клетки понимаются опытными специалистами в данной области. В одном варианте осуществления изобретения плацентарная стволовая клетка представляет собой мультипотентную клетку, полученную из плаценты млекопитающего, которая прикрепляется к субстрату для культивирования тканей, например, пластику для культивирования тканей.

Используемый в настоящем описании термин «плацентарные клетки» включает клетки, полученные из плаценты, и клетки, полученные из пуповины.

Используемый в настоящем описании термин «пуповинные стволовые клетки» относится к стволовой клетке или клетке-предшественнику, которые получены из пуповины млекопитающего, вне зависимости от морфологии, маркеров клеточной поверхности или числа пассажей после первичной культуры, которые прикрепляются к субстрату для культивирования тканей (например, пластику для культивирования тканей или покрытому фибронектином планшету для культивирования тканей). В одном варианте осуществления изобретения пуповинная стволовая клетка представляет собой мультипотентную клетку, полученную из пуповины млекопитающего, которая прикрепляется к субстрату для культивирования тканей, например, пластику для культивирования тканей.

Клетка считается «стволовой клеткой», если она сохраняет, по меньшей мере, один признак стволовой клетки, например, профиль экспрессии маркеров или генов, ассоциированный с одним или несколькими типами стволовых клеток; способность реплицироваться, по меньшей мере, 10-40 раз в культуре; мультипотентность, например, способность дифференцироваться либо in vitro, либо in vivo, или in vitro и in vivo, в, по меньшей мере, ряд типов клеток организма, например, одного или нескольких из трех зародышевых листков - эндодермы, мезодермы или эктодермы; отсутствие характеристик зрелой (т.е., дифференцированной) клетки и т.п. Термины «плацентарная стволовая клетка» и «полученная из плаценты стволовая клетка» можно использовать взаимозаменяемо. Описанные в настоящем документе плацентарные стволовые клетки в некоторых вариантах осуществления изобретения являются мультипотентными in vitro (то есть клетки дифференцируются in vitro при условиях, обеспечивающих дифференцировку), мультипотентными in vivo (то есть клетки дифференцируются in vivo при условиях, обеспечивающих дифференцировку) или мультипотентными in vitro и in vivo.

Используемая в настоящем изобретении клетка, например, стволовая клетка, является «положительной» по конкретному маркеру, когда этот маркер можно детектировать. Например, плацентарная стволовая клетка является положительной, например, по CD73, поскольку CD73 можно детектировать на плацентарных стволовых клетках в количестве, значительно превышающем фоновый уровень (по сравнению, например, с изотипным контролем). Клетка также является положительной по маркеру, когда маркер можно использовать для того, чтобы отличить клетку от, по меньшей мере, одного другого типа клеток, или его присутствие или его экспрессию клеткой можно использовать для отделения или выделения клетки. Маркеры, экспрессируемые на клеточной поверхности, можно, например, детектировать с помощью клеточного сортинга, такого как проточная цитометрия. Также маркеры можно детектировать, например, используя микроматрицы нуклеиновых кислот или ПЦР в реальном времени.

Используемые в настоящем описании термины «иммуномодулирование» и «иммуномодулирующий» означает индукцию или способность индуцировать детектируемое изменение иммунного ответа.

Используемые в настоящем описании «иммуносупрессия» и «иммуносупрессирующий» означает индукцию или способность индуцировать детектируемое снижение иммунного ответа и способность индуцировать детектируемую супрессию иммунного ответа.

4. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума, который имеет легочное (или влияющее на легкие) заболевание, расстройство или патологическое состояние (предположительно имеет, либо имеет риск их развития), включающему в себя введение индивидууму терапевтически эффективного количества плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, или кондиционной среды от плацентарных клеток, пуповинных клеток, например, пуповинных стволовых клеток, и/или кондиционной среды от пуповинных клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание, расстройство или патологическое состояние легких ассоциировано , возникает в результате или связано с несоответствующим, нежелательным, неблагоприятным или разрушительным иммунным ответом, например, аутоиммунным заболеванием. Ниже приведено подробное обсуждение способов лечения таких индивидуумов и способов введения таких стволовых клеток.

4.1 ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, РАССТРОЙСТВ ИЛИ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ ЛЕГКИХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПЛАЦЕНТАРНЫХ КЛЕТОК

Настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума, который имеет легочное (или влияющее на легкие) заболевание, расстройство или патологическое состояние (предположительно имеет, либо имеет риск их развития), включающему в себя введение индивидууму терапевтически эффективного количества пуповинных клеток, например, пуповинных стволовых клеток, или кондиционной среды от плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, или кондиционной среды от плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, причем терапевтически эффективное количество вызывает детектируемое улучшение одного или нескольких симптомов, или замедление развития одного или нескольких симптомов указанного заболевания, расстройства или патологического состояния. Также настоящее изобретение относится к применению некоторых плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, в изготовлении лекарственного средства для лечения, контроля, улучшения состояния или предупреждения заболеваний, расстройств и/или патологических состояний легких. Пригодные для раскрытых в настоящем описании способов клетки дополнительно описаны в разделе 4.2 ниже.

В некоторых вариантах осуществления изобретения легочное (или влияющее на легкие) заболевание, расстройство или патологическое состояние представляет собой легочное (или влияющее на легкие) заболевание, расстройство или патологическое состояние, не вызванное аутоиммунным заболеванием (или не связанное с ним). В конкретных вариантах осуществления изобретения легочное (или влияющее на легкие) заболевание, расстройство или патологическое состояние не связано с (или не вызвано) болезнью «трансплантат против хозяина», системным волчаночным эритематозом, воспалительной болезнью кишечника или ревматоидным артритом (например, это не ревматоидная болезнь легких). В некоторых других вариантах осуществления изобретения легочное (или влияющее на легкие) заболевание, расстройство или патологическое состояние не связано с (или не вызвано) воспалением (например, не вызвано воспалением легких, или не вызвано воспалительным ответом в другой ткани, помимо легких, и т.д.).

В конкретном варианте осуществления любого из вариантов настоящего изобретения плацентарные клетки представляют собой мультипотентные плацентарные клетки. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения плацентарные клетки представляют собой плацентарные стволовые клетки. В еще одном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения плацентарные клетки представляют собой мультипотентные плацентарные стволовые клетки. Плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки, используемые в описанных в настоящем документе способах, могут происходить или быть получены из материала одной плаценты или материала нескольких плацент. Плацентарные клетки также могут относится к одному биологическому виду, например, биологическому виду предполагаемого реципиента, или могут быть получены из нескольких биологических видов. Используемый в настоящем описании термин «полученные» означает «выделенные из плаценты или пуповины», или размноженные из клеток, выделенных из плаценты или пуповины.

4.1.1 Лечение интерстициальных заболеваний или расстройств легких

В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание, расстройство или патологическое состояние легких, которое поддается лечению с помощью плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, представляет собой интерстициальную болезнь легких (также известную как диффузная паренхиматозная болезнь легких). Поэтому настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума, имеющего интерстициальную болезнь легких, включающему в себя введение терапевтически эффективного количества плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, указанному индивидууму, например, в пораженное легкое указанного индивидуума. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения способ лечения включает в себя оценку улучшения у указанного индивидуума одного или нескольких параметров легочной функции после указанного введения (например, в течение от 7 до 30 дней после введения), причем указанные параметры легочной функции представляют собой объем форсированного выдоха за 1 секунду (FEV₁); форсированную жизненную емкость легких (FVC); отношение FEV₁/FVC; пиковый экспираторный поток (PEF); форсированный экспираторный поток при 25%-50% или 25%-75% объема (средний поток воздуха, покидающий легкие в течение средней части выдоха); время форсированного выдоха (FET); общую емкость легких (TLC); диффузионную способность по окиси углерода (DLCO); или максимальную произвольную вентиляцию. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанное введение приводит к улучшению одного или нескольких указанных параметров легочной функции (1) до 80% или более от ожидаемого; или (2) по меньшей мере, на 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 50%. В более конкретном варианте осуществления изобретения способ включает в себя идентификацию любого из указанных параметров, которые до введения составляют менее 80% от ожидаемых значений для индивидуума одного роста и веса, и оценку указанных параметров после указанного введения, причем указанное введение приводит к улучшению одного или нескольких указанных параметров легочной функции (1) до 80% или более от ожидаемого; или (2) по меньшей мере, на 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 50%.

В некоторых вариантах осуществления изобретения интерстициальная болезнь легких не является обструктивной болезнью дыхательных путей или обструктивной болезнью легких. Такие болезни могут включать воспаление интерстиция, ткани и пространства вокруг альвеолярных мешочков легких. В некоторых вариантах осуществления изобретения интерстициальная болезнь легких не вызвана воспалением. Симптомы интерстициальной болезни легких включают (без ограничений) одышку (в частности, при нагрузке); усталость; слабость; потерю аппетита; потерю веса; сухой непродуктивный кашель (при продукции небольшого количества мокроты или ее отсутствии); дискомфорт в груди; затрудненное дыхание; или признаки кровоизлияния в одном или двух легких.

Настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума, имеющему интерстициальную болезнь или расстройство легких (например, диффузную паренхиматозную болезнь легких), включающему в себя введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток. В конкретном варианте осуществления изобретения терапевтически эффективное количество плацентарных клеток представляет собой количество, которое постоянно или временно приводит к улучшению или замедлению ухудшения одного или нескольких симптомов указанной интерстициальной болезни легких. В конкретном варианте осуществления изобретения указанным симптомом у индивидуума является диффузионная способность по окисли углерода, ниже нормы (например, низкая диффузионная способность по окиси углерода (DLCO) по сравнению с нормальным значением). В некоторых более определенных вариантах осуществления изобретения указанные один или несколько симптомов интерстициальной болезни легких включают в себя одышку (в частности, при нагрузке); усталость; слабость; потерю аппетита; потерю веса; сухой непродуктивный кашель (при продукции небольшого количества мокроты или ее отсутствии); дискомфорт в груди; затрудненное дыхание; или признаки кровоизлияния в одном или двух легких.

В некоторых определенных вариантах осуществления изобретения указанное введение плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, приводит к детектируемому улучшению одного или нескольких параметров легочной функции у указанного индивидуума, например, подтверждаемое спирометрией, с помощью пневмотахометра, объемом форсированного выдоха и т.п. В более определенном варианте осуществления изобретения указанное введение приводит к увеличению, по меньшей мере, на 5%, 10%, 15% или 20% диффузии окиси углерода по сравнению с диффузией окиси углерода перед введением, в легких указанного индивидуума. В некоторых других конкретных вариантах осуществления изобретения указанное введение плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, приводит к детектируемому улучшению по одному или нескольким типам анализа: рентгеновского исследования, компьютерной томографии, магнитно-резонансной томографии, бронхоскопии или аналогичного сканирующего метода исследования (например, видимому улучшению состояния легких). В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанное введение плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, приводит к детектируемому снижению уровня двуокиси углерода, детектируемого в крови (например, возврату уровня СО₂ в нормальный диапазон).

В конкретном варианте осуществления изобретения интерстициальная болезнь легких не вызвана волчаночным эритематозом. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанная интерстициальная болезнь легких не является хронической диффузной интерстициальной болезнью легких.

В некоторых вариантах осуществления изобретения интерстициальная болезнь легких представляет собой интерстициальную болезнь легких с фиброзом (например, фиброзную болезнь легких), такую как интерстициальный легочный фиброз. В некоторых вариантах осуществления изобретения интерстициальная болезнь легких, например, фиброзная болезнь легких, представляет собой идиопатическую легочную пневмонию, идиопатический легочный фиброз (криптогенный фиброзный альвеолит), пневмокониоз, асбестоз, баритоз, бокситный фиброз, бериллиоз, синдром Каплана, халикоз, пневмокониоз угольщиков, сидероз, силикоз, биссиноз, гиперчувствительный пневмонит, багасоз, «легкое птицевода» или «легкое фермера».

4.1.2 Лечение обструктивных заболеваний или расстройств легких

В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание, расстройство или патологическое состояние легких, которое поддается лечению с помощью плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, представляет собой обструктивное легочное заболевание или расстройство. Поэтому настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума, имеющего обструктивное легочное заболевание или расстройство, включающему в себя введение терапевтически эффективного количества плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, указанному индивидууму, например, в пораженное легкое указанного индивидуума. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения способ лечения включает в себя оценку улучшения у указанного индивидуума одного или нескольких параметров легочной функции после указанного введения (например, в течение от 7 до 30 дней после введения), причем указанные параметры легочной функции представляют собой объем форсированного выдоха за 1 секунду (FEV₁); форсированную жизненную емкость легких (FVC); отношение FEV₁/FVC; пиковый экспираторный поток (PEF); форсированный экспираторный поток при 25%-50% или 25%-75% объема (средний поток воздуха, покидающего легкие в течение средней части выдоха); время форсированного выдоха (FET); общую емкость легких (TLC); диффузионную способность по окиси углерода (DLCO); или максимальную произвольную вентиляцию. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанное введение приводит к улучшению одного или нескольких указанных параметров легочной функции (1) до 80% или более от ожидаемого; или (2) по меньшей мере, на 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 50%. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения способ включает в себя идентификацию любого из указанных параметров, которые до введения составляют менее 80% от ожидаемых значений для индивидуума одного роста и веса, и оценку указанных параметров после указанного введения, причем указанное введение приводит к улучшению одного или нескольких указанных параметров легочной функции (1) до 80% или более от ожидаемого; или (2) по меньшей мере, на 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 50%.

В конкретных вариантах осуществления изобретения обструктивным заболеванием легких являются острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС), астма, бронхоэктазия, бронхиолэктазия, бронхиолит, бронхит, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) или эмфизема. В другом конкретном варианте осуществления изобретения обструктивное легочное заболевание или расстройство не вызвано аутоиммунным заболеванием. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанное обструктивное легочное заболевание или расстройство не вызвано воспалительной болезнью кишечника или болезнью «трансплантат против хозяина».

Поэтому настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума, имеющему обструктивное легочное заболевание или расстройство, включающему в себя введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток. В конкретном варианте осуществления изобретения терапевтически эффективное количество плацентарных клеток представляет собой количество, которое постоянно или временно приводит к улучшению или замедлению ухудшения одного или нескольких симптомов указанного обструктивного легочного заболевания или расстройства.

В конкретном варианте осуществления изобретения указанным обструктивным легочным заболеванием или расстройством является хроническая обструктивная болезнь легких, например, диагностируемая по отношению объема форсированного выдоха за 1 секунду (FEV₁) к форсированной жизненной емкости легких (FVC) меньше 0,7. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанным терапевтически эффективным количеством плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, является количество, которое приводит к детектируемому подъему соотношения FEV₁/FEC выше 0,7 после введения, например, подъему на 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,10 или больше.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанным обструктивным легочным заболеванием или расстройством является астма. В более конкретных вариантах осуществления изобретения указанным терапевтически эффективным количеством плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, является количество, которое приводит к детектируемому улучшению одного или нескольких симптомов астмы, например, обструкции дыхательных путей, определяемой с помощью спирометрии или пневмотахометра.

Лечение обструктивного легочного заболевания, расстройства или патологического состояния может включать в себя введение второго терапевтического соединения. В конкретных вариантах осуществления изобретения, например, когда заболеванием, расстройством или патологическим состоянием является астма, вторая терапевтическая композиция или второй способ лечения могут включать в себя одно или несколько вводимых с помощью ингаляции терапевтических соединений или принимаемых перорально терапевтических соединений, например, без ограничений, вводимые с помощью ингаляции кортикостероиды (например, гидрокортизон, преднизон, преднизолон, метилпреднизолон, дексаметазон, бетаметазон, триамцинолон, беклометазон, флудрокортизона ацетат, дезоксикортизона ацетат, альдостерон и т.п.) или вводимые с помощью ингаляции бета-агонисты (например, салбутамол, левосалбутамол, тербуталин, пирбутерол, прокатерол, метапротеренол, фенотерол, битолтерол, салметерол, формотерол, бамбутерол, кленбутерол, индакатерол и т.п.), ингибиторы лейкотриенов (например, зилейтон, МК-866, монтелукаст, зафирлукаст и т.п.).

В других конкретных вариантах осуществления изобретения, когда заболеванием, расстройством или патологическим состоянием легких является, например, является ХОБЛ, вторая терапевтическая композиция или второй способ лечения могут включать в себя один или несколько из вводимых с помощью ингаляции бета-агонистов (смотри список бета-агонистов, приводимый в обсуждении астмы, выше); или антихолинергетики (например, ипратропия бромид (Атровент), окситропия бромид (Оксивент), тиотропия (Спирива) и т.п.).

4.1.3 Лечение заболеваний, расстройств или патологических состояний легких, вызванных иммунным ответом

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способу лечения индивидуума, имеющего заболевание, расстройство или патологическое состояние легких, ассоциированное с или вызванное неблагоприятным, разрушительным, несоответствующим или нежелательным иммунным ответом, включающему в себя введение терапевтически эффективного количества плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, указанному индивидууму, например, в пораженное легкое указанного индивидуума. В некоторых вариантах осуществления изобретения заболеванием, расстройством или патологическим состоянием легких является, например, аллергическое или аутоиммунное заболевание, поражающее легкие. В конкретном варианте осуществления изобретения указанным заболеванием, расстройством или патологическим состоянием является расстройство или заболевание легких, ассоциированное с или вызванное волчанкой, например, системным волчаночным эритематозом, склеродермой, болезнью «трансплантат против хозяина» или ревматоидным артритом (например, ревматоидной болезнью легких).

В конкретном варианте осуществления изобретения способ лечения включает в себя идентификацию у индивидуума, имеющего несоответствующий иммунный ответ, например, аутоиммунное заболевание, симптома указанного иммунного ответа в легких; введение плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, указанному индивидууму, например, в пораженное легкое указанного индивидуума; и оценку у указанного индивидуума улучшений по одному или нескольким параметрам легочной функции после указанного введения (например, в течение от 7 до 30 дней после введения), причем указанные параметры легочной функции представляют собой объем форсированного выдоха за 1 секунду (FEV₁); форсированную жизненную емкость легких (FVC); отношение FEV₁/FVC; пиковый экспираторный поток (PEF); форсированный экспираторный поток при 25%-50% или 25%-75% объема (средний поток воздуха, покидающего легкие в течение средней части выдоха); время форсированного выдоха (FET); общую емкость легких (TLC); диффузионную способность по окиси углерода (DLCO); или максимальную произвольную вентиляцию. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанное введение приводит к улучшению одного или нескольких указанных параметров легочной функции (1) до 80% или более от ожидаемого; или (2) по меньшей мере, на 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% или 10%, или больше. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения способ включает в себя идентификацию любого из указанных параметров, которые до введения составляют менее 80% от ожидаемых значений для индивидуума одного роста и веса, и оценку указанных параметров после указанного введения, причем указанное введение приводит к улучшению одного или нескольких указанных параметров легочной функции (1) до 80% или более от ожидаемого; или (2) по меньшей мере, на 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% или 10%, или больше.

В некоторых вариантах осуществления изобретения плацентарные клетки, например, используемые в способе плацентарные стволовые клетки, подавляют иммунный ответ при контакте с множеством иммунных клеток (например, CD4⁺ T-клетками, CD8⁺ T-клетками или естественными киллерами (NK-клетками)) in vivo, например, у индивидуума, пораженного указанным заболеванием, расстройством или состоянием, затрагивающим легкие. В различных конкретных вариантах осуществления изобретения указанного контакта достаточно для подавления иммунной функции, ассоциированной с указанным заболеванием, расстройством или патологическим состоянием легких, или являющейся его причиной, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% по сравнению с иммунной функцией у пораженного индивидуума в отсутствие плацентарных стволовых клеток.

Контакт плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, с иммунными клетками может происходить in vivo в случае, например, пересадки или трансплантации одного или нескольких типов тканей реципиенту или как дополнение к ней. Такой тканью может быть, например, легочная ткань. В этом случае плацентарные стволовые клетки можно использовать для подавления одного или нескольких типов иммунного ответа одной или нескольких иммунных клеток, присутствующих в организме реципиента, в пересаженной легочной ткани, или и там, и там. Контакт может происходить перед, в течение и/или после пересадки или трансплантации. Например, плацентарные стволовые клетки можно вводить во время трансплантации или пересадки. Плацентарные клетки можно также или в качестве альтернативы вводить перед трансплантацией или пересадкой, например, за примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней до трансплантации или пересадки. Плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки, можно также или в качестве альтернативы вводить реципиенту трансплантата или графта после трансплантации или пересадки, например через, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней после трансплантации или пересадки. Предпочтительно, чтобы плацентарные клетки контактировали с иммунными клетками перед тем, как будет выявлен любой детектируемый признак или симптом иммунного ответа либо от реципиента, либо от пересаженных ткани или графта, например, детектируемый признак или симптом болезни «трансплантат против хозяина» или детектируемого воспаления.

Лечение индивидуума, имеющего заболевание, расстройство или патологическое состояние легких, ассоциированное с, ухудшающееся в результате или вызванное нежелательным или неблагоприятным иммунным ответом, может дополнительно включать в себя введение индивидууму одного или нескольких иммуносупрессоров, в частности, в условиях in vivo. В одном варианте осуществления изобретения множество плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, контактирует с множеством иммунных клеток in vivo в организме индивидуума, а композицию, содержащую иммуносупрессор, вводят индивидууму, имеющему заболевание, расстройство или патологическое состояние легких. Иммуносупрессоры хорошо известны в данной области и включают, например, антитела к Т-клеточному рецептору (моноклональные или поликлональные, или их фрагменты или производные), антитела к рецептору IL-2 (например, Базиликсимаб (СИМУЛЕКТ®) или даклизумаб (ЗЕНАПАКС®)), антитела к Т-клеточному рецептору (например, Муромонаб-CD3), азатиоприн, кортикостероиды, циклоспорин, такролимус, микофенолат мофетил, сиролимус, ингибиторы кальциневрина и т.п. В конкретном варианте осуществления изобретения иммуносупрессором является нейтрализующее антитело к макрофагальному воспалительному белку (MIP) - 1α или MIP-1β. Предпочтительно вводить анти-MIP-1α или анти-MIP-1β антитело в количестве, достаточном для индукции детектируемого снижения количества MIP-1α и/или MIP-1β у указанного индивидуума, например, во время трансплантации.

В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум, имеющий заболевание, расстройство или патологическое состояние легких получает лечение введением плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, и, необязательно, одного или нескольких терапевтических агентов, в любое время развития заболевания. Например, индивидуум может получать лечение немедленно после постановки диагноза, или через 1, 2, 3, 4, 5, 6 дней после постановки диагноза, или через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более недель, или через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более лет после постановки диагноза. Индивидуум может получать лечение однократно или многократно в ходе клинического течения болезни. Индивидуум может получать лечение, в зависимости от обстоятельств, в ходе острого приступа, в ремиссии или при хронической дегенеративной фазе.

В конкретном варианте осуществления изобретения лечение заболевания, расстройства или патологического состояния легких, связанных с или вызванных несоответствующим, разрушительным или неблагоприятным иммунным ответом, включает в себя введение популяции второго типа клеток, например, стволовых клеток, в дополнение к плацентарным клеткам, например, плацентарным стволовым клеткам. В конкретном варианте осуществления изобретения указанные стволовые клетки представляют собой мезенхимные стволовые клетки, например, мезенхимные стволовые клетки, полученные из костного мозга. В других вариантах осуществления изобретения вторым типом клеток являются мультипотентные стволовые клетки, плюрипотентные стволовые клетки, клетки-предшественники, гематопоэтические стволовые клетки, например, CD34⁺ гематопоэтические стволовые клетки (например, содержащиеся в необработанных костном мозге или пуповинной крови, или клетки, выделенные из костного мозга или пуповинной крови), стволовые клетки взрослых людей, эмбриональные стволовые клетки или эмбриональные зародышевые клетки. Второй тип клеток, например, мезенхимные стволовые клетки, можно вводить с плацентарными клетками, например, плацентарными стволовыми клетками, в любом соотношении, например, соотношении примерно 100:1, 75:1, 50:1, 25:1, 20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:50, 1:75 или 1:100. Мезенхимные стволовые клетки можно купить или выделить из исходного источника, например, костного мозга, аспирата костного мозга, жировой ткани и т.п.

4.1.3.1 Лечение легочных расстройств, ассоциированных с болезнью «трансплантат против хозяина»

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способу лечения индивидуума, например реципиента трансплантата, или индивидуума, которому пересадят или пересадили трансплантат, включающему в себя введение индивидууму, например, в пораженное легкое индивидуума, терапевтически эффективного количества плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения трансплантат является трансплантатом легких или графтом части легкого. В некоторых других вариантах осуществления изобретения трансплантат является трансплантатом костного мозга. В конкретных вариантах осуществления изобретения реципиент трансплантата имеет, или ощущает симптомы, или имеет риск развития болезни «трансплантат против хозяина» (GVHD).

В одном варианте осуществления изобретения способ лечения включает в себя оценку индивидуума по одному или нескольким параметрам легочной функции до трансплантации, например трансплантации органа или костного мозга, и при ухудшении одного или нескольких параметров после трансплантации - введение плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, причем указанные параметры легочной функции представляют собой объем форсированного выдоха за 1 секунду (FEV₁); форсированную жизненную емкость легких (FVC); отношение FEV₁/FVC; пиковый экспираторный поток (PEF); форсированный экспираторный поток при 25%-50% или 25%-75% объема (средний поток воздуха, покидающего легкие в течение средней части выдоха); время форсированного выдоха (FET); общую емкость легких (TLC); диффузионную способность по окиси углерода (DLCO); или максимальную произвольную вентиляцию. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанное введение приводит к улучшению одного или нескольких указанных параметров легочной функции (1) до 80% или более от ожидаемого; или (2) по меньшей мере, на 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% или 10%, или больше.

В предпочтительных вариантах осуществления изобретения способ включает в себя введение индивидууму терапевтически эффективного количества плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, кондиционной среды от плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, причем терапевтически эффективным количеством является количество, которое приводит к детектируемому улучшению одного или нескольких симптомов, или замедлению развития одного или нескольких симптомов заболевания, расстройства или патологического состояния легких, ассоциированных с или вызванных трансплантатом или GVHD. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное введение приводит, по меньшей мере, к стабилизации одного или нескольких симптомов GVHD; то есть указанные один или несколько симптомов значительно не улучшаются, но и значительно не ухудшаются. В более конкретных вариантах осуществления изобретения указанные один или несколько симптомов GVHD включают обструктивное заболевание легких (включая свистящую одышку и/или хронический кашель).

В некоторых вариантах осуществления изобретения способ лечения включает в себя оценку эффективности введения плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток. Например, в одном варианте осуществления изобретения способ лечения легочного заболевания или расстройства, вызванного или ассоциированного с трансплантатом или GVHD, включает в себя: (1) введение терапевтически эффективного количества плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, кондиционной среды от плацентарных клеток или пуповинных клеток, например, кондиционной среды от плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток; и (2) оценку у индивидуума детектируемого улучшения одного или нескольких симптомов, или задержки появления одного или нескольких симптомов заболевания, расстройства или патологического состояния легких, ассоциированных с GVHD или вызванных GVHD. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения указанный способ лечения включает в себя второе (или дополнительное) введение плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, указанному индивидууму, с необязательной второй (или дополнительной) оценкой у индивидуума детектируемого улучшения одного или нескольких симптомов, или задержки появления одного или нескольких симптомов заболевания, расстройства или патологического состояния легких, ассоциированных с GVHD или вызванных GVHD.

Способ не ограничен происхождением донора или реципиента. Трансплантация может быть межвидовой. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения донор и реципиент относятся к одному биологическому виду, например, оба являются людьми. Реципиент трансплантата может быть полностью или частично аллогенным донору. Трансплантация может быть аутологичной. Возраст реципиентов или доноров трансплантата может быть меньше пяти лет, от 1 до 10 лет, от 5 до 15 лет, от 10 до 20 лет, от 15 до 25 лет, от 20 до 30 лет, от 25 до 35 лет, от 30 до 40 лет, от 35 до 45 лет, от 40 до 50 лет, от 45 до 55 лет, от 50 до 60 лет, от 55 до 65 лет, от 60 до 70 лет или 70 лет или больше.

Способы по настоящему изобретению можно использовать для лечения одного или нескольких легочных проявлений GVHD у индивидуумов, имеющих симптомы, которые указывают на возрастающую степень или стадию заболевания, приведенные в таблицах 1 и 2 ниже. GVHD классифицируется по тяжести симптомов. Например, в одном варианте осуществления изобретения симптомы GVHD разделены по стадиям, и GVHD оценивается по стадиям от 0 (нет GVHD) до IV (угрожающая жизни GVHD) в соответствии с кожными, печеночными и/или желудочными симптомами, показанными в таблицах 1 и 2.

В конкретных вариантах осуществления изобретения плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки, вводят индивидууму в течение 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 дней или в течение 1 дня перед трансплантацией. В другом конкретном варианте осуществления изобретения плацентарные клетки вводят одновременно с трансплантацией. В другом конкретном варианте осуществления изобретения плацентарные клетки вводят в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней после трансплантации. Введение плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, можно проводить многократно, например, многократно перед, в течение или после трансплантации, или использовать любую композицию вариантов. В другом варианте осуществления изобретения плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки, вводят в любое время после трансплантации, когда у индивидуума (реципиента трансплантата) возникает вторая степень (или более высокая степень) болезни «трансплантат против хозяина».

В другом варианте способа индивидууму, например, реципиенту трансплантата, или индивидууму, которому будут пересаживать трансплантат, вводят терапевтически эффективное количество плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, и дополнительно, по меньшей мере, один другой терапевтический агент. В конкретном варианте осуществления изобретения терапевтическим агентом является атимоцитарный глобулин, микофенолат мофетил, сиролимус, Кампат-1Н, фактор роста кератиноцитов (KGF), субероиланилидгидроксамовая кислота (SAHA), кортизон, гидрокортизон, преднизон или метилпреднизон. В другом конкретном варианте осуществления изобретения терапевтическим агентом является иммуносупрессирующий агент или иммуномодулирующий агент. Иммуносупрессирующие агенты и иммуномодулирующие агенты, которые можно использовать в качестве вторых агентов для лечения GVHD, например, для лечения проявлений GVHD в легких, включают, но не ограничены этим, метотрексат, лефлуномид, циклофосфамид, циклоспорин А, макролидные антибиотики (например, FK506 (такролимус)), метилпреднизолон (МР), кортикостероиды, стероиды, микофенолат мофетил, рапамицин (сиролимус), мизорибин, дезоксиспергуалин, бреквинар, малононитрилоамиды (например, лефлунамид), модуляторы Т-клеточных рецепторов и модуляторы цитокиновых рецепторов, пептидомиметики и антитела (например, антитела человека, гуманизированные, химерные, моноклональные, поликлональные антитела, Fv-, ScFv-, Fab- или F(ab)₂-фрагменты или эпитоп-связывающие фрагменты антител), молекулы нуклеиновых кислот (например, антисмысловые молекулы и тройные спирали нуклеиновых кислот), низкомолекулярные соединения, органические соединения и неорганические соединения. В частности, иммуномодулирующие агенты включают, но не ограничены этим, метотрексат, лефлуномид, циклофосфамид, цитоксан, Имуран, циклоспорин А, миноциклин, азатиоприн, антибиотики (например, FK506 (такролимус)), метилпреднизолон (МР), кортикостероиды, стероиды, микофенолат мофетил, рапамицин (сиролимус), мизорибин, дезоксиспергуалин, бреквинар, малононитрилоамиды (например, лефлуномид), модуляторы Т-клеточных рецепторов и модуляторы цитокиновых рецепторов. Примеры модуляторов Т-клеточных рецепторов включают, но не ограничены этим антитела к Т-клеточным рецепторам (Например, анти-CD4 антитела (например, cM-T412 (Boehringer), IDEC-CE9.Is (IDEC и SKB), mAB 4162W94, ОРТОКЛОН® и OKTcdr4a (Janssen-Cilag)), анти-CD3 антитела (например, НУВИОН® (Product Design Labs), OKT3 (Johnson & Johnson) или Ритуксан (IDEC)), анти-CD5 антитела (например, анти-CD5 антитело, конъюгированное с рицином), анти-CD7 антитела (например, CHH-380 (Novartis)), анти-CD8 антитела, моноклональные антитела к лиганду CD40 (например, IDEC-131 (IDEC)), анти-CD52 антитела (например, КАМПАТ®-1H (Ilex)), анти-CD2 антитела, анти-CD1a антитела (e.g., Ксанелим (Genentech)) и анти-B7 антитела (например, IDEC-114) (IDEC))), CTLA4-иммуноглобулин, талидомид или одно из соединений, упомянутых в разделе 5.6.6, ниже. В конкретном варианте осуществления изобретения модулятором Т-клеточного рецептора является антагонист CD2. В других вариантах осуществления изобретения модулятором Т-клеточного рецептора не является антагонист CD2. В другом конкретном варианте осуществления изобретения агентом является антитело MEDI-501 (T10B9). В другом конкретном варианте осуществления изобретения модулятором Т-клеточного рецептора является антагонист CD2, предпочтительно, MEDI-507. В других вариантах осуществления изобретения модулятором Т-клеточного рецептора не является молекула, связывающая CD2. Индивидууму можно вводить любую комбинацию вышеупомянутых терапевтических агентов, подходящих для лечения GVHD или симптомов GVHD. Такие терапевтические агенты можно вводить в любой комбинации с плацентарными клетками, например, плацентарными стволовыми клетками, кондиционной культуральной средой от плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, пуповинными клетками, например, пуповинными стволовыми клетками, и/или кондиционной средой от пуповинных клеток одновременно или в качестве отдельного курса лечения.

4.1.3.2 Легочные расстройства, ассоциированные с ревматоидным артритом

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения индивидуума, который имеет или испытывает симптом (или имеет риск развития) заболевания, расстройства или патологического состояния легких, ассоциированного с ревматоидным артритом (РА) или вызванного РА, включающему в себя введение индивидууму терапевтически эффективного количества плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, или кондиционной культуральной среды от плацентарных клеток, причем указанное терапевтически эффективное количество представляет собой количество, которое приводит к детектируемому улучшению одного или нескольких симптомов, или задерживает возникновение одного или нескольких симптомов заболевания, расстройства или патологического состояния легких, ассоциированного с ревматоидным артритом или вызванного РА. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное введение приводит, по меньшей мере, к стабилизации одного или нескольких симптомов РА, которые проявляются в легких индивидуума; то есть указанные один или несколько симптомов значительно не улучшаются, но и значительно не ухудшаются.

В конкретном варианте осуществления изобретения способ лечения включает в себя идентификацию у индивидуума с РА, симптома указанного ревматоидного артрита в легких; введение плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, указанному индивидууму, например, в пораженное легкое указанного индивидуума; и оценку у указанного индивидуума улучшений по одному или нескольким параметрам легочной функции после указанного введения (например, в течение от 7 до 30 дней после введения), причем указанные параметры легочной функции представляют собой объем форсированного выдоха за 1 секунду (FEV₁); форсированную жизненную емкость легких (FVC); отношение FEV₁/FVC; пиковый экспираторный поток (PEF); форсированный экспираторный поток при 25%-50% или 25%-75% объема (средний поток воздуха, покидающего легкие в течение средней части выдоха); время форсированного выдоха (FET); общую емкость легких (TLC); диффузионную способность по окиси углерода (DLCO); или максимальную произвольную вентиляцию. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанное введение приводит к улучшению одного или нескольких указанных параметров легочной функции (1) до 80% или более от ожидаемого; или (2) по меньшей мере, на 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 50%. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения способ включает в себя идентификацию любого из указанных параметров, которые до введения составляют менее 80% от ожидаемых значений для индивидуума одного роста и веса, и оценку указанных параметров после указанного введения, причем указанное введение приводит к улучшению одного или нескольких указанных параметров легочной функции (1) до 80% или более от ожидаемого; или (2) по меньшей мере, на 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 50%.

В конкретном варианте осуществления изобретения введение является достаточным для того, чтобы вызвать детектируемое улучшение одного или нескольких симптомов ревматоидного артрита, или состояния, близкого к РА, или достаточным для детектируемого замедления возникновения одного или нескольких симптомов ревматоидного артрита или состояния, близкого к РА, в легких индивидуума, например, боли при дыхании, одышки (например, вследствие плеврального выпота), развития или присутствия узлов в легких (ревматоидных узлов), образования рубцов в легких (пульмонарного фиброза или облитилирующего бронхиолита, вирусной инфекции в легких, фиброза легких (например, вследствие терапии метотрексатом).

В некоторых вариантах осуществления изобретения способ лечения включает в себя оценку эффективности введения плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток. Например, в одном варианте осуществления изобретения способ лечения легочного заболевания или расстройства, вызванного или ассоциированного с ревматоидным артритом, включает в себя: (1) введение терапевтически эффективного количества плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, и/или кондиционной культуральной среды от плацентарных клеток; и (2) оценку у индивидуума детектируемого улучшения по одному или нескольким симптомам или задержку возникновения одного или нескольких симптомов заболевания, расстройства или патологического состояния легких, ассоциированных с ревматоидным артритом или вызванных РА. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения указанный способ лечения включает в себя второе (или дополнительное) введение плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, указанному индивидууму, с необязательной второй (или дополнительной) оценкой у индивидуума детектируемого улучшения по одному или нескольким симптомам, или задержки возникновения одного или нескольких симптомов заболевания, расстройства или патологического состояния легких, ассоциированных с ревматоидным артритом или вызванных РА.

В конкретном варианте осуществления способа по изобретению индивидууму, имеющему заболевание, расстройство или патологическое состояние легких, ассоциированное с ревматоидным артритом, вводят терапевтически эффективное количество плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, или кондиционной среды от плацентарных клеток, и дополнительно, по меньшей мере, один другой терапевтический агент, например, обезболивающий или противовоспалительный агент. В более конкретных вариантах осуществления изобретения «по меньшей мере одним другим терапевтическим агентом» является базисный противоревматический препарат (DMARD), например, ксенобиотик (например, азатиоприн, циклоспорин А, D-пеницилламин, соли золота, гидроксихлорохин, лефлуномид, метотрексат, миноциклин или сульфасалазин), или биологический агент (например, блокаторы фактора некроза опухолей альфа (TNF-α), такие как этанерцепт (ЭНБРЕЛ®), Инфликсимаб (РЕМИКЕЙД®), адалимумаб (ХУМИРА®); блокаторы интерлейкина-1; анти-В клеточные (CD20) антитела (например, ритуксимаб или РИТУКСАН®); или блокаторы активации Т-клеток (например, абатацепт или ОРЕНСИА®). В другом более конкретном варианте осуществления изобретения обезболивающим или противовоспалительным агентом является глюкокортикостероид, нестероидное противовоспалительное средство, ацетаминофен, ибупрофен, аспирин, опиат или лидокаин (для местного применения). Такие терапевтические агенты можно вводить в любой комбинации с плацентарными клетками, например, плацентарными стволовыми клетками, одновременно или в качестве отдельного курса лечения.

В конкретном варианте осуществления изобретения множество плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, которые вводят индивидууму с ревматоидным артритом, является генетически модифицированным для экспрессии полипептида, обладающего терапевтическими свойствами в отношении РА. В более конкретном варианте осуществления изобретения полипептидом, обладающим терапевтическими свойствами в отношении ревматоидного артрита, является IL-1Ra (антагонист рецептора интерлейкина-1). В другом более конкретном варианте осуществления изобретения полипептидом, обладающим терапевтическими свойствами в отношении РА, является слитый белок, включающий в себя IL-1Ra и DHFR (дигидрофолат-редуктазу). В более конкретном варианте осуществления изобретения плацентарные клетки трансформированы нуклеиновой кислотой, кодирующей слитый белок IL-1Ra-DHFR, причем экспрессия слитого белка усиливается антифолатом (антагонистом фолиевой кислоты), например, метотрексатом. В еще более конкретном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота кодирует IL-1Ra-DHFR-IRES-Luc, где IRES представляет собой внутренний участок связывания рибосомы, а Luc представляет собой люциферазу. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанная нуклеиновая кислота включает в себя нуклеотидную последовательность, которая дает возможность контролировать экспрессию IL-1Ra или слитого полипептида IL-1Ra-DHFR.

4.1.3.3 Легочные расстройства, ассоциированные с волчаночным эритематозом

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения индивидуума, который имеет или испытывает симптом (или имеет риск развития) заболевания, расстройства или патологического состояния легких, ассоциированного с волчаночным эритематозом (ВЭ) или вызванного ВЭ, включающему в себя введение индивидууму терапевтически эффективного количества плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, или кондиционной культуральной среды от плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, причем указанное терапевтически эффективное количество представляет собой количество, которое приводит к детектируемому улучшению одного или нескольких симптомов, или задерживает возникновение одного или нескольких симптомов заболевания, расстройства или патологического состояния легких, ассоциированного с волчаночным эритематозом или вызванного ВЭ. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное введение приводит, по меньшей мере, к стабилизации одного или нескольких симптомов ВЭ, которые проявляются в легких индивидуума; то есть указанные один или несколько симптомов значительно не улучшаются, но и значительно не ухудшаются. В конкретных вариантах осуществления изобретения указанные симптомы включают в себя плеврит (с выпотом или без), волчаночную пневмонию или хроническую диффузную интерстициальную болезнь легких.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способ лечения включает в себя идентификацию у индивидуума с волчаночным эритематозом, симптома указанного ВЭ в легких; введение плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, указанному индивидууму, например, в пораженное легкое указанного индивидуума; и оценку у указанного индивидуума улучшений по одному или нескольким параметрам легочной функции после указанного введения (например, в течение от 7 до 30 дней после введения), причем указанные параметры легочной функции представляют собой объем форсированного выдоха за 1 секунду (FEV₁); форсированную жизненную емкость легких (FVC); отношение FEV₁/FVC; пиковый экспираторный поток (PEF); форсированный экспираторный поток при 25%-50% или 25%-75% объема (средний поток воздуха, покидающего легкие в течение средней части выдоха); время форсированного выдоха (FET); общую емкость легких (TLC); диффузионную способность по окиси углерода (DLCO); или максимальную произвольную вентиляцию. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанное введение приводит к улучшению одного или нескольких указанных параметров легочной функции (1) до 80% или более от ожидаемого; или (2) по меньшей мере, на 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 50%. В более конкретном варианте осуществления изобретения способ включает в себя идентификацию любого из указанных параметров, которые до введения составляют менее 80% от ожидаемых значений для индивидуума одного роста и веса, и оценку указанных параметров после указанного введения, причем указанное введение приводит к улучшению одного или нескольких указанных параметров легочной функции (1) до 80% или более от ожидаемого; или (2) по меньшей мере, на 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 50%.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способ лечения включает в себя оценку эффективности введения плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток. Например, в одном варианте осуществления изобретения способ лечения легочного заболевания или расстройства, вызванного или ассоциированного с ВЭ, включает в себя: (1) введение терапевтически эффективного количества плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, или кондиционной культуральной среды от плацентарных клеток; и (2) оценку у индивидуума детектируемого улучшения по одному или нескольким симптомам или задержку возникновения одного или нескольких симптомов заболевания, расстройства или патологического состояния легких, ассоциированных с волчаночным эритематозом или вызванных ВЭ. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения указанный способ лечения включает в себя второе (или дополнительное) введение плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, указанному индивидууму, с необязательной второй (или дополнительной) оценкой у индивидуума детектируемого улучшения по одному или нескольким симптомам, или задержки возникновения одного или нескольких симптомов заболевания, расстройства или патологического состояния легких, ассоциированных с волчаночным эритематозом или вызванных ВЭ.

4.1.3.4 Легочные расстройства, ассоциированные со склеродермой

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения индивидуума, который имеет или испытывает симптом (или имеет риск развития) заболевания, расстройства или патологического состояния легких, ассоциированного со склеродермой или вызванного склеродермой, включающему в себя введение индивидууму терапевтически эффективного количества плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, или кондиционной культуральной среды от плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, причем указанное терапевтически эффективное количество представляет собой количество, которое приводит к детектируемому улучшению одного или нескольких симптомов, или задерживает возникновение одного или нескольких симптомов заболевания, расстройства или патологического состояния легких, ассоциированного со склеродермой или вызванного склеродермой. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное введение приводит, по меньшей мере, к стабилизации одного или нескольких симптомов склеродермы, которые проявляются в легких индивидуума; то есть указанные один или несколько симптомов значительно не улучшаются, но и значительно не ухудшаются. В конкретных вариантах осуществления изобретения указанные симптомы включают в себя диспноэ (одышку), интерстициальную болезнь легких (также именуемую фиброзным альвеолитом или легочным фиброзом) или сосудистые заболевания легких (отдельно или включая легочную гипертонию).

В некоторых вариантах осуществления изобретения способ лечения включает идентификацию у индивидуума со склеродермой, симптома указанной склеродермы в легких; введение плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, указанному индивидууму, например, в пораженное легкое указанного индивидуума; и оценку у указанного индивидуума улучшений по одному или нескольким параметрам легочной функции после указанного введения (например, в течение от 7 до 30 дней после введения), причем указанные параметры легочной функции представляют собой объем форсированного выдоха за 1 секунду (FEV₁); форсированную жизненную емкость легких (FVC); отношение FEV₁/FVC; пиковый экспираторный поток (PEF); форсированный экспираторный поток при 25%-50% или 25%-75% объема (средний поток воздуха, покидающего легкие в течение средней части выдоха); время форсированного выдоха (FET); общую емкость легких (TLC); диффузионную способность по окиси углерода (DLCO); или максимальную произвольную вентиляцию. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанное введение приводит к улучшению одного или нескольких указанных параметров легочной функции (1) до 80% или более от ожидаемого; или (2) по меньшей мере, на 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 50%. В более конкретном варианте осуществления изобретения способ включает в себя идентификацию любого из указанных параметров, которые до введения составляют менее 80% от ожидаемых значений для индивидуума одного роста и веса, и оценку указанных параметров после указанного введения, причем указанное введение приводит к улучшению одного или нескольких указанных параметров легочной функции (1) до 80% или более от ожидаемого; или (2) по меньшей мере, на 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 50%.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способ лечения включает в себя оценку эффективности введения плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток. Например, в одном варианте осуществления изобретения способ лечения легочного заболевания или расстройства, вызванного или ассоциированного со склеродермой, включает в себя: (1) введение терапевтически эффективного количества плацентарных клеток или пуповинных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, или кондиционной культуральной среды от плацентарных клеток; и (2) оценку у индивидуума детектируемого улучшения одного или нескольких симптомов или задержку возникновения одного или нескольких симптомов заболевания, расстройства или патологического состояния легких, ассоциированных со склеродермой или вызванных склеродермой. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения указанный способ лечения включает в себя второе (или дополнительное) введение плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, указанному индивидууму, с необязательной второй (или дополнительной) оценкой у индивидуума детектируемого улучшения одного или нескольких симптомов, или задержки возникновения одного или нескольких симптомов заболевания, расстройства или патологического состояния легких, ассоциированных со склеродермой или вызванных склеродермой.

В конкретном варианте осуществления изобретения у указанного индивидуума оценивают диффузионную способность по окиси углерода (DLCO), а улучшение состояния индивидуума включает в себя значительное улучшение по DLCO после введения плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток (например, к увеличению, по меньшей мере, на 3, 4, 5 или больше процентных точек) по сравнению с DLCO перед введением. В другом конкретном варианте осуществления изобретения у указанного индивидуума оценивают форсированную жизненную емкость легких (FVC), а улучшение состояния индивидуума включает в себя увеличение FVC, по меньшей мере, на 10%, по меньшей мере, на 15% или, по меньшей мере, на 20% после введения плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, по сравнению с FVC до введения, например, в течение периода времени, по меньшей мере, 1, 2, 3 или 4 недель, или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев после введения.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения у индивидуума оценивают образование рубцов в легких или легочную гипертонию, используя, например, компьютерную томографию легких с высоким разрешением, бронхоальвеолярный лаваж и/или хирургическую биопсию легких.

В конкретном варианте осуществления способа по изобретению индивидууму, имеющему заболевание, расстройство или патологическое состояние легких, ассоциированное с ревматоидным артритом, вводят терапевтически эффективное количество плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, или кондиционной культуральной среды от плацентарных клеток, и дополнительно, по меньшей мере, один другой терапевтический агент, например, обезболивающий или противовоспалительный агент. В более конкретных вариантах осуществления изобретения терапевтический агент включает в себя, без ограничений, ингибитор синтеза коллагена и/или перекрестной сшивки коллагена (например, пеницилламин), стероид (например, преднизон), циклофосфамид (например, ЦИТОКСАН®), комбинацию циклофосфамида и стероида, комбинацию циклофосфамида и азатиоприна, антифиброзное средство (например, интерферон-гамма (IFN-γ)), анти-эндотелин (например, Бозентан (ТРАКЛЕЕР®)), простациклиновый аналог (например, эпопростенол (ФЛОЛАН®), трепростинил (РЕМОДУЛИН®)) и/или антагонист эндотелинового рецептора (например, эндотелиновый рецептор В) (например, ситаксентан, амбрисентан (ЛЕТАЙРИС™)).

4.1.3.5 Определение иммуносупрессивного потенциала плацентарных клеток

В некоторых необязательных вариантах осуществления изобретения иммуносупрессирующую способность конкретной популяции плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, определяют перед использованием, например, перед введением индивидууму, имеющему заболевание, расстройство или патологическое состояние легких, ассоциированное с несоответствующим или нежелательным иммунным ответом или вызванное им. Например, можно использовать MLR-анализ (анализ реакции лимфоцитов) для определения иммуносупрессирующей способности конкретной популяции плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, например, конкретной дозы плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток. Методики проведения MLR и регрессионные методы анализа хорошо известны в данной области. Смотри, например, Schwarz, "The Mixed Lymphocyte Reaction: An In Vitro Test for Tolerance," J. Exp. Med. 127(5):879-890 (1968); Lacerda et al, "Human Epstein-Barr Virus (EBV)-Specific Cytotoxic T Lymphocytes Home Preferentially to and Induce Selective Regressions of Autologous EBV-Induced В Lymphoproliferations in Xenografted C.B-17 Scid/Scid Mice," J. Exp. Med. 183:1215-1228 (1996). В предпочтительном варианте осуществления изобретения проводят MLR, в котором множество плацентарных клеток контактирует с множеством иммунных клеток (например, лимфоцитами, например, CD3⁺, CD4⁺ и/или CD8⁺ T-лимфоцитами). Например, множество плацентарных клеток можно тестировать с помощью MLR-анализа, включающего в себя объединение CD4⁺ или CD8⁺ T-клеток, дендритных клеток (DC) и плацентарных клеток в соотношении примерно 10:1:2, где Т-клетки окрашивают красителем, таким как, например, CFSE, который переходит в дочерние клетки, и где Т-клетки оставляют пролиферировать примерно на 6 дней. Множество плацентарных клеток считается иммуносупрессирующим, если пролиферация Т-клеток в течение 6 дней в присутствии плацентарных клеток значительно снижена по сравнению с пролиферацией Т-клеток в присутствии DC и без плацентарных клеток. Для подобного MLR-анализа плацентарные клетки можно либо разморозить, либо собрать из культуры. Примерно 20000 плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, ресуспендируют в 100 мкл среды (RPMI 1640, 1 мМ HEPES-буфера, антибиотики и 5% смешанной человеческой сыворотки) и оставляют для прикрепления к дну лунки в течение 2 часов. CD4⁺ и/или CD8⁺ T-клетки выделяют из мононуклеарных клеток цельной периферической крови, используя магнитные шарики Miltenyi. Клетки окрашивают CFSE, и добавляют всего по 100000 Т-клеток (только (CD4⁺ T-клеток, только CD8⁺ T-клеток или равные количества CD4⁺ и CD8⁺ T-клеток) на лунку. Затем объем в лунке доводят до 200 мкл, и клетки оставляют для проведения MLR.

4.1.4 Лечение других легочных заболеваний и расстройств

Также настоящее изобретение относится к способам лечения легочных заболеваний, расстройств или патологических состояний, возникающих в результате других причин, включающим в себя введение индивидууму, имеющему такое заболевание, расстройство или патологическое состояние, например, в пораженное легкое указанного индивидуума, терапевтически эффективного количества плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток. Например, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способу лечения индивидуума, имеющего заболевание, расстройство или патологическое состояние, затрагивающее легкие, в котором указанное заболевание, расстройство или патологическое состояние легких является острым повреждением легких. В конкретных вариантах осуществления изобретения указанным острым повреждением легких является одно или несколько из физической травмы, поражения в результате лекарственной или химиотерапевтической токсичности (например, токсичности в результате лечения блеомицином, циклофосфамидом, нитрофурантоином, метотрексатом, комбинацией 5-фторурацила и терапии оксалиплатином, и т.п.), радиационного поражения, химического поражения, например, химического ожога, вдыхания дыма, воздействия токсичного вещества или пневмонии, вызванной действием химического агента.

В некоторых других вариантах осуществления изобретения указанное легочное заболевание, расстройство или патологическое состояние представляют собой повреждение легких, вызванное неопластическим или паранеопластическим заболеванием.

В других вариантах осуществления изобретения заболевание, расстройство или патологическое состояние, поражающее легкие, представляет собой вирусную или бактериальную инфекцию легких (например, пневмонию), инфекционное заболевание легких или кистозный фиброз.

В конкретных вариантах осуществления изобретения, заболевание, расстройство или патологическое состояние легких представляют собой заболевание легких в результате воздействия окружающей среды, гранулематозное заболевание, обструктивное заболевание, сосудистое заболевание, неопластическое образование или плевральное поражение.

4.1.5 Вторые терапевтические композиции и вторые методы лечения

В любом из вышеупомянутых способов лечения способ может включать в себя введение второй терапевтической композиции или второй метод лечения. Вторые терапевтические композиции или вторые методы лечения могут включать в себя некоторые вторые терапевтические композиции или вторые методы лечения, перечисленные выше для связанных с легкими заболеваний, расстройств или патологических состояний, описанных в разделах 4.1.2-4.1.4. Однако предполагается, что перечисление конкретных вторых терапевтических соединений или вторых методов лечения в способах лечения упомянутых выше конкретных заболеваний не является исключающим. Например, любое из заболеваний, расстройств или патологических состояний, описанных в настоящем документе, можно лечить с помощью любого из противовоспалительных соединений или иммуносупрессоров, описанных в настоящем документе.

В вариантах осуществления изобретения, в которых плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки, вводят с вторым терапевтическим агентом, например, вторым типом клеток, плацентарные клетки и второй терапевтический агент можно вводить одновременно или в разное время, например, введение можно проводить в интервале 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 20, 30, 40 или 50 минут, или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или 22 часа, или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанный второй метод лечения включает в себя иммуномодулирующее соединение, причем иммуномодулирующее соединение представляет собой соединение, имеющее структуру:

в которой один из X и Y является C=O, а другой из X и Y является C=O или CH₂, а R² представляет собой водород или низший алкил; или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат, сольват, клатрат, энантиомер, диастереомер, рацемат или смесь стереоизомеров. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения указанным иммуномодулирующим соединением является соединение, имеющее структуру:

в которой один из X и Y является C=O, а другой является CH₂ или C=O;

R¹ является H, (C₁-C₈)алкилом, (C₃-C₇)циклоалкилом, (C₂-C₈)алкенилом, (C₂-C₈)алкинилом, бензилом, арилом, (C₀-C₄)алкил-(C₁-C₆)гетероциклоалкилом, (C₀-C₄)алкил-(C₂-C₅)гетероарилом, C(O)R³, C(S)R³, C(O)OR⁴, (C₁-C₈)алкил-N(R⁶)₂, (C₁-C₈)алкил-OR⁵, (C₁-C₈)алкил-C(O)OR⁵, C(O)NHR³, C(S)NHR³, C(O)NR³R^3', C(S)NR³R^3' или (C₁-C₈)алкил-O(CO)R⁵;

R² является H, F, бензилом, (C₁-C₈)алкилом, (C₂-C₈)алкенилом или (C₂-C₈)алкинилом;

R³ и R^3' независимо представляют собой (C₁-C₈)алкил, (C₃-C₇)циклоалкил, (C₂-C₈)алкенил, (C₂-C₈)алкинил, бензил, арил, (C₀-C₄)алкил-(C₁-C₆)гетероциклоалкил, (C₀-C₄)алкил-(C₂-C₅)гетероарил, (C₀-C₈)алкил-N(R⁶)₂, (C₁-C₈)алкил-OR⁵, (C₁-C₈)алкил-C(O)OR⁵, (C₁-C₈)алкил-О(CO)R⁵ или C(O)OR⁵;

R⁴ представляет собой (C₁-C₈)алкил, (C₂-C₈)алкенил, (C₂-C₈)алкинил, (C₁-C₄)алкил-OR⁵, бензил, арил, (C₀-C₄)алкил-(C₁-C₆)гетероциклоалкил или (C₀-C₄)алкил-(C₂-C₅)гетероарил;

R⁵ представляет собой (C₁-C₈)алкил, (C₂-C₈)алкенил, (C₂-C₈)алкинил, бензил, арил или (C₂-C₅)гетероарил;

в каждом случае R⁶ является, независимо, H, (C₁-C₈)алкилом, (C₂-C₈)алкенилом, (C₂-C₈)алкинилом, бензилом, арилом, (C₂-C₅)гетероарилом или (C₀-C₈)алкил-C(O)O-R⁵, или R⁶-группы могут быть соединены с образованием гетероциклоалкильной группы;

n равно 0 или 1; и

* представляет собой хиральный атом углерода;

или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат, сольват, клатрат, энантиомер, диастереомер, рацемат или смесь стереоизомеров. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения указанным иммуномодулирующим соединением является соединение, имеющее структуру:

в которой:

один из X и Y является C=O, а другой является CH₂ или C=O;

R является H или CH₂OCOR';

(i) каждый из R¹, R², R³ или R⁴, независимо от других, является атомом галогена, алкилом с длиной цепи от 1 до 4 атомов углерода, или алкокси-группой с длиной цепи от 1 до 4 атомов углерода, или (ii) один из R¹, R², R³ или R⁴ является нитро-группой или -NHR⁵, а остальные из R¹, R², R³ или R⁴ являются атомами водорода;

R⁵ является водородом или алкилом с длиной цепи от 1 до 8 углеродов;

R⁶ является водородом, алкилом с длиной цепи от 1 до 8 углеродных атомов, бензо-, хлоро- или фторо-группой;

R' представляет собой R⁷-CHR¹⁰-N(R⁸R⁹);

R⁷ представляет собой м-фенилен или п-фенилен или -(C_nH_2n)-, где n имеет значения от 0 до 4;

каждый из R⁸ и R⁹ независимо друг от друга является водородом или алкилом с длиной цепи от 1 до 8 атомов углерода, или R⁸ и R⁹ совместно представляют собой тетраметилен, пентаметилен, гексаметилен или -CH₂CH₂X₁CH₂CH₂-, где X₁ представляет собой -O-, -S- или -NH-;

R¹⁰ является водородом, алкилом с длиной цепи до 8 атомов углерода или фенилом; и

* представляет собой хиральный атом углерода;

или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат, сольват, клатрат, энантиомер, диастереомер, рацемат или смесь стереоизомеров.

В более конкретных вариантах осуществления изобретения иммуномодулирующим соединением является 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)-пиперидин-2,6-дион (ланалидомид); 3-(4'-аминоизолиндолин-1'-он)-1-пиперидин-2,6-дион; 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-изоиндолин-1,3-дион (помалидомид); или α-(3-аминофталимидо)глутаримид (леналидомид).

Плацентарные стволовые клетки можно вводить индивидууму, страдающему от заболевания, расстройства или патологического состояния легких, в форме фармацевтической композиции, например, фармацевтической композиции, подходящей для внутривенных, внутримышечных или внутрибрюшинных инъекций. Плацентарные стволовые клетки можно вводить однократной дозой или несколькими дозами. При введении несколькими дозами, дозировки могут представлять собой часть терапевтической схемы, направленной на ослабление одного или нескольких острых симптомов заболевания, расстройства или патологического состояния легких, или могут представлять собой часть продолжительной терапевтической схемы, направленной на предупреждение или снижение тяжести хронического течения заболевания. В вариантах осуществления изобретения, в которых плацентарные стволовые клетки вводят совместно с вторым терапевтическим агентом или с вторым типом клеток, плацентарные стволовые клетки и второй терапевтический агент и/или второй тип стволовых клеток можно вводить одновременно или в разное время, например, введение можно проводить в интервале 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 или 50 минут, или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или 22 часа, или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней.

4.1.6 Введение плацентарных клеток

Введение плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, можно проводить любым способом, приемлемым с медицинской точки зрения. В конкретных вариантах осуществления изобретения плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки, вводят внутривенно, внутриартериально, парентерально, подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно и т.п. Плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки, можно вводить системно, или напрямую в пораженную область легкого. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки, вводят индивидууму с помощью ингаляции, например, в виде спрея, аэрозоля, с помощью внешней или механической вентиляции, или с помощью прямого нанесения (например, с помощью инъекции или местного нанесения) в часть легкого, например, трахею, бронхи, бронхиолы, дольку легкого, альвеолу и т.п.

Для введения in vivo плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки, можно ввести в состав фармацевтической композиции, как описано ниже.

В одном варианте осуществления изобретения индивидууму вводят дозу примерно 200 миллионов плацентарных клеток. Однако дозировка может меняться в соответствии с физическими параметрами индивидуума, например, весом, и может находиться в диапазоне от 1 миллиона до 10 миллиардов плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, на дозу, предпочтительно, от 10 миллионов и до 1 миллиарда на дозу, или от 100 миллионов до 50 миллионов плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, на дозу.

Введение в ходе курса лечения индивидуума, имеющего заболевание, расстройство или патологическое состояние легких, может включать в себя однократное введение плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, или многократное введение плацентарных стволовых клеток. Если в ходе курса лечения используют больше одного введения плацентарных клеток, индивидууму можно вводить одинаковое приблизительное количество плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, в одно введение, или индивидууму можно вводить различное количество плацентарных клеток. Например, в одном варианте осуществления изобретения индивидууму, страдающему от заболевания, расстройства или патологического состояния легких, вводят исходную, относительно большую дозу плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, в то время как следующие введения включают в себя введение относительно меньшего количества плацентарных клеток, например, примерно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% от числа клеток в исходной дозе.

4.2 ПЛАЦЕНТАРНЫЕ КЛЕТКИ И ПОПУЛЯЦИИ ПЛАЦЕНТАРНЫХ КЛЕТОК

Способы лечения заболеваний, расстройств или патологических состояний легких, к которым относится настоящее изобретение, включают в себя введение плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, индивидууму, имеющему заболевание, расстройство или патологическое состояние. Плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки, которые можно использовать в способах лечения, описанных в настоящем документе, и способы получения и культивирования таких клеток описаны, например, в патентах США №№ 7045148; 7255879; 7311904 и 7311905; и публикациях патентных заявок США №№ 2007/0275362 и 2008/0226595, раскрытие которых полностью включено в настоящее изобретение путем ссылки.

Плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки, могут иметь либо эмбриональное, либо материнское происхождение (то есть, могут иметь фенотип либо матери, либо эмбриона). Популяции плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, или популяции клеток, содержащих плацентарные клетки, могут включать в себя плацентарные клетки только эмбрионального либо материнского происхождения, или могут включать в себя смешанную популяцию плацентарных клеток как эмбрионального, так и материнского происхождения. Плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки, и популяции клеток, содержащие плацентарные клетки, можно идентифицировать и отобрать по морфологическим характеристикам, маркерам и параметрам культивирования, описанным ниже.

4.2.1 Физические и морфологические характеристики

Клетки, например, плацентарные стволовые клетки, которые можно использовать для лечения легочных заболеваний, расстройств или патологических состояний, раскрытых в настоящем документе, при культивировании в первичных культурах или в клеточной культуре прикрепляются к субстрату для культивирования тканей, например, поверхности емкости для культивирования клеток (например, пластику для культивирования тканей). Клетки в культуре в общем принимают фибробластоидный, звездчатый вид с рядом цитоплазматических выступов от центральной части клетки. Однако клетки морфологически отличаются от фибробластов, культивируемых в таких же условиях. Например, клетки обычно имеют большее число таких выступов по сравнению с фибробластами, выращиваемыми в таких же условиях. Также клетки морфологически отличаются от гематопоэтических стволовых клеток, которые обычно принимают более округлую (как булыжники) морфологию в культуре.

4.2.2 Маркеры клеточной поверхности, молекулярные и генетические маркеры

Выделенные плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки, и популяции выделенных плацентарных стволовых клеток, которые можно использовать в способах лечения, раскрытых в настоящем документе, представляют собой плацентарные или пуповинные клетки человека, прикрепляющиеся к пластику для культивирования тканей, которые имеют характеристики мультипотентных клеток или стволовых клеток и экспрессируют набор маркеров, которые можно использовать для идентификации и/или выделения клеток или популяций клеток, содержащих стволовые клетки. Выделенные плацентарные стволовые клетки и клеточные популяции, содержащие плацентарные стволовые клетки (то есть, две или несколько выделенных клеток), описанные в настоящем документе, включают клетки и клеточные популяции, полученные напрямую из плаценты или из любой ее части (например, амниона, хориона, плацентарных котиледонов и т.п.) или пуповины. Выделенные популяции плацентарных стволовых клеток также включают популяции (то есть, две или несколько) выделенных плацентарных стволовых клеток в культуре, и популяцию в емкости, например, в пакете для культивирования клеток.

Выделенные плацентарные стволовые клетки, описанные в настоящем документе, не являются полученными из костного мозга мезенхимными клетками, полученными из жировой ткани мезенхимными стволовыми клетками или мезенхимными клетками, полученными из пуповинной крови, плацентарной крови или периферической крови. Используемый в настоящем описании термин «плацентарные стволовые клетки» охватывает любые из стволовых клеток или мультипотентных стволовых клеток, описанных в этом разделе. Выделенные плацентарные стволовые клетки не являются трофобластами. Трофобласты в культуре обычно образуют многоядерные клетки, называемые синцитиотрофобластами; в отличие от этого плацентарные стволовые клетки не образуют многоядерных клеток в культуре, а, напротив, размножаются в виде популяции моноядерных клеток, аналогично фибробластам.

В некоторых вариантах осуществления плацентарные стволовые клетки представляют собой стволовые клетки. В некоторых других вариантах осуществления изобретения плацентарные стволовые клетки представляют собой выделенные мультипотентные клетки. В одном варианте осуществления изобретения, выделенные клетки имеют характеристики: CD34^-, CD10⁺ и CD105⁺, определяемые с помощью проточной цитометрии. В конкретном варианте осуществления изобретения, выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клетки являются стволовыми клетками. В другом конкретном варианте осуществления изобретения, выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клетки являются мультипотентными клетками. В другом конкретном варианте осуществления изобретения, выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клетки обладают способностью дифференцироваться в клетки нейронального фенотипа, клетки остеогенного фенотипа и/или клетки хондрогенного фенотипа. В другом конкретном варианте осуществления изобретения, выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клетки дополнительно являются CD200⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения, выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клетки дополнительно являются CD45^- или CD90⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения, выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клетки дополнительно имеют характеристики: CD45^- и CD90⁺, определяемые с помощью проточной цитометрии. В другом конкретном варианте осуществления изобретения, выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺, CD200⁺ клетки дополнительно имеют характеристики: CD45^- или CD90⁺, определяемые с помощью проточной цитометрии. В другом конкретном варианте осуществления изобретения, выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺, CD200⁺ клетки дополнительно имеют характеристики: CD45^- и CD90⁺, определяемые с помощью проточной цитометрии, то есть клетки являются CD34^-, CD10⁺, CD45^-, CD90⁺, CD105⁺ и CD200⁺. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанные CD34^-, CD10⁺, CD45^-, CD90⁺, CD105⁺, CD200⁺ клетки дополнительно являются CD80^- и CD86^-.

В конкретном варианте осуществления изобретения любые из CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клеток, описанных выше, дополнительно имеют одну или несколько из следующих характеристик: CD29⁺, CD38^-, CD44⁺, CD54⁺, SH3⁺ или SH4⁺. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения клетки дополнительно являются CD44⁺. В другом конкретном варианте любых CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клеток, описанных выше, клетки дополнительно имеют одну или несколько из следующих характеристик: CD117^-, CD133^-, KDR^- (VEGFR2^-), HLA-A,B,C⁺, HLA-DP,DQ,DR^- или PDL1⁺ (лиганд программируемой клеточной смерти 1), или любую их комбинацию.

В другом варианте осуществления CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клетки дополнительно имеют одну или несколько из следующих характеристик: CD13⁺, CD29⁺, CD33⁺, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD62E^-, CD62L^-, CD62P^-, SH3⁺ (CD73⁺), SH4⁺ (CD73⁺), CD80^-, CD86^-, CD90⁺, SH2⁺ (CD105⁺), CD106/VCAM⁺, CD117^-, CD144/VE-кадгерин^{низкое содержание}, CD184/CXCR4^-, CD200⁺, CD133^-, OCT-4⁺, SSEA3^-, SSEA4^-, ABC-p⁺, KDR^- (VEGFR2^-), HLA-A,B,C⁺, HLA-DP,DQ,DR^-, HLA-G⁺, или PDL1⁺ (лиганд программируемой клеточной смерти 1), или любую их комбинацию. В другом варианте осуществления CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клетки дополнительно являются CD13⁺, CD29⁺, CD33⁺, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54/ICAM⁺, CD62E^-, CD62L^-, CD62P^-, SH3⁺ (CD73⁺), SH4⁺ (CD73⁺), CD80^-, CD86^-, CD90⁺, SH2⁺ (CD105⁺), CD106A/VCAM^-, CD117^-, CD144/VE-кадгерин^{низкое содержание}, CD184/CXCR4^-, CD200⁺, CD 133^-, OCT-4⁺, SSEA3^-, SSEA4^-, ABC-p⁺, KDR^- (VEGFR2^-), HLA-A,B,C⁺, HLA-DP,DQ,DR^-, HLA-G⁺, и лиганд программируемой клеточной смерти 1 (PDL1)⁺.

В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки имеют одну или несколько из следующих характеристик: SSEA3^-, SSEA4^- или ABC-p⁺. Выделенные клетки могут также экспрессировать HLA-ABC (MHC-1). Эти маркеры можно использовать в любой комбинации для идентификации выделенных клеток, например, выделенных стволовых клеток, или выделенных мультипотентных клеток, и для того, чтобы отличить выделенные клетки от других типов клеток. Отсутствие экспрессии CD34, CD38 и/или CD45, например, указывает на то, что выделенные клетки не являются гематопоэтическими стволовыми клетками.

Также настоящее изобретение относится к популяциям выделенных клеток, или популяциям клеток, например, популяциям плацентарных клеток или пуповинных клеток, содержащим плацентарные стволовые клетки, например, обогащенным ими, которые можно использовать в способах лечения, раскрытых в настоящем документе. Предпочтительные популяции клеток, содержащие плацентарные стволовые клетки, которые можно использовать в способах лечения, раскрытых в настоящем документе, включают в себя, например, по меньшей мере, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% плацентарных стволовых клеток, например, выделенных CD10⁺, CD105⁺ и CD34^- клеток; то есть, по меньшей мере, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% клеток в указанной популяции являются плацентарными стволовыми клетками, например, выделенными CD10⁺, CD105⁺ и CD34^- клетками. В конкретном варианте осуществления изобретения, выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клетки дополнительно являются CD200⁺. В более конкретном варианте осуществления изобретения, выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺, CD200⁺ клетки дополнительно имеют характеристики: CD45^- или CD90⁺, определяемые с помощью проточной цитометрии. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения, выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺, CD200⁺ клетки дополнительно имеют характеристики: CD45^- и CD90⁺, определяемые с помощью проточной цитометрии. В более конкретном варианте осуществления изобретения, выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клетки, описанные выше, дополнительно имеют одну или несколько из следующих характеристик: CD29⁺, CD38^-, CD44⁺, CD54⁺, SH3⁺ или SH4⁺. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения, выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клетки или выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺, CD200⁺ клетки дополнительно являются CD44⁺. В конкретном варианте осуществления изобретения, любые из популяций клеток, содержащих выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клетки, описанные выше, дополнительно имеют одну или несколько из следующих характеристик: CD13⁺, CD29⁺, CD33⁺, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD62E^-, CD62L^-, CD62P^-, SH3⁺ (CD73⁺), SH4⁺ (CD73⁺), CD80^-, CD86^-, CD90⁺, SH2⁺ (CD105⁺), CD106/VCAM⁺, CD117^-, CD144/VE-кадгерин^{низкое содержание}, CD184/CXCR4^-, CD200⁺, CD 133^-, OCT-4⁺, SSEA3^-, SSEA4^-, ABC-p⁺, KDR^- (VEGFR2^-), HLA-A,B,C⁺, HLA-DP,DQ,DR^-, HLA-G⁺, or Programmed Death-1 Ligand (PDL1)⁺ или PDL1⁺ (лиганд программируемой клеточной смерти 1), или любую их комбинацию. В более конкретном варианте осуществления изобретения CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клетки дополнительно представляют собой CD13⁺, CD29⁺, CD33⁺, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54/ICAM⁺, CD62E^-, CD62L^-, CD62P^-, SH3⁺ (CD73⁺), SH4⁺ (CD73⁺), CD80^-, CD86^-, CD90⁺, SH2⁺ (CD105⁺), CD106/VCAM⁺, CD117^-, CD144/VE-кадгерин^{низкое содержание}, CD184/CXCR4^-, CD200⁺, CD133^-, OCT-4⁺, SSEA3^-, SSEA4^-, ABC-p⁺, KDR^- (VEGFR2^-), HLA-A,B,C⁺, HLA-DP,DQ,DR^-, HLA-G⁺, и лиганд программируемой клеточной смерти 1 (PDL1)⁺.

В некоторых вариантах осуществления изобретения плацентарные стволовые клетки, которые можно использовать в способах лечения, описанных в настоящем документе, являются выделенными клетками, которые имеют одну или несколько (или все) из следующих характеристик: CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺, SSEA3^-, SSEA4^-, OCT-4⁺, и ABC-p⁺; причем указанные выделенные клетки получены физическим и/или ферментативным разрушением плацентарной ткани или ткани пуповины. В конкретном варианте осуществления изобретения выделенные клетки являются OCT-4⁺ и ABC-p⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения выделенные клетки являются OCT-4⁺ и CD34^-, причем указанные выделенные клетки имеют, по меньшей мере, одну из следующих характеристик: CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SH3⁺, SH4⁺, SSEA3^- и SSEA4^-. В другом конкретном варианте осуществления изобретения, выделенные клетки являются OCT-4⁺, CD34^-, CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SH3⁺, SH4⁺, SSEA3^- и SSEA4^-. В другом варианте осуществления изобретения, выделенные клетки являются OCT-4⁺, CD34^-, SSEA3^- и SSEA4^-. В более конкретном варианте осуществления изобретения выделенные клетки являются OCT-4⁺ и CD34^-, и либо SH2⁺, либо SH3⁺. В более конкретном варианте осуществления изобретения, выделенные клетки являются OCT-4⁺, CD34^-, SH2⁺ и SH3⁺. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения, выделенные клетки являются OCT-4⁺, CD34^-, SSEA3^- и SSEA4^-, и либо SH2⁺, либо SH3⁺. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения, выделенные клетки являются OCT-4⁺ и CD34^-, и либо SH2⁺, либо SH3⁺, и имеют, по меньшей мере, одну из следующих характеристик: CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SSEA3^- или SSEA4^-. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения, выделенные клетки являются OCT-4⁺, CD34^-, CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SSEA3^- и SSEA4^-, и либо SH2⁺, либо SH3⁺.

В другом варианте осуществления изобретения плацентарные стволовые клетки, которые можно использовать в способах лечения, раскрытых в настоящем документе, являются SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺ и OCT-4⁺ клетками. В более конкретном варианте осуществления изобретения, выделенные клетки являются CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD54⁺, CD90⁺, CD34^-, CD45^-, SSEA3^- или SSEA4^-. В другом варианте осуществления изобретения, выделенные клетки являются SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺, SSEA3^- и SSEA4^-. В более конкретном варианте осуществления изобретения, выделенные клетки являются SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺, SSEA3^- и SSEA4^-, CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD54⁺, CD90⁺, OCT-4⁺, CD34^- или CD45^-.

В другом варианте осуществления изобретения плацентарные стволовые клетки, которые можно использовать в способах, раскрытых в настоящем документе, являются CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SH2⁺, SH3⁺ и SH4⁺; причем клетки дополнительно могут иметь одну или несколько из следующих характеристик: OCT-4⁺, SSEA3^- или SSEA4^-.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, плацентарные стволовые клетки, которые можно использовать в способах лечения, раскрытых в настоящем документе, являются CD200⁺ или HLA-G⁺. В конкретном варианте осуществления изобретения клетки являются CD200⁺ и HLA-G⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения клетки являются дополнительно CD73⁺ и CD105⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения клетки являются дополнительно CD34^-, CD38^- или CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления изобретения клетки являются дополнительно CD34^-, CD38^- и CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления изобретения клетки являются CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺ и CD105⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения выделенные CD200⁺ или HLA-G⁺ клетки способствуют образованию эмбрионоподобных тел в популяции плацентарных клеток, включающей в себя клетки, при условиях, позволяющих образование эмбрионоподобных тел. В другом конкретном варианте осуществления изобретения плацентарные стволовые клетки отделены от плацентарных клеток или пуповинных клеток, которые не являются стволовыми или мультипотентными клетками. В другом конкретном варианте осуществления изобретения плацентарные стволовые клетки отделены от плацентарных стволовых клеток, которые не имеют описанных выше маркеров.

В другом варианте осуществления изобретения клеточная популяция, которую можно использовать в способах лечения, описанных в настоящем документе, представляет собой выделенную популяцию клеток, содержащую CD200⁺, HLA-G⁺ плацентарные стволовые клетки, например, обогащенную ими. В конкретном варианте осуществления изобретения указанная популяция представляет собой популяцию плацентарных клеток. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанной популяцией является популяция пуповинных клеток. В различных конкретных вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере, примерно 10%, по меньшей мере, примерно 20%, по меньшей мере, примерно 30%, по меньшей мере, примерно 40%, по меньшей мере, примерно 50%, или, по меньшей мере, примерно 60% клеток в указанной клеточной популяции составляют выделенные CD200⁺, HLA-G⁺ клетки. Предпочтительно, чтобы, по меньшей мере, примерно 70% клеток в указанной клеточной популяции составляли выделенные CD200⁺, HLA-G⁺ клетки. Более предпочтительно, чтобы, по меньшей мере, примерно 80%, 90%, 95% или 99% указанных клеток составляли выделенные CD200⁺, HLA-G⁺ клетки. В конкретном варианте клеточных популяций указанные выделенные CD200⁺, HLA-G⁺ клетки являются также CD73⁺ и CD105⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные CD200⁺, HLA-G⁺ клетки являются также CD34^-, CD38^- или CD45^-. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные CD200⁺, HLA-G⁺ клетки являются дополнительно CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺ и CD105⁺. В другом варианте осуществления изобретения указанная клеточная популяция продуцирует одно или несколько эмбрионоподобных тел при культивировании в условиях, позволяющих образование эмбрионоподобных тел. В другом варианте осуществления изобретения CD200⁺, HLA-G⁺ клетки продуцируют одно или несколько эмбрионоподобных тел при культивировании в условиях, позволяющих образование эмбрионоподобных тел. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанная клеточная популяция отделена от клеток, которые не являются стволовыми или мультипотентными клетками. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные CD200⁺, HLA-G⁺ клетки отделены от плацентарных клеток или клеток пуповины, которые не экспрессируют эти маркеры.

В другом варианте осуществления изобретения плацентарные стволовые клетки, которые можно использовать в способах лечения, описанных в настоящем документе, являются выделенными CD73⁺, CD105⁺ и CD200⁺ клетками. В другом конкретном варианте осуществления изобретения клетки являются HLA-G⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения, выделенные клетки являются CD34^-, CD38^- или CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления изобретения, выделенные клетки являются CD34^-, CD38^- и CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления изобретения выделенные клетки являются CD34^-, CD38^-, CD45^- и HLA-G⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения выделенные CD73+, CD105⁺ и CD200⁺ клетки способствуют образованию одного или нескольких эмбрионоподобных тел в популяции плацентарных клеток или пуповинных клеток, содержащей плацентарные стволовые клетки, при культивировании популяции в условиях, позволяющих образование эмбрионоподобных тел. В другом конкретном варианте осуществления изобретения, выделенные плацентарные клетки отделены от плацентарных клеток или пуповинных клеток, которые не экспрессируют эти маркеры.

В другом варианте осуществления изобретения клеточная популяция, которую можно использовать в способах лечения, описанных в настоящем документе, является выделенной популяцией клеток, содержащей выделенные CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺ плацентарные стволовые клетки, например, обогащенной ими. В конкретном варианте осуществления изобретения указанная популяция представляет собой популяцию плацентарных клеток. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанной популяцией является популяция пуповинных клеток. В различных конкретных вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере, примерно 10%, по меньшей мере, примерно 20%, по меньшей мере, примерно 30%, по меньшей мере, примерно 40%, по меньшей мере, примерно 50%, или, по меньшей мере, примерно 60% клеток в указанной клеточной популяции составляют указанные CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺ клетки. В другом варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, примерно 70% указанных клеток в указанной клеточной популяции составляют выделенные CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺ клетки. В другом варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, примерно 80%, 90%, 95% или 99% клеток в указанной клеточной популяции составляют выделенные CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺ клетки. В конкретном варианте указанной клеточной популяции выделенные клетки являются HLA-G⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные клетки являются дополнительно CD34^-, CD38^- или CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления изобретения, выделенные клетки являются дополнительно CD34^-, CD38^- и CD45^-. В более конкретном варианте осуществления изобретения выделенные клетки являются дополнительно CD34^-, CD38^-, CD45^- и HLA-G⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанная клеточная популяция продуцирует одно или несколько эмбрионоподобных тел при культивировании в условиях, позволяющих образование эмбрионоподобных тел. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанная клеточная популяция отделена от клеток, которые не являются стволовыми клетками. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺ клетки отделены от плацентарных клеток или клеток пуповины, которые не экспрессируют эти маркеры.

В некоторых других вариантах осуществления изобретения плацентарные стволовые клетки представляют собой выделенные плацентарные или пуповинные клетки, которые имеют одну или несколько из следующих характеристик: CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺, SSEA3^-, SSEA4^-, OCT-4⁺, HLA-G⁺ или ABC-p⁺.В конкретном варианте осуществления изобретения клетки являются CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺, SSEA3^-, SSEA4^- и OCT-4⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения клетки являются CD10⁺, CD29⁺, CD34, CD38, CD45, CD54⁺, SH2⁺, SH3⁺, и SH4⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения клетки являются CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD54⁺, SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺ и OCT-4⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения клетки являются CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, HLA-G⁺, SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения клетки являются OCT-4⁺ и ABC-p⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения клетки являются SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺ и OCT-4⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения клетки являются OCT-4⁺, CD34^-, SSEA3^- и SSEA4^-. В конкретном варианте осуществления изобретения OCT-4⁺, CD34^-, SSEA3^- и SSEA4^- клетки являются дополнительно CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SH2⁺, SH3⁺, и SH4⁺. В другом варианте осуществления изобретения клетки являются OCT-4⁺ и CD34^-, и либо SH3⁺, либо SH4⁺. В другом варианте осуществления изобретения клетки являются CD34^- и либо CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD54⁺, CD90⁺, либо OCT-4⁺.

В другом варианте осуществления изобретения плацентарные стволовые клетки, которые можно использовать в способах лечения, описанных в настоящем документе, представляют собой выделенные CD200⁺ и OCT-4⁺ клетки. В конкретном варианте осуществления изобретения клетки являются CD73⁺ и CD105⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения клетки являются HLA-G⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные CD200⁺, OCT-4⁺ клетки являются CD34^-, CD38^- или CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные CD200⁺, OCT-4⁺ клетки являются CD34^-, CD38^- и CD45^-. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные CD200⁺, OCT-4⁺ клетки являются CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺ и HLA-G⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные CD200⁺, OCT-4⁺ клетки способствуют образованию одного или нескольких эмбрионоподобных тел популяцией плацентарных клеток или пуповинных клеток, содержащей плацентарные стволовые клетки, при культивировании популяции в условиях, позволяющих образование эмбрионоподобных тел. В другом конкретном варианте осуществления изобретения выделенные CD200⁺, OCT-4⁺ клетки отделены от плацентарных клеток, которые не являются стволовыми клетками или мультипотентными клетками. В другом конкретном варианте осуществления изобретения, выделенные CD200⁺, OCT-4⁺ клетки отделены от плацентарных клеток, которые не экспрессируют эти маркеры.

В другом варианте осуществления изобретения клеточная популяция, которую можно использовать в способах лечения, описанных в настоящем документе, является выделенной популяцией клеток, содержащей выделенные CD200⁺, OCT-4⁺ плацентарные стволовые клетки (например, обогащенной ими). В различных вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере, примерно 10%, по меньшей мере, примерно 20%, по меньшей мере, примерно 30%, по меньшей мере, примерно 40%, по меньшей мере, примерно 50% или, по меньшей мере, примерно 60% клеток в указанной клеточной популяции составляют выделенные CD200⁺, OCT-4⁺ клетки. В другом варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, примерно 70% указанных клеток составляют выделенные CD200⁺, OCT-4⁺ клетки. В другом варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, примерно 80%, 90%, 95% или 99% клеток в указанной клеточной популяции составляют указанные выделенные CD200⁺, OCT-4⁺ клетки. В конкретном варианте выделенных популяций указанные выделенные CD200⁺, OCT-4⁺ клетки являются дополнительно CD73⁺ и CD105⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные CD200⁺, OCT-4⁺ клетки являются дополнительно HLA-G⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные CD200⁺, OCT-4⁺ клетки являются дополнительно CD34^-, CD38^- и CD45^-. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные CD200⁺, OCT-4⁺ клетки являются дополнительно CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺ и HLA-G⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения клеточная популяция продуцирует одно или несколько эмбрионоподобных тел при культивировании в условиях, позволяющих образование эмбрионоподобных тел.

В другом варианте осуществления изобретения плацентарные стволовые клетки, которые можно использовать в способах лечения, описанных в настоящем документе, представляют собой выделенные CD73⁺, CD105⁺ и HLA-G⁺ клетки. В другом конкретном варианте осуществления изобретения, выделенные CD73⁺, CD105⁺ и HLA-G⁺ плацентарные клетки являются дополнительно CD34^-, CD38^- или CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления изобретения выделенные CD73⁺, CD105⁺ и HLA-G⁺ плацентарные клетки являются дополнительно CD34^-, CD38^- и CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления изобретения выделенные CD73⁺, CD105⁺ и HLA-G⁺ плацентарные клетки являются дополнительно OCT-4⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения выделенные CD73⁺, CD105⁺ и HLA-G⁺ плацентарные клетки являются дополнительно CD200⁺. В более конкретном варианте осуществления изобретения выделенные CD73⁺, CD105⁺ и HLA-G⁺ плацентарные клетки являются дополнительно CD34^-, CD38^-, CD45^-, OCT-4⁺ и CD200⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения, выделенные CD73⁺, CD105⁺ и HLA-G⁺ плацентарные клетки способствуют образованию одного или нескольких эмбрионоподобных тел в популяции плацентарных клеток, содержащей указанные клетки, при культивировании популяции в условиях, позволяющих образование эмбрионоподобных тел. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺ и HLA-G⁺ плацентарные клетки отделены от плацентарных клеток, которые не являются выделенными CD73⁺, CD105⁺ и HLA-G⁺ плацентарными клетками. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺ и HLA-G⁺ плацентарные клетки отделены от плацентарных клеток, которые не экспрессируют эти маркеры.

В другом варианте осуществления изобретения клеточная популяция, которую можно использовать в способах лечения, описанных в настоящем документе, является выделенной популяцией клеток, содержащей выделенные CD73⁺, CD105⁺ и HLA-G⁺ плацентарные стволовые клетки, например, обогащенной ими. В различных вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере, примерно 10%, по меньшей мере, примерно 20%, по меньшей мере, примерно 30%, по меньшей мере, примерно 40%, по меньшей мере, примерно 50% или, по меньшей мере, примерно 60% клеток в указанной популяции клеток составляют CD73⁺, CD105⁺ и HLA-G⁺ клетки. В другом варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, примерно 70% клеток в указанной популяции клеток составляют выделенные CD73⁺, CD105⁺ и HLA-G⁺ клетки. В другом варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, примерно 80%, 90%, 95% или 99% клеток в указанной популяции клеток составляют выделенные CD73⁺, CD105⁺ и HLA-G⁺ клетки. В конкретном варианте вышеупомянутых популяций указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺ и HLA-G⁺ клетки являются дополнительно CD34^-, CD38^- или CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺ и HLA-G⁺ клетки являются дополнительно CD34^-, CD38^- и CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺ и HLA-G⁺ клетки являются дополнительно OCT-4⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺ и HLA-G⁺ клетки являются дополнительно CD200⁺. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺ и HLA-G⁺ клетки являются дополнительно CD34^-, CD38^-, CD45^-, OCT-4⁺ и CD200⁺.

В другом варианте осуществления изобретения плацентарные стволовые клетки, которые можно использовать в способах лечения, описанных в настоящем документе, представляют собой выделенные клетки, которые являются CD73⁺ и CD105⁺ и способствуют образованию одного или нескольких эмбрионоподобных тел в популяции выделенных клеток, содержащей указанные CD73⁺, CD105⁺ клетки при культивировании указанной популяции в условиях, которые позволяют образование эмбрионоподобных тел. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺ клетки являются дополнительно CD34^-, CD38^- или CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺ клетки являются дополнительно CD34^-, CD38^- и CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺ клетки являются дополнительно OCT-4⁺. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺ клетки являются дополнительно OCT-4⁺, CD34^-, CD38^- и CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺ клетки отделены от плацентарных клеток или пуповинных клеток, которые не имеют этих характеристик.

В другом варианте осуществления изобретения клеточная популяция, которую можно использовать в способах лечения, описанных в настоящем документе, является популяцией клеток, содержащей выделенные плацентарные клетки (например, обогащенной ими), которые являются CD73⁺, CD105⁺ и способствуют образованию одного или нескольких эмбрионоподобных тел в популяции выделенных плацентарных клеток или пуповинных клеток, содержащей указанные клетки, при культивировании указанной популяции в условиях, которые позволяют образование эмбрионоподобных тел. В различных вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере, примерно 10%, по меньшей мере, примерно 20%, по меньшей мере, примерно 30%, по меньшей мере, примерно 40%, по меньшей мере, примерно 50% или, по меньшей мере, примерно 60% клеток в указанной популяции клеток составляют выделенные CD73⁺, CD105⁺ клетки. В другом варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, примерно 70% клеток в указанной популяции клеток составляют указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺ клетки. В другом варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, примерно 80%, 90%, 95% или 99% клеток в указанной популяции клеток составляют указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺ плацентарные клетки. В конкретном варианте вышеупомянутых популяций указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺ клетки являются дополнительно CD34^-, CD38^- или CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺ клетки являются дополнительно CD34^-, CD38^- и CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺ клетки являются дополнительно OCT-4⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺ клетки являются дополнительно CD200⁺. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺ клетки являются дополнительно CD34^-, CD38^-, CD45^-, OCT-4⁺ и CD200⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанная клеточная популяция отделена от плацентарных клеток, которые не экспрессируют эти маркеры.

В другом варианте осуществления изобретения плацентарные стволовые клетки, которые можно использовать в способах лечения, описанных в настоящем документе, представляют собой выделенные OCT-4⁺ клетки, которые способствуют образованию одного или нескольких эмбрионоподобных тел в популяции выделенных плацентарных клеток, содержащей указанные клетки, при культивировании в условиях, которые позволяют образование эмбрионоподобных тел. В конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные OCT-4⁺ плацентарные клетки являются дополнительно CD73⁺ и CD105⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные OCT-4⁺ плацентарные клетки являются дополнительно CD34^-, CD38^- или CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные OCT-4⁺ плацентарные клетки являются дополнительно CD200⁺. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные OCT-4⁺ плацентарные клетки являются дополнительно CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD34^-, CD38^- и CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные OCT-4⁺ плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки, отделены от плацентарных клеток, которые не являются OCT-4⁺ плацентарными клетками. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные OCT-4⁺ плацентарные клетки отделены от плацентарных клеток, которые не имеют этих характеристик.

В другом варианте осуществления изобретения клеточная популяция, которую можно использовать в способах лечения, описанных в настоящем документе, является популяцией клеток, содержащей выделенные плацентарные стволовые клетки (например, обогащенной ими), которые являются OCT-4⁺ и способствуют образованию одного или нескольких эмбрионоподобных тел в популяции выделенных плацентарных клеток или пуповинных клеток, содержащей указанные клетки, при культивировании указанной популяции в условиях, которые позволяют образование эмбрионоподобных тел. В различных вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере, примерно 10%, по меньшей мере, примерно 20%, по меньшей мере, примерно 30%, по меньшей мере, примерно 40%, по меньшей мере, примерно 50% или, по меньшей мере, примерно 60% клеток в указанной популяции клеток составляют указанные выделенные OCT-4⁺ клетки. В другом варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, примерно 70% клеток в указанной популяции клеток составляют указанные выделенные OCT-4⁺ клетки. В другом варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, примерно 80%, 90%, 95% или 99% клеток в указанной популяции клеток составляют указанные выделенные OCT-4⁺ клетки. В конкретном варианте вышеупомянутых популяций указанные выделенные OCT-4⁺ клетки являются дополнительно CD34^-, CD38^- или CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные OCT-4⁺ клетки являются дополнительно CD34^-, CD38^- и CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные OCT-4⁺ клетки являются дополнительно CD73⁺ и CD105⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные OCT-4⁺ клетки являются дополнительно CD200⁺. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные OCT-4⁺ клетки являются дополнительно CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD34^-, CD38^- и CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанная клеточная популяция отделена от плацентарных клеток или пуповинных клеток, которые не экспрессируют эти маркеры.

В другом варианте осуществления изобретения плацентарные стволовые клетки, которые можно использовать в способах лечения, описанных в настоящем документе, представляют собой выделенные HLA-A,B,C⁺, CD45^-, CD133^- и CD34^- плацентарные клетки. В другом варианте осуществления изобретения клеточная популяция, которую можно использовать в способах лечения, описанных в настоящем документе, является популяцией клеток, содержащей плацентарные стволовые клетки, причем по меньшей мере, примерно 70%, по меньшей мере, примерно 80%, по меньшей мере, примерно 90%, по меньшей мере, примерно 95% или, по меньшей мере, примерно 99% клеток в указанной выделенной популяции клеток составляют выделенные HLA-A,B,C⁺, CD45^-, CD133^- и CD34^- плацентарные стволовые клетки. В конкретном варианте осуществления изобретения указанная выделенная клетка или популяция выделенных клеток отделены от клеток, которые не являются HLA-A,B,C⁺, CD45^-, CD133^- и CD34^- клетками. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные плацентарные клетки не являются материнскими по своему происхождению. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанная выделенная популяция клеток по существу свободна от материнских компонентов; например, по меньшей мере, примерно 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанных клеток в указанной выделенной популяции клеток не являются материнскими по своему происхождению.

В другом варианте осуществления изобретения плацентарные стволовые клетки, которые можно использовать в способах лечения, описанных в настоящем документе, представляют собой выделенные CD10⁺, CD13⁺, CD33⁺, CD45^-, CD117^- и CD133^- клетки. В другом варианте осуществления изобретения клеточная популяция, которую можно использовать в способах лечения, описанных в настоящем документе, является популяцией клеток, содержащей плацентарные стволовые клетки причем по меньшей мере, примерно 70%, по меньшей мере, примерно 80%, по меньшей мере, примерно 90%, по меньшей мере, примерно 95% или, по меньшей мере, примерно 99% клеток в указанной популяции клеток составляют выделенные CD10⁺, CD13⁺, CD33⁺, CD45^-, CDl17^- и CD133^- плацентарные стволовые клетки. В конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные клетки или популяция выделенных клеток отделены от клеток, которые не являются указанными клетками. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные CD10⁺, CD13⁺, CD33⁺, CD45^-, CD117^- и CD133^- клетки не являются материнскими по своему происхождению, то есть имеют эмбриональный генотип. В другом конкретном варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, примерно 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанных клеток в указанной выделенной популяции клеток не являются материнскими по своему происхождению. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные клетки или выделенная популяция плацентарных клеток отделены от клеток, которые не имеют этих характеристик.

В другом варианте осуществления изобретения плацентарные стволовые клетки, которые можно использовать в способах лечения, описанных в настоящем документе, представляют собой выделенные CD10^-, CD33^-, CD44⁺, CD45^- и CD117^- клетки. В другом варианте осуществления изобретения клеточная популяция, которую можно использовать в способах лечения, описанных в настоящем документе, является популяцией клеток, содержащей выделенные плацентарные клетки (например, обогащенной ими) причем по меньшей мере, примерно 70%, по меньшей мере, примерно 80%, по меньшей мере, примерно 90%, по меньшей мере, примерно 95% или, по меньшей мере, примерно 99% клеток в указанной популяции клеток составляют выделенные CD10^-, CD33^-, CD44⁺, CD45^- и CD117^- плацентарные стволовые клетки. В конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные клетки или выделенная популяция клеток отделены от клеток, которые не являются указанными клетками. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные клетки не являются материнскими по своему происхождению. В другом конкретном варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, примерно 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанных клеток в указанной популяции клеток не являются материнскими по своему происхождению. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанная выделенная клетка или выделенная популяция плацентарных клеток отделена от клеток, которые не экспрессируют эти маркеры.

В другом варианте осуществления изобретения плацентарные стволовые клетки, которые можно использовать в способах лечения, описанных в настоящем документе, представляют собой выделенные CD10^-, CD13^-, CD33^-, CD45^- и CD117^- клетки. В другом варианте осуществления изобретения клеточная популяция, которую можно использовать в способах лечения, описанных в настоящем документе, является популяцией клеток, содержащей выделенные CD10^-, CD13^-, CD33^-, CD45^- и CD117^- плацентарные стволовые клетки (например, обогащенной ими), причем по меньшей мере, примерно 70%, по меньшей мере, примерно 80%, по меньшей мере, примерно 90%, по меньшей мере, примерно 95% или, по меньшей мере, примерно 99% клеток в указанной популяции составляют указанные CD10^-, CD13^-, CD33^-, CD45^- и CD117^- клетки. В конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные клетки или выделенная популяция клеток отделены от клеток, которые не являются указанными клетками. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные клетки не являются материнскими по своему происхождению. В другом конкретном варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, примерно 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанных клеток в указанной клеточной популяции не являются материнскими по своему происхождению. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные клетки или выделенная популяция клеток отделена от клеток, которые не имеют этих характеристик.

В другом варианте осуществления изобретения плацентарные стволовые клетки, которые можно использовать в способах лечения, описанных в настоящем документе, представляют собой HLA A,B,C⁺, CD45^-, CD34^- И CD133^- клетки, которые дополнительно являются CD10⁺, CD13⁺, CD38⁺, CD44⁺, CD90⁺, CD105⁺, CD200⁺ и/или HLA-G⁺, и/или отрицательными по CD117. В другом варианте осуществления изобретения клеточная популяция, которую можно использовать в способах лечения, описанных в настоящем документе, является выделенной популяцией клеток, содержащей выделенные плацентарные стволовые клетки (например, обогащенной ими), причем, по меньшей мере, примерно 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или примерно 99% указанных клеток в указанной клеточной популяции, являются плацентарными клетками, которые являются HLA A,B,C^-, CD45^-, CD34^- И CD133^-, и которые дополнительно положительны по CD10, CD13, CD38, CD44, CD90, CD105, CD200 и/или HLA-G, и/или отрицательны по CD117. В конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные клетки или выделенная популяция клеток отделены от клеток, которые не являются указанными клетками. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные плацентарные клетки не являются материнскими по своему происхождению. В другом конкретном варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, примерно 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанных клеток в указанной клеточной популяции не являются материнскими по своему происхождению. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные клетки или выделенная популяция клеток отделены от плацентарных клеток, которые не экспрессируют эти маркеры.

В другом варианте осуществления изобретения плацентарные стволовые клетки, которые можно использовать в способах лечения, описанных в настоящем документе, являются выделенными клетками, которые являются CD200⁺ и CD10⁺ по связыванию антител, и CD117^- как по связыванию антител, так и по данным ОТ-ПЦР. В другом варианте осуществления изобретения плацентарные стволовые клетки, которые можно использовать в способах лечения, раскрытых в настоящем документе, являются выделенными клетками, например, стволовыми клетками или мультипотентными клетками, которые являются CD10⁺, CD29^-, CD54⁺, CD200⁺, HLA-G⁺, HLA class I⁺ и β-2-микроглобулин⁺.

В другом варианте осуществления изобретения плацентарные стволовые клетки, которые можно использовать в способах лечения, описанных в настоящем документе, являются выделенными плацентарными клетками или пуповинными клетками, например, плацентарными стволовыми клетками, плацентарными мультипотентными клетками, пуповинными стволовыми клетками или пуповинными мультипотентными клетками, которые имеют одну или несколько из следующих характеристик: CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD45^-, CD54/ICAM⁺, CD62E^-, CD62L^-, CD62P^-, CD80^-, CD86^-, CD103^-, CD104^-, CD105⁺, CD106/VCAM⁺, CD144/VE-кадгерин^{низкое содержание}, CD184/CXCR4^-, β2-микроглобулин^{низкое содержание}, MHC-I^{низкое содержание}, MHC-II^-, HLA-G^{низкое содержание} и/или PDL1^{низкое содержание}. В конкретном варианте осуществления выделенные клетки, по меньшей мере, являются CD29⁺ и CD54⁺. В другом конкретном варианте осуществления выделенные клетки, по меньшей мере, являются CD44⁺ и CD106⁺. В другом конкретном варианте осуществления изобретения выделенные клетки, являются по меньшей мере, CD29⁺.

В другом варианте осуществления изобретения, клеточная популяция, которую можно использовать в способах лечения, описанных в настоящем документе, содержит выделенные плацентарные клетки и по меньшей мере, примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% клеток в указанной клеточной популяции являются выделенными плацентарными клетками, которые имеют одну или несколько из следующих характеристик: CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD45^-, CD54/ICAM⁺, CD62-E^-, CD62-L^-, CD62-P^-, CD80^-, CD86^-, CD103^-, CD104^-, CD105⁺, CD106/VCAM⁺, CD144/VE-кадгерин^{низкое содержание}, CD184/CXCR4^-, β2-микроглобулин^{низкое содержание}, HLA-I^{низкое содержание}, HLA-II^-, HLA-G^{низкое содержание} и/или PDL1^{низкое содержание}. В более конкретном варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% плацентарных стволовых клеток в указанной клеточной популяции являются CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD45^-, CD54/ICAM⁺, CD62E^-, CD62L^-, CD62P^-, CD80^-, CD86^-, CD103^-, CD104^-, CD105⁺, CD106/VCAM⁺, CD144/VE-кадгерин^{низкое содержание}, CD184/CXCR4^-, β2-микроглобулин^{низкое содержание}, MHC-I^{низкое содержание}, MHC-II^-, HLA-G^{низкое содержание} и/или PDL1^{низкое содержание}.

В другом варианте осуществления изобретения плацентарные стволовые клетки, которые можно использовать в способах лечения, описанных в настоящем документе, являются выделенными плацентарными клетками или пуповинными клетками (например, стволовыми клетками или мультипотентными клетками), которые имеют одну или несколько (или все) из следующих характеристик: CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺, SSEA3^-, SSEA4^-, OCT-4⁺ и ABC-p⁺, где ABC-p представляет собой плацентарный АВС-транспортный белок (также известный как белок резистентности к раку молочной железы (BCRP) и белок резистентности к митоксантрону (MXR)), причем указанные плацентарные стволовые клетки получены с помощью перфузии плаценты млекопитающего, например, человека, из которой удаляют пуповинную кровь и перфузируют, чтобы удалить оставшуюся кровь.

В другом варианте осуществления изобретения, плацентарные стволовые клетки, которые можно использовать в способах лечения, описанных в настоящем документе, являются выделенными плацентарными клетками или пуповинными клетками, причем экспрессия по меньшей мере, одного клеточного маркера в указанных клетках, по меньшей мере, в два раза выше его экспрессии в мезенхимной стволовой клетке (например, в полученной из костного мозга мезенхимной стволовой клетке) или дермальном фибробласте. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные клетки не являются материнскими по своему происхождению (то есть имеют эмбриональный генотип). В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные pare содержатся в клеточной популяции, причем, по меньшей мере, примерно 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% клеток в указанной клеточной популяции являются плацентарным стволовыми клетками, которые не являются материнскими по своему происхождению.

На основе профиля экспрессии некоторых генов было подтверждено, что выделенные плацентарные стволовые клетки и выделенные популяции плацентарных стволовых клеток отличаются от других клеток, например, дермальных фибробластов или мезенхимных стволовых клеток, например, мезенхимных стволовых клеток, полученных из костного мозга. Выделенные плацентарные стволовые клетки, описанные в настоящем документе, можно отличить например, от дермальных фибробластов или полученных из костного мозга мезенхимных стволовых клеток на основе экспрессии одного или нескольких генов, экспрессия которых значительно выше (например, статистически значительно выше, или в два раза выше) в плацентарных стволовых клетках по сравнению с дермальными фибробластами или полученными из костного мозга мезенхимными стволовыми клетками. В частности, плацентарные стволовые клетки можно отличить от мезенхимных стволовых клеток на основе экспрессии одного или нескольких генов, экспрессия которых значительно выше (то есть, по меньшей мере, в два раза выше) в плацентарных стволовых клетках относительно равного числа дермальных фибробластов или полученных из костного мозга мезенхимных стволовых клеток, причем одним или несколькими генами являются ACTG2, ADARB1, AMIG02, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, Cl1orf9, CD200, C0L4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, EL0VL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAM1, IER3, IGFBP7, ILIA, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, ZC3H12A, или любая их комбинация, при условии что клетки растут в равных условиях. Смотри, например, публикацию патентной заявки № 2007/0275362, раскрытие которой полностью включено в настоящее описание путем ссылки. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанные плацентарные стволовые клетки экспрессируют один или несколько генов (отличающихся по уровню экспрессии от дермальных фибробластов или полученных из костного мозга мезенхимных стволовых клеток) при культивировании в интервале от примерно 3 до примерно 35 удвоений популяции в среде, содержащей DMEM-LG (например, от Gibco); 2% фетальной телячьей сыворотки (например, от Hyclone Labs.); 1x раствор инсулин-трансферин-селена (ITS); 1x раствор линолевой кислоты-бычьего сывороточного альбумина (LA-BSA); 10^-9 M дексаметазона (например, от Sigma); 10^-4 M аскорбиновой кислоты 2-фосфат (например, от Sigma); фактор роста эпидермиса, 10 нг/мл (например, от R&D Systems); и тромбоцитарный фактор роста (PDGF-BB), 10 нг/мл (например, от R&D Systems). В конкретном варианте осуществления изобретения специфичным для плацентарных стволовых клеток геном является CD200.

Последовательности этих генов можно найти в базе данных GenBank под номерами доступа №№ NM_{_}001615 (ACTG2), ВС065545 (ADARB1), (NM_181847 (AMIG02), AY358590 (ARTS-1), BC074884 (B4GALT6), BC008396 (BCHE), BC020196 (Cllorf9), BC031103 (CD200), NM_001845 (C0L4A1), NM_001846 (COL4A2), BC052289 (CPA4), BC094758 (DMD), AF293359 (DSC3), NM_001943 (DSG2), AF338241 (EL0VL2), AY336105 (F2RL1), NM_018215 (FLJ10781), AY416799 (GATA6), BC075798 (GPR126), NM_016235 (GPRC5B), AF340038 (ICAM1), BC000844 (IER3), BC066339 (IGFBP7), BC013142 (IL1A), BT019749 (IL6), BC007461 (IL18), (BC072017) KRT18, BC075839 (KRT8), BC060825 (LIPG), BC065240 (LRAP), BCO10444 (MATN2), BCO11908 (MEST), BC068455 (NFE2L3), NM_014840 (NUAK1), AB006755 (PCDH7), NM_014476 (PDLIM3), BC126199 (PKP-2), BC090862 (RTN1), BC002538 (SERPINB9), BC023312 (ST3GAL6), BC001201 (ST6GALNAC5), BC126160 или BC065328 (SLC12A8), BC025697 (TCF21), BC096235 (TGFB2), BC005046 (VTN), и BC005001 (ZC3H12A), по состоянию на март 2008 года.

В более конкретном варианте осуществления изобретения указанные плацентарные стволовые клетки экспрессируют каждый из ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, Cllorf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, и ZC3H12A, на гораздо более высоком уровне, по сравнению с равным числом полученных из костного мозга мезенхимных стволовых клеток при выращивании их в одинаковых условиях.

Экспрессию вышеупомянутых референсных генов можно оценить с помощью стандартных методик. Например, можно индивидуально выбрать и сконструировать с помощью обычных методик пробы на основе последовательности гена (последовательностей генов). Экспрессию генов можно оценить, например, с использованием микроматрицы, содержащей пробы к одному или нескольким генам, например, используя микроматрицу Affymetrix GENECHIP® Human Genome U133A 2.0 или Affymetrix GENECHIP® Human Genome U133 Plus 2.0 (Santa Clara, California). Экспрессию этих генов можно оценивать, даже если последовательность для конкретного номера доступа в базе данных GenBank была исправлена, поскольку пробы, специфичные к исправленной последовательности можно легко генерировать с использованием хорошо известных стандартных методик.

Уровень экспрессии этих генов можно использовать для подтверждения идентичности популяции выделенных плацентарных клеток, для идентификации выделенной популяции клеток, как содержащей, по меньшей мере, большинство плацентарных стволовых клеток и т.п. Выделенные популяции клеток, содержащие плацентарные стволовые клетки, могут быть клональными например, могут представлять собой выделенные популяции плацентарных стволовых клеток, размноженные из одной выделенной плацентарной стволовой клетки, или представлять собой смешанную популяцию стволовых клеток, содержащую плацентарные стволовые клетки, например, популяцию клеток, содержащую плацентарные стволовые клетки, которые были размножены из множества выделенных плацентарных стволовых клеток, или могут представлять собой популяцию клеток, содержащую выделенные плацентарные стволовые клетки, описанные в настоящем документе, и, по меньшей мере, один другой тип клеток.

Уровень экспрессии этих генов можно использовать для отбора популяции выделенных плацентарных клеток. Например, популяцию клеток, например, клонально-размноженных клеток, можно отобрать, если экспрессия одного или нескольких генов из перечисленных выше, значительно превышает уровень экспрессии в образце из популяции клеток по сравнению с образцом из эквивалентной популяции мезенхимных стволовых клеток. Такой отбор может представлять собой отбор популяции из множества выделенных плацентарных клеточных популяций, из множества клеточных популяций, идентичность которых не известна, и т.д.

Выделенные плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки, можно отобрать исходя из уровня экспрессии указанных одного или нескольких генов, например, в контрольном образце мезенхимных стволовых клеток, например, уровня экспрессии указанных одного или нескольких генов в равном числе полученных из костного мозга мезенхимных стволовых клеток. В одном варианте осуществления изобретения уровень экспрессии указанных одного или нескольких генов в образце, содержащем равное число мезенхимных стволовых клеток, используют в качестве контроля. В другом варианте осуществления изобретения контролем для выделенных плацентарных клеток, исследуемых при определенных условиях, является числовая величина, представляющая уровень экспрессии указанных одного или нескольких генов в мезенхимных стволовых клетках при указанных условиях.

Выделенные плацентарные стволовые клетки, описанные в настоящем документе, имеют вышеупомянутые характеристики (например комбинации маркеров клеточной поверхности и/или профили экспрессии генов) в первичной культуре или при пролиферации в среде, содержащей DMEM-LG (Gibco), 2% фетальной телячьей сыворотки (FCS) (Hyclone Laboratories), 1x раствор инсулин-трансферин-селена (ITS), 1x раствор линолевой кислоты-бычьего сывороточного альбумина (LA-BSA), 10^-9 M дексаметазона (Sigma), 10^-4 M аскорбиновой кислоты 2-фосфат (Sigma), фактор роста эпидермиса (EGF) 10 нг/мл (R&D Systems), тромбоцитарный фактор роста (PDGF-BB) 10 нг/мл (например, от R&D Systems), и 100 ед. пенициллина/1000 ед. стрептомицина.

В другом конкретном варианте указанных выделенных плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, или популяций клеток, содержащих выделенные плацентарные клетки, указанные клетки или популяция были размножены, например, пассированием, по меньшей мере, примерно или не более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 раз, или они пролиферировали на протяжении, по меньшей мере, примерно или не более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 или 40 удвоений популяции. В другом конкретном варианте выделенных плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, или популяций клеток, содержащих выделенные плацентарные клетки, описанные в настоящем документе, указанные плацентарные клетки являются эмбриональными по своему происхождению (то есть имеют эмбриональный генотип).

В некоторых вариантах выделенных плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, указанные выделенные плацентарные клетки не дифференцируются в ходе культивирования в ростовой среде, то есть в среде, составленной для индукции пролиферации, например, в ходе пролиферации в ростовой среде. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки, не требуют питающего слоя для пролиферации. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные выделенные плацентарные клетки не дифференцируются в культуре в отсутствии питающего слоя только вследствие отсутствия питающего клеточного слоя.

В другом варианте осуществления изобретения плацентарные стволовые клетки, которые можно использовать в способах лечения, раскрытых в настоящем документе, являются выделенными плацентарными клетками или пуповинными клетками, причем большинство клеток являются положительными по альдегид-дегидрогеназе (ALDH) при оценке методом анализа альдегид-дегидрогеназной активности. Такие методы анализа известны в данной области (смотри, например, Bostian and Betts, Biochem. J., 173, 787, (1978)). В конкретном варианте осуществления изобретения в указанном ALDH-анализе используется ALDEFLUOR® (Aldagen, Inc., Ashland, Oregon) в качестве маркера альдегид-дегидрогеназной активности. В конкретном варианте осуществления изобретения указанное множество клеток составляет от примерно 3% до примерно 25% клеток в указанной популяции клеток. В другом варианте осуществления изобретения ALDH-активность у указанных плацентарных стволовых клеток, по меньшей мере, в три раза или, по меньшей мере, в пять раз выше, чем у популяции полученных из костного мозга мезенхимных стволовых клеток с одинаковым числом клеток и культивируемых в таких же условиях.

В некоторых вариантах любых популяций клеток, содержащих плацентарные стволовые клетки, описанные в настоящем документе, плацентарные стволовые клетки в указанных популяциях клеток по существу свободны от клеток, имеющих материнский генотип; например, по меньшей мере, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%, например, плацентарных стволовых клеток, в указанных популяциях имеют эмбриональный фенотип. В некоторых вариантах любых популяций клеток, содержащих плацентарные стволовые клетки, описанные в настоящем документе, популяции клеток, содержащих указанные плацентарные стволовые клетки, по существу свободны от клеток, имеющих материнский генотип; например, по меньшей мере, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% клеток (например, плацентарных стволовых клеток) в указанной популяции имеют эмбриональный генотип.

В конкретном варианте любых из вышеупомянутых выделенных, например, плацентарных стволовых клеток, или выделенных клеточных популяций, содержащих, например, плацентарные стволовые клетки, кариотип, например, плацентарных стволовых клеток, или, по меньшей мере, примерно 95% или примерно 99% клеток в указанной популяции является нормальным. В другом конкретном варианте любых из вышеупомянутых плацентарных стволовых клеток или клеточных популяций, плацентарные стволовые клетки или, например, плацентарные стволовые клетки в популяции клеток, не являются материнскими по своему происхождению.

Выделенные плацентарные стволовые клетки или выделенные популяции клеток, содержащие плацентарные стволовые клетки, например, состоящие по существу из плацентарных стволовых клеток, несущих любую из вышеупомянутых комбинаций маркеров, можно объединять в любом соотношении. Любые две или несколько из вышеупомянутых выделенных клеточных популяций можно объединить с образованием выделенной клеточной популяции. Например, выделенная популяция клеток может включать в себя первую популяцию клеток, определяемую одной из комбинаций маркеров, описанных выше, и вторую популяцию клеток, определяемую другой комбинацией маркеров из описанных выше, причем указанные первая и вторая популяции объединены в соотношении, например, примерно 1:99, 2:98, 3:97, 4:96, 5:95, 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 95:5, 96:4, 97:3, 98:2 или примерно 99:1. Аналогичным образом могут быть объединены любые три, четыре, пять или несколько из клеток или выделенных клеточных популяций.

Выделенные плацентарные стволовые клетки, которые можно использовать в способах лечения, раскрытых в настоящем документе, можно получить, например, разрушением ткани плаценты или ткани пуповины с помощью ферментативной обработки или без нее (смотри, раздел 5.5.3) или с помощью перфузии (смотри раздел 5.5.4). Например, популяции выделенных плацентарных стволовых клеток можно получить способом, включающим в себя перфузирование плаценты млекопитающего, из которой удаляют пуповинную кровь и перфузируют для удаления остаточной крови; перфузирование указанной плаценты перфузионным раствором; и сбор указанного перфузионного раствора, причем указанный перфузионный раствор после перфузии содержит популяцию плацентарных клеток, которая включает в себя выделенные плацентарные клетки; и выделение множества указанных выделенных плацентарных клеток из указанной популяции клеток. В конкретном варианте осуществления изобретения перфузионный раствор пропускают как через пуповинную вену, так и через пуповинные артерии, и собирают после того, как он выделяется из плаценты. В другом конкретном варианте осуществления изобретения перфузионный раствор пропускают через пуповинную вену и собирают из пуповинных артерий или пропускают через пуповинные артерии и собирают из пуповинной вены.

В различных вариантах осуществления изобретения, выделенные плацентарные стволовые клетки, содержащиеся в популяции клеток, полученной в результате перфузии плаценты, составляют, по меньшей мере, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или, по меньшей мере, 99,5% от указанной популяции плацентарных клеток. В другом конкретном варианте осуществления изобретения, выделенные плацентарные стволовые клетки, собранные перфузией, включают в себя эмбриональные и материнские клетки. В другом конкретном варианте осуществления изобретения, выделенные плацентарные клетки, собранные перфузией, являются, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или, по меньшей мере, на 99,5% эмбриональными клетками.

Другой конкретный вариант осуществления изобретения относится к композиции, содержащей популяцию выделенных плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, описанных в настоящем документе, собранных перфузией, причем указанная композиция включает в себя, по меньшей мере, часть перфузионного раствора, используемого для сбора выделенных плацентарных клеток.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенные популяции плацентарных стволовых клеток, описанные в настоящем документе, можно получить расщеплением ткани плаценты или ткани пуповины с помощью фермента, разрушающего ткань, чтобы получить популяцию клеток, включающую в себя плацентарные стволовые клетки, и выделением или по существу выделением множества плацентарных стволовых клеток из остатка указанных плацентарных или пуповинных клеток. Целую плаценту или пуповину (или любую их часть) можно подвергнуть ферментативному расщеплению для получения плацентарных стволовых клеток, описанных в настоящем документе. Например, в конкретных вариантах осуществления изобретения указанной тканью может быть целая плацента, амниотическая мембрана, хорион, комбинация амниона и хориона, пуповина или комбинация любых из вышеупомянутых тканей. В других конкретных вариантах осуществления изобретения ферментом, разрушающим ткань, является трипсин, коллагеназа, диспаза и т.п. В различных вариантах осуществления изобретения, выделенные плацентарные стволовые клетки, содержащиеся в популяции клеток, полученной расщеплением плаценты, составляют, по меньшей мере, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или, по меньшей мере, 99,5% от указанной популяции плацентарных клеток.

Выделенные популяции плацентарных стволовых клеток или выделенные популяции клеток, содержащих плацентарные стволовые клетки, описанные выше, могут включать примерно, по меньшей мере, или не более 1×10⁵, 5×10⁵, 110⁶×, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸, 1×10⁹, 5×10⁹, 1×10¹⁰, 5×10¹⁰, 1×10¹¹ или больше выделенных плацентарных клеток. Популяции выделенных плацентарных клеток, которые можно использовать в способах лечения, описанных в настоящем документе, включают в себя, по меньшей мере, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% жизнеспособных выделенных плацентарных клеток, определяемых, например, исключением трипанового синего.

4.2.3 Выращивание в культуре

Рост плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток, описанных в настоящем документе, как для любой клетки млекопитающего частично зависит от конкретной выбранной ростовой среды. При оптимальных условиях плацентарные стволовые клетки обычно удваиваются в числе за 1-5 дней. В ходе культивирования плацентарные стволовые клетки, приводимые в настоящем документе, прикрепляются к субстрату в культуре, например, к поверхности контейнера для культивирования тканей (например, пластику чашек для культивирования тканей, покрытому фибронектином пластику и т.п.) и образуют монослой.

Популяции выделенных плацентарных клеток, которые содержат плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки, при культивировании в соответствующих условиях могут образовывать эмбрионоподобные тела, то есть трехмерные кластеры клеток, растущие сверху слоя прикрепленных плацентарных стволовых клеток. Клетки в эмбрионоподобных телах экспрессируют маркеры, ассоциированные с очень ранними стволовыми клетками, например, OCT-4, Nanog, SSEA3 и SSEA4. Клетки в эмбрионоподобных телах обычно не прикреплены к культуральному субстрату, как прикреплены плацентарные стволовые клетки, описанные в настоящем документе, но остаются присоединенными к прикрепленным клеткам в ходе культивирования. Выживаемость клеток эмбрионоподобных тел зависит от плацентарных стволовых клеток, поскольку эмбрионоподобные тела не образуются в отсутствие плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток. Таким образом, прикрепленные плацентарные стволовые клетки способствуют росту одного или нескольких эмбрионоподобных тел в популяции плацентарных клеток, которая содержит плацентарные стволовые клетки. Не касаясь какой-либо определенной гипотезы, авторы полагают, что клетки эмбрионоподобных тел растут на прикрепленных плацентарных стволовых клетках аналогично тому, как эмбриональные стволовые клетки растут на питающем слое клеток. Мезенхимные стволовые клетки, например, полученные из костного мозга стволовые клетки, не образуют эмбрионоподобных тел в культуре.

4.3 СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛАЦЕНТАРНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

4.3.1 Композиция для сбора стволовых клеток

Плацентарные стволовые клетки можно собрать и выделить по способам, приведенным в настоящем описании. В общем, стволовые клетки получают из плаценты или пуповины млекопитающих с использованием физиологически приемлемого раствора, например, композиции для сбора стволовых клеток. Композиция для сбора стволовых клеток подробно описана в публикации патентной заявки США № 2007/0190042, раскрытие которой полностью включено в настоящее описание путем ссылки.

Композиция для сбора стволовых клеток может включать в себя любой физиологически приемлемый раствор, подходящий для сбора и/или культивирования стволовых клеток, например, солевой раствор (например, физиологический раствор, раствор Кребса, модифицированный раствор Кребса, раствор Игла, 0,9% NaCl и т.д.), культуральную среду (например, DMEM, HDMEM и т.д.) и т.п.

Композиция для сбора стволовых клеток может включать в себя один или несколько компонентов, которые служат для сохранения плацентарных стволовых клеток, то есть предупреждают смерть плацентарных стволовых клеток, или задерживают смерть плацентарных стволовых клеток, снижают число плацентарных клеток в популяции клеток, которые умирают и т.п., от времени сбора до времени культивирования. Такими компонентами могут быть, например, ингибитор апоптоза (например, каспазный ингибитор или JNK-ингибитор); вазодилатор (например, сульфат магния, противогипертоническое средство, атриальный натрийуретический пептид (ANP), адренокортикотропин, кортикотропин-рилизинг гормон, нитропруссид натрия, гидралазин, аденозина трифосфат, аденозин, индометацин или сульфат магния, ингибитор фосфодиэстераз и т.д.); ингибитор некроза (например, 2-(1H-индол-3-ил)-3-пентиламино-малеимид, пирролидиндитиокарбамат или клоназепам); ингибитор TNF-α; и/или перфторуглеродный переносчик кислорода (например, перфтороктилбромид, перфтордецилбромид и т.д.).

Композиция для сбора стволовых клеток может включать в себя один или несколько разрушающих ткани ферментов, например, металлопротеазу, сериновую протеазу, нейтральную протеазу, РНКазу или ДНКазу и т.п. Такие ферменты включают, но не ограничены этим, коллагеназы (например, коллагеназы I, II, III или IV, коллагеназу из Clostridium histolyticum и т.п.); диспазу, термолизин, эластазу, трипсин, LIBERASE™, гиалуронидазу и т.п.

Композиция для сбора стволовых клеток может включать в себя бактерицидно или бактериостатически эффективное количество антибиотика. В некоторых неограничивающих вариантах осуществления изобретения антибиотик является макролидом (например, тобрамицином), цефалоспорином (например, цефалексином, цефрадином, цефуроксимом, цефпрозилом, цефаклором, цефиксимом или цефадроксилом), кларитромицином, эритромицином, пенициллином (например, пенициллином V) или хинолоном (например, офлоксацином, ципрофлоксацином или норфлоксацином), тетрациклином, стрептомицином и т.п. В конкретном варианте осуществления изобретения антибиотик активен в отношении грамположительных и/или грамотрицательных бактерий, например, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и т.п.

Композиция для сбора стволовых клеток может также включать в себя одно или несколько из следующих соединений: аденозин (от примерно 1 мМ до примерно 50 мМ); D-глюкозу (от примерно 20 мМ до примерно 100 мМ); ионы магния (от примерно 1 мМ до примерно 50 мМ); макромолекулы с молекулярным весом выше 20000 дальтон, в одном варианте осуществления изобретения, присутствующие в количестве, достаточном для поддержания целостности эндотелия и выживаемости клеток (например, синтетический или природный коллоид, полисахарид, такой как декстран или полиэтиленгликоль, присутствующий в количестве от примерно 25 г/л до примерно 100 г/л, или от примерно 40 г/л до примерно 60 г/л); антиоксидант (например, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, глутатион, витамин С или витамин Е, присутствующие в количестве от примерно 25 мкМ до примерно 100 мкМ); восстанавливающий агент (например, N-ацетилцистеин, присутствующий в количестве от примерно 0,1 мМ до примерно 5 мМ); агент, который предупреждает вхождение кальция в клетки (например, верапамил, присутствующий в количестве от примерно 2 мкМ до примерно 25 мкМ); нитроглицерин (например, от примерно 0,05 г/л до примерно 0,2 г/л); антикоагулянт, в одном варианте осуществления изобретения присутствующий в количестве, достаточном для предупреждения свертывания остаточной крови (например, гепарин или гирудин, присутствующие в концентрации от примерно 1000 единиц/л до примерно 1000000 единиц/л); или содержащие амилорид соединения (например, амилорид, этилизопропиламилорид, гексаметиленамилорид, диметиламилорид или изобутиламилорид, присутствующие в количестве от примерно 1,0 мкМ до примерно 5 мкМ).

4.3.2 Сбор и обращение с плацентой и пуповиной

В общем, плаценту человека с пуповиной собирают непосредственно после ее выхода после родов. В предпочтительном варианте осуществления изобретения плаценту собирают после информированного согласия пациента и после сбора полной медицинской истории пациента, которая относится к плаценте. Предпочтительно, чтобы медицинская история сохранялась после родов. Такую медицинскую историю можно использовать для координации последующего применения плаценты/пуповины или стволовых клеток, собранных из нее. Например, плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки, можно использовать с учетом медицинской истории для персонифицированной медицинской помощи ребенку, с которым ассоциирована плацента и пуповина, или родителям, сиблингам или другим родственникам ребенка.

Перед выделением плацентарных стволовых клеток удаляют кровь из пуповины и плаценты. В некоторых вариантах осуществления изобретения после сбора плаценты собирают пуповинную и плацентарную кровь. Пуповинную кровь из плаценты собирают стандартным способом. Обычно кровь из плаценты удаляют самотеком с использованием иглы или канюли (смотри, например, Anderson, патент США № 5372581; Hessel et al., патент США № 5415665). Иглу или канюлю обычно помещают в пуповинную вену и плаценту мягко массируют, способствуя удалению пуповинной крови из плаценты. Такой сбор пуповинной крови можно осуществить с помощью коммерческой компании, например, LifeBank Inc., Cedar Knolls, N.J., ViaCord, Cord Blood Registry и Cryocell. В некоторых вариантах осуществления изобретения кровь из плаценты вытекает самотеком под действием силы тяжести без дальнейших манипуляций для минимизации разрушения ткани в ходе сбора пуповинной крови.

Обычно плаценту транспортируют из родильного зала в другое помещение, например, в лабораторию, для выделения пуповинной крови и сбора стволовых клеток, например, перфузией или разрушением ткани. Плаценту предпочтительно транспортировать в стерильном, термически изолированном устройстве для перевозки (поддерживающем температуру плаценты между 20-28°С), например, помещая плаценту с зажатым проксимальным концом пуповины в стерильный пластиковый пакет с застежкой zip-lock, который затем помещают в термически изолированный контейнер. В другом варианте осуществления изобретения плаценту транспортируют в наборе для сбора пуповинной крови по существу как описано в находящейся на стадии рассмотрения патентной заявке США № 2006/0060494, поданной 19-го сентября 2005, или в патенте США № 7147626. Предпочтительно доставить плаценту в лабораторию в интервале от четырех до двадцати четырех часов после родов. В некоторых вариантах осуществления изобретения перед выделением пуповинной крови зажимают проксимальный конец пуповины, предпочтительно, в пределах 4-5 см от вхождения в плацентарный диск. В некоторых других вариантах осуществления изобретения пуповину зажимают на удалении, например, близко к концу пуповины далеко от плаценты. В других вариантах осуществления изобретения пуповину зажимают после выделения пуповинной крови, но перед дальнейшей обработкой плаценты.

Плаценту и пуповину до выделения коллекции стволовых клеток можно хранить в стерильных условиях либо при комнатной температуре, либо при температуре от 5 до 25°C (градусов Цельсия). Перед перфузией плаценты для удаления любой остаточной пуповинной крови плаценту и пуповину можно хранить в течение периода времени, превышающего сорок восемь часов. Плаценту и пуповину предпочтительно хранить в растворе антикоагулянта при температуре от 5 до 25°C. Подходящие растворы антикоагулянтов хорошо известны в данной области. Например, можно использовать раствор гепарина или варфарина натрия. В предпочтительном варианте осуществления изобретения раствор антикоагулянта включает в себя раствор гепарина (например, 1% по весу в 1:1000 растворе). Плаценту и пуповину с удаленной кровью предпочтительно хранить не более 36 часов перед сбором клеток, например, плацентарных стволовых клеток.

Плаценту или ее часть, или пуповину млекопитающего после сбора и обработки обычно, как описано выше, можно обрабатывать любым известным в данной области способом, например, можно ее перфузировать или разрушить, например, расщеплением с использованием одного или нескольких разрушающих ткани ферментов для получения стволовых клеток.

4.3.3 Физическое разрушение и ферментативное расщепление ткани

В одном варианте осуществления изобретения стволовые клетки собирают из плаценты или пуповины млекопитающих физическим разрушением, например, ферментативным расщеплением, например, используя композицию для сбора стволовых клеток, описанную в разделе 4.3.1 выше. Например, находящиеся в контакте, например, с буфером, средой или композицией для сбора стволовых клеток, плаценту или ее часть, или пуповину, можно растолочь, нарезать, раскрошить, размолоть, измельчить, мацирировать и т.п., а ткань далее подвергнуть расщеплению одним или несколькими ферментами. Плаценту или ее часть, или пуповину, можно также физически разрушить и расщепить с помощью одного или нескольких ферментов, и полученный материал затем погрузить в буфер, среду или композицию для сбора стволовых клеток (или смешать с ними). Можно использовать любой способ физического разрушения, при условии, что способ разрушения сохраняет множество, более предпочтительно, большинство, и более предпочтительно, по меньшей мере, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% клеток в указанном органе живыми, что определяется, например, исключением трипанового синего.

Перед физическим разрушением и/или ферментативным расщеплением и выделением стволовых клеток плаценту или пуповину можно разделить на составляющие. Например, плацентарные стволовые клетки можно получить из амниотической мембраны, хориона, плацентарных котиледонов или любой их комбинации, или из части пуповины. В одном варианте осуществления изобретения плацентарные стволовые клетки получают из ткани плаценты, включающей в себя амнион и хорион, амнион-хорион или пуповину. Обычно плацентарные стволовые клетки можно получить разрушением небольшого блока ткани плаценты или ткани пуповины, например, блока ткани плаценты или ткани пуповины, объем которого составляет примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или примерно 1000 кубических миллиметров.

Предпочтительная композиция для сбора стволовых клеток включает в себя один или несколько разрушающих ткани ферментов. В случае ферментативного расщепления предпочтительно использовать комбинацию ферментов, например, комбинацию трипсина, коллагеназы и/или диспазы, необязательно включающей, гиалуронидазу, или комбинацию LIBERASE (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Ind.) и гиалуронидазы. Другие ферменты, которые можно использовать для разрушения ткани плаценты, включают папаин, дезоксирибонуклеазы, сериновые протеазы, такие как трипсин, химотрипсин или эластаза. Сериновые протеазы могут ингибироваться альфа-2-микроглобулином в сыворотке и, поэтому, используемая для расщепления среда обычно является бессывороточной. В процедурах ферментативного расщепления обычно используют EDTA и ДНКазу для увеличения эффективности выделения клеток. Продукт расщепления обычно разводят для того, чтобы избежать удерживания стволовых клеток в вязком продукте расщепления.

Можно использовать любую комбинацию расщепляющих ткани ферментов. Обычные концентрации расщепляющих ткани ферментов включают, например, 50-200 Ед/мл для коллагеназы I и коллагеназы IV, 1-10 Ед/мл для диспазы и 10-100 Ед/мл для эластазы. Для высвобождения плацентарных стволовых клеток протеазы можно использовать в комбинации, то есть две или несколько протеаз в одной реакции расщепления, или их можно использовать последовательно. Например, в одном варианте осуществления изобретения плаценту или ее часть, или пуповину, расщепляют сначала соответствующим количеством коллагеназы I в концентрации 2 мг/мл в течение 30 минут, с последующим расщеплением трипсином, 0,25%, в течение 10 минут при 37°С. Сериновые протеазы предпочтительно использовать последовательно после использования других ферментов.

В другом варианте осуществления изобретения ткань можно дополнительно разрушить добавлением хелатора, например, этиленгликоль-бис(2-аминоэтилэфир)-N,N,N'N'-тетрауксусной кислоты (EGTA) или этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), в композицию для сбора стволовых клеток или в раствор для разрушения и/или расщепления ткани перед выделением стволовых клеток с использованием композиции для сбора стволовых клеток.

Очевидно, что если целая плацента или участок плаценты, содержащие как эмбриональные, так и материнские клетки (например, когда участок плаценты включает в себя хорион или котиледоны), собранные плацентарные стволовые клетки будут включать в себя смесь плацентарных стволовых клеток как эмбрионального, так и материнского происхождения. Если участок плаценты не содержит или содержит незначительное количество материнских клеток (например, амнион), то собранные плацентарные стволовые клетки будут содержать практически исключительно эмбриональные плацентарные стволовые клетки.

4.3.4 Перфузия плаценты

Плацентарные стволовые клетки также можно получить перфузией плаценты млекопитающего. Способы перфузии плацент млекопитающих для получения стволовых клеток раскрыты, например, в, патентах США №№ 7045148 и 7468276, и публикации патентной заявки США № 2007/0190042, автора Hariri, раскрытие которых таким образом полностью включено путем ссылки.

Плацентарные стволовые клетки можно собирать перфузией, например, через сосудистую систему плаценты, с использованием, например, композиции для сбора стволовых клеток, в качестве перфузионного раствора. В одном варианте осуществления настоящего изобретения плаценту млекопитающего перфузируют, пропуская перфузионный раствор через любую или обе из пуповинной артерии и пуповинной вены. Прохождение перфузионного раствора через плаценту может осуществляться, например, самотеком. Предпочтительно принудительное прохождение перфузионного раствора через плаценту с использованием насоса, например, перистальтического насоса. В пуповинную вену можно, например, вставить канюлю, например, тефлоновую® или пластиковую канюлю, которая соединена со стерильным соединительным аппаратом, таким как стерильная трубка. Стерильный соединительный аппарат соединен с устройством для перфузии. В некоторых вариантах осуществления изобретения в сосуды пуповины вставляют канюлю близко к плаценте, например, в пределах 2-3 сантиметров от плаценты; в других вариантах осуществления изобретения канюлю вставляют в сосуды пуповины далеко от плаценты, например, на расстоянии 2-3 сантиметров от конца пуповины, на максимальном удалении от плаценты.

В процессе приготовления к перфузии плаценту предпочтительно ориентировать (например, подвешивать) таким образом, чтобы пуповинная артерия или пуповинная вена были расположены в высшей точке плаценты. Плаценту можно перфузировать, пропуская перфузионную жидкость, например, композицию для сбора плацентарных клеток, приведенную в настоящем документе, через сосудистую систему плаценты или через сосудистую систему плаценты и окружающую ткань. В одном варианте осуществления изобретения пуповинную артерию и пуповинную вену соединяют одновременно с пипеткой, которая соединена через гибкий соединительный элемент с резервуаром перфузионного раствора. Перфузионный раствор пропускают через пуповинную вену и артерию. Перфузионный раствор выходит из кровеносных сосудов и/или проходит через их стенки в окружающие ткани плаценты, и его собирают в подходящую открытую емкость с поверхности плаценты, которая прикреплена к матке матери в течение беременности. Перфузионный раствор можно также ввести через пуповинное отверстие и позволить вытекать или просачиваться через отверстия в стенке плаценты, которая соприкасается с стенкой матки. В другом варианте осуществления изобретения перфузионный раствор пропускают через пуповинные вены и собирают из пуповинной артерии или пропускают через пуповинную артерию и собирают из пуповинных вен.

В одном варианте осуществления изобретения проксимальный конец пуповины зажимают в течение перфузии и, более предпочтительно, зажимают в пределах 4-5 см от вхождения пуповины в плацентарный диск.

Первая фракция перфузионной жидкости из плаценты млекопитающего в ходе процесса удаления крови обычно окрашена остаточными красными кровяными клетками из пуповинной крови и/или плацентарной крови. Перфузионная жидкость обесцвечивается по мере проведения перфузии и вымывания остаточных клеток пуповинной крови из плаценты. Для первичного удаления крови из плаценты обычно достаточно от 30 до 100 мл перфузионной жидкости, но можно использовать большее или меньшее количество перфузионной жидкости в зависимости от наблюдаемых результатов.

Объем перфузионной жидкости, используемой для сбора плацентарных стволовых клеток, может варьировать в зависимости от числа стволовых клеток, которые необходимо собрать, размера плаценты, числа сборов, которые необходимо провести из одной плаценты и т.д. В различных вариантах осуществления изобретения объем перфузионной жидкости может составлять от 50 мл до 5000 мл, от 50 мл до 4000 мл, от 50 мл до 3000 мл, от 100 мл до 2000 мл, от 250 мл до 2000 мл, от 500 мл до 2000 мл или от 750 мл до 2000 мл. Обычно, после удаления крови плаценту перфузируют 700-800 мл перфузионной жидкости.

Плаценту можно перфузировать множество раз в течение нескольких часов или нескольких дней. Если плаценту перфузируют несколько раз, то ее можно хранить или культивировать в асептических условиях в контейнере или другом подходящем сосуде и перфузировать композицией для сбора стволовых клеток или стандартным перфузионным раствором (например, физиологическим солевым раствором, таким как фосфатно-солевой буфер («PBS»)) в присутствии антикоагулянта (например, гепарина, варфарина натрия, кумарина, бисгидроксикумарина) или без него, и/или в присутствии противомикробного агента (например, β-меркаптоэтанола (0,1 мМ); антибиотиков, таких как стрептомицин (например, в концентрации 40-100 мкг/мл), пенициллина (например, в концентрации 40 Ед/мл), амфотерицина В (например, в концентрации 0,5 мкг/мл)). В одном варианте осуществления изобретения выделенную плаценту, не собирая перфузат, сохраняют или культивируют в течение времени таким образом, что плацента сохраняется или культивируется в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 часов, либо 2 или 3, или более дней перед перфузией и сбором перфузата. Плаценту после перфузии можно сохранять на протяжении одного или нескольких дополнительных отрезков времени, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или более часов; и перфузировать второй раз с использованием, например, 700-800 мл перфузионной жидкости. Плаценту можно перфузировать 1, 2, 3, 4, 5 или большее число раз, например, каждые 1, 2, 3, 4, 5 или 6 часов. В предпочтительном варианте осуществления изобретения перфузию плаценты и сбор перфузионного раствора, например, композиции для сбора стволовых клеток, например, повторяют до тех пор пока число полученных выделяемых клеток с ядром падает до количества 100 клеток/мл. Перфузаты, полученные в разное время, можно дополнительно индивидуально обработать для выделения зависимых от времени популяций клеток, например, стволовых клеток. Перфузаты, полученные в разное время, также можно объединить.

Не касаясь какой-либо определенной теории, авторы полагают, что после удаления крови и достаточного времени перфузии плаценты стволовые клетки мигрируют в обескровленные и перфузированные капилляры плаценты и пуповины, откуда их собирают, предпочтительно, смывая в емкость для сбора с помощью перфузии. Перфузия выделенной плаценты служит не только для удаления остаточной пуповинной крови, но также обеспечивает плаценту соответствующими питательными веществами, включая кислород. Плаценту можно культивировать и перфузировать в растворе, аналогичном тому, который используют для удаления остаточных клеток пуповинной крови, предпочтительно, без добавления антикоагулянтов.

Результатом описанной в настоящем документе перфузии является коллекция значительно большего количества стволовых клеток по сравнению с числом клеток, получаемых из плаценты млекопитающего, не перфузированной указанным раствором и не обработанной иным образом для получения стволовых клеток (например, с использованием разрушения ткани, например, ферментативного расщепления). В этом контексте «значительно больше» означает, по меньшей мере, на 10% больше. Перфузия дает значительно больше стволовых клеток по сравнению, например, с числом стволовых клеток, которые получают в результате культивирования среды, в которой культивировали плаценту или ее часть.

Стволовые клетки можно выделить из плаценты перфузией раствором, содержащим одну или несколько протеаз или других разрушающих ткани ферментов. В конкретном варианте осуществления изобретения плаценту или ее часть (например, амниотическую мембрану, амнион и хорион, плацентарную дольку или котиледон, или любую комбинацию из вышеперечисленного) помещают на 25-37°С и инкубируют с одним или несколькими разрушающими ткани ферментами в 200 мл культуральной среды в течение 30 минут. Собирают клетки из перфузата, помещают их на 4°С и промывают холодной ингибиторной смесью, содержащей 5 мМ EDTA, 2 мМ дитиотриэтола, и 2 мМ бета-меркаптоэтанола. Стволовые клетки промывают через несколько минут холодной (например, 4°С) композицией для сбора клеток, описанной в настоящем документе.

Очевидно, что перфузия с использованием «кюветного» способа, то есть, в котором перфузат собирают после его выхода из материнской стороны плаценты, дает в результате смесь эмбриональных и материнских клеток. В результате клетки, собранные этим способом, включают в себя смешанную популяцию плацентарных стволовых клеток как эмбрионального, так и материнского происхождения. В отличие от этого перфузия, проводимая только через сосудистую систему плаценты, в которой перфузионную жидкость пропускают через один или два плацентарных сосуда и собирают только через оставшиеся сосуды, в результате дает коллекцию популяции плацентарных стволовых клеток практически исключительно эмбрионального происхождения.

4.3.5 Выделение, сортинг и характеристика плацентарных стволовых клеток

Стволовые клетки из плаценты или пуповины млекопитающего, полученные либо перфузией, либо ферментативным расщеплением, можно первично очистить от (то есть отделить от) других клеток центрифугированием в градиенте Фиколла. Для такого центрифугирования можно следовать любому стандартному протоколу в отношении скорости центрифугирования и т.д. В одном варианте осуществления изобретения, например, клетки, собранные из плаценты или пуповины, выделяют из перфузата центрифугированием при 5000×g в течение 15 минут при комнатной температуре, которое отделяет клетки от, например, загрязняющих дебриса и тромбоцитов. В другом варианте осуществления изобретения перфузат из плаценты концентрируют до примерно 200 мл, аккуратно наслаивают на Фиколл и центрифугируют при 1100×g в течение 20 минут при 22°С и собирают слой клеток на границе фаз с низкой плотностью для дальнейшей обработки.

Клеточные осадки можно ресуспендировать в свежей композиции для сбора стволовых клеток или среде, подходящей для поддержания стволовых клеток, например, бессывороточной IMDM-среде, содержащей 2 Ед/мл гепарина и 2 мМ EDTA (GibcoBRL, NY). Всю фракцию мононуклеарных клеток можно выделить, например, с использованием Lymphoprep (Nycomed Pharma, Oslo, Norway), следуя процедуре, рекомендованной изготовителем.

Используемый в настоящем описании термин «выделение» плацентарных стволовых клеток означает удаление, по меньшей мере, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% клеток, с которыми стволовые клетки в норме ассоциированы в интактных плаценте или пуповине млекопитающего. Стволовая клетка из органа считается «выделенной», когда она присутствует в популяции клеток, которая содержит менее 50% клеток, с которыми стволовая клетка обычно ассоциирована в интактном органе.

Плацентарные стволовые клетки, полученные перфузией или ферментативным расщеплением, можно, например, дополнительно или первично выделить с помощью дифференциальной трипсинизации, используя, например, 0,05%-ный раствор трипсина с 0,2% EDTA (Sigma, St. Louis MO). Дифференциальная трипсинизация является возможной, поскольку плацентарные стволовые клетки и пуповинные стволовые клетки обычно открепляются от пластиковой поверхности в течение примерно пяти минут, в то время как другие прикрепленные популяции обычно требуют более чем 20-30 минутной инкубации. Открепленные клетки можно собрать после трипсинизации и нейтрализации трипсина, используя, например, нейтрализующий трипсин раствор (TNS, Cambrex). В одном варианте выделения прикрепленных клеток аликвоты, например, по 5-10×10⁶ клеток помещают в каждый из нескольких флаконов Т-75, предпочтительно, покрытых фибронектином. В таком варианте осуществления клетки можно культивировать в доступной в продаже среде для роста мезенхимных стволовых клеток (MSCGM) (Cambrex) в инкубаторе для культивирования тканей (при 37°C, в 5% CO₂). Через 10-15 дней неприкрепленные клетки удаляют из флаконов промыванием PBS. PBS затем заменяют на MSCGM. Предпочтительно проверять флаконы ежедневно на присутствие различных типов прикрепленных клеток и, в частности, на идентификацию и размножение кластеров фибробластоидных клеток.

Число и тип клеток, собираемых из плаценты млекопитающего, можно контролировать, например, измеряя изменения в морфологии и маркерах клеточной поверхности с использованием стандартных методик детекции клеток, таких как проточная цитометрия, клеточный сортинг, иммуноцитохимия (например, окрашивание тканеспецифичными или специфичными к клеточным маркерам антителами), флуоресцентно-активированный клеточный сортинг (FACS), магнитно-активированный клеточный сортинг (MACS), оценивая морфологию клеток с использованием световой или конфокальной микроскопии и/или измеряя измерения экспрессии генов с использованием методик, хорошо известных в данной области, таких как ПЦР и анализ уровня экспрессии генов. Эти методики также можно использовать для идентификации клеток, которые являются положительными по одному или нескольким конкретным маркерам. Например, используя антитела к CD34, можно определить с помощью вышеперечисленных методик, содержит ли клетка детектируемое количество CD34; если так, то клетка является CD34⁺. Аналогично, если клетка продуцирует достаточное количество РНК OCT-4, детектируемое с помощью ОТ-ПЦР, или значительно больше РНК ОСТ-4 чем взрослая клетка, то клетка является OCT-4⁺. Антитела к маркерам клеточной поверхности (например, CD-маркерам, таким как CD34) и последовательности генов, специфичных для стволовых клеток, таких как OCT-4, хорошо известны в данной области.

Плацентарные стволовые клетки, например, клетки, которые были выделены с помощью разделения в градиенте плотности Фиколла, дифференциального прикрепления или их комбинации, можно отсортировать, используя флуоресцентно-активированный клеточный сортер (FACS). Флуоресцентно-активированный клеточный сортинг (FACS) представляет собой хорошо известный способ разделения частиц, включая клетки, на основе их флуоресцентных свойств (Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151:150-165). Возбуждение лазером флуоресцентных элементов в индивидуальных частицах дает в результате небольшой электрический заряд, позволяющий электромагнитное разделение положительных и отрицательных частиц из смеси. В одном варианте осуществления изобретения антитела или лиганды, специфичные к маркерам клеточной поверхности, имеют различные флуоресцентные метки. Клетки пропускают через клеточный сортер, обеспечивающий возможность разделения клеток на основе их способности связывать используемые антитела. Отсортированные с помощью FACS частицы могут непосредственно помещаться в индивидуальные лунки 96-луночных или 384-луночных планшетов для облегчения разделения и клонирования.

В одной схеме сортинга стволовые клетки из плаценты или пуповины сортируют, исходя из экспрессии маркеров CD34, CD38, CD44, CD45, CD73, CD105 и/или HLA-G; а именно, отсутствия CD34, CD38 и CD45, и присутствия CD44, CD73, CD105 и/или HLA-G. Эту процедуру можно выполнить совместно с процедурами для отбора стволовых клеток на основе их характеристик прикрепления в культуре. Например, селекцию стволовых клеток на основе их характеристик прикрепления можно выполнить до или после сортинга на основе экспрессии маркеров. В одном варианте осуществления изобретения, например, клетки первоначально сортируют, исходя из их экспрессии CD34; клетки CD34^- удерживаются, и отделяют клетки, которые являются, например, CD200⁺HLA-G⁺, от всех других CD34^- клеток. В другом варианте осуществления изобретения клетки из плаценты отделяют на основе их экспрессии маркеров CD200 и/или HLA-G; например, клетки, имеющие любой из этих маркеров, выделяют для дальнейшего использования. В конкретном варианте осуществления изобретения клетки, которые экспрессируют, например, CD200 и/или HLA-G можно дополнительно отсортировать, исходя из их экспрессии CD73 и/или CD105, или эпитопов, узнаваемыми антителами SH2, SH3 или SH4, или отсутствия экспрессии CD34, CD38 или CD45. Например, в одном варианте осуществления изобретения плацентарные клетки и/или пуповинные клетки сортируют исходя из экспрессии или отсутствия экспрессии CD200, HLA-G, CD73, CD105, CD34, CD38 и CD45, и клетки, которые являются CD200⁺, HLA-G⁺, CD73⁺, CD105⁺, CD34^-, CD38^- и CD45^- выделяют из других клеток для дальнейшего использования.

В другом варианте осуществления изобретения для разделения клеток можно использовать магнитные шарики. Клетки можно сортировать с использованием методики магнитно-активированного клеточного сортинга (MACS), способа для разделения частиц на основе их способности связывать магнитные частицы (0,5-100 мкм в диаметре). С магнитными микросферами можно провести ряд полезных модификаций, включая ковалентное добавление антител, которые специфично узнают конкретную молекулу клеточной поверхности или гаптен. Затем шарики смешивают с клетками, позволяя осуществиться связыванию. Затем клетки пропускают через магнитное поле для отделения клеток, имеющих специфичный маркер клеточной поверхности. В одном варианте осуществления изобретения эти клетки можно затем выделить и повторно смешать с магнитными шариками, соединенными с антителом против дополнительных маркеров клеточной поверхности. Клетки снова пропускают через магнитное поле, выделяя клетки, которые связываются с двумя антителами. Такие клетки можно затем разнести по отдельным емкостям, таким как микротитровочные планшеты для клонального выделения.

Плацентарные стволовые клетки также можно характеризовать и/или отсортировать на основе характеристик морфологии и роста клеток. Например, плацентарные стволовые клетки можно характеризовать как имеющие, например, фибробластоидный вид в культуре (и/или отобранные на его основе). Плацентарные стволовые клетки также можно характеризовать, как имеющие и/или отобранные на основе их способности формировать эмбрионоподобные тела. В одном варианте осуществления изобретения, например, плацентарные клетки или пуповинные клетки, которые имеют фибробластоидную форму, экспрессируют CD73 и CD105, и продуцируют одно или несколько эмбрионоподобных тел в культуре, выделяют из других плацентарных клеток или пуповинных клеток. В другом варианте осуществления изобретения OCT-4⁺ плацентарные клетки, которые продуцируют одно или несколько эмбрионоподобных тел в культуре, выделяют из других плацентарных тел.

Плацентарные стволовые клетки можно оценивать по жизнеспособности, пролиферативному потенциалу и долговечности с использованием стандартных методик, известных в данной области, таких как исключение трипанового синего, поглощение флуоресцеина диацетата, поглощение пропидия йодида (для оценки жизнеспособности); и поглощение тимидина, МТТ-анализ клеточной пролиферации (для оценки пролиферации). Долговечность можно определить способами, хорошо известными в данной области, например, определяя максимальное число удвоений популяции в размножаемой культуре.

Плацентарные стволовые клетки можно также отделить от других клеток с использованием других методик, известных в данной области, например, селективного роста желаемых клеток (положительная селекция), селективного разрушения нежелательных клеток (отрицательная селекция); разделения на основе дифференциальной способности клеток к агглютинации в смешанной популяции, например, с агглютинином из соевых бобов; процедур замораживания-оттаивания; фильтрации; обычного и зонального центрифугирования; промывания при центрифугировании (центрифугирования в противотоке); разделения под силой тяжести; противоточного распределения; электрофореза; и т.п.

4.4 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ПЛАЦЕНТАРНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

4.4.1 Культуральная среда

Выделенные плацентарные стволовые клетки или популяции плацентарных стволовых клеток, или ткань плаценты или ткань пуповины, из которых вырастают стволовые клетки, можно использовать для инициации или посева клеточных культур. Клетки обычно переносят в стерильные емкости для культивирования тканей, либо не покрытые, либо покрытие внеклеточным матриксом или лигандами, такими как ламинин, коллаген (например, нативный или денатурированный), желатин, фибронектин, орнитин, витронектин и белок внеклеточной мембраны (например, МАТРИГЕЛЬ (BD Discovery Labware, Bedford, Mass.)).

Плацентарные стволовые клетки можно культивировать в любой среде и в любых условиях, известных в данной области, как приемлемые для культивирования стволовых клеток. Предпочтительно, чтобы культуральная среда содержала сыворотку. Плацентарные стволовые клетки можно культивировать, например, в смеси DMEM-LG (Модифицированной Дульбекко необходимой среде, низкое содержание глюкозы)/MCDB 201 (базальной среде для куриных фибробластов), содержащей ITS (инсулин-трансферрин-селен), LA+BSA (линолевую кислоту-бычий сывороточный альбумин), декстрозу, L-аскорбиновую кислоту, PDGF, EGF, IGF-1 и пенициллин/стрептомицин; DMEM-HG (высокое содержание глюкозы), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS); DMEM-HG, содержащей 15% FBS; IMDM (Модифицированной Исковым среды Дульбекко), содержащей 10% FBS, 10% лошадиной сыворотки и гидрокортизон; M199, содержащей 10% FBS, EGF и гепарин; α-MEM (Минимальной необходимой среде), содержащей 10% FBS, GlutaMAX™ и гентамицин; DMEM, содержащей 10% FBS, GlutaMAX™ и гентамицин, и т.д. Предпочтительной средой является DMEM-LG/MCDB-201, содежащая 2% FBS, ITS, LA+BSA, декстрозу, L-аскорбиновую кислоту, PDGF, EGF и пенициллин/стрептомицин.

Другая среда, которую можно использовать для культивирования плацентарных стволовых клеток, включает в себя DMEM (с высоким или низким содержанием глюкозы), базальную среду Игла, среду (F10) Хама (F10), среду (F-12) Хама (F12), модифицированную Исковым среду Дульбекко, ростовую среду для мезенхимных стволовых клеток (MSCGM), среду L-15 Лейбовитца, MCDB, DMEM/F12, RPMI 1640, улучшенную DMEM (Gibco), DMEM/MCDB201 (Sigma) и CELL-GRO FREE.

В культуральную среду можно добавить один или несколько компонентов, включающих, например, сыворотку (например, фетальную бычью сыворотку (FBS), предпочтительно, в количестве 2-15% (по объему); лошадиную сыворотку (ES); сыворотку человека (HS)); бета-меркаптоэтанол (BME), предпочтительно, в количестве примерно 0,001% (по объему); один или несколько ростовых факторов, например, тромбоцитарный ростовой фактор (PDGF), фактор роста эпидермиса (EGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF), инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1), ингибирующий лейкемию фактор (LIF), фактор роста васкулярного эндотелия (VEGF) и эритропоэтин (EPO); аминокислоты, включая L-валин; и один или несколько антибиотиков и/или противогрибковых соединений для контроля микробного заражения, таких как, например, пенициллин G, стрептомицина сульфат, амфотерицин В, гентамицин и нистатин, либо по отдельности, либо в комбинации.

4.4.2 Размножение и пролиферация плацентарных стволовых клеток

После выделения плацентарной стволовой клетки или выделенной популяции стволовых клеток (например, стволовая клетка или популяция стволовых клеток отделены, по меньшей мере, от 50% плацентарных клеток, с которыми стволовая клетка или популяция стволовых клеток обычно ассоциированы in vivo) стволовая клетка или популяция стволовых клеток могут пролиферировать или их можно размножить in vitro. Например, популяцию плацентарных стволовых клеток можно культивировать в контейнерах для культивирования тканей, например, чашках, флаконах, мультилуночных планшетах и т.п. в течение времени, достаточного для пролиферации стволовых клеток до конфлюэнтности 70-90%, то есть то того момента, как стволовые клетки и их потомство оккупируют 70-90% площади культуральной поверхности контейнера для культивирования тканей.

Плацентарные стволовые клетки можно посеять в культуральные емкости с плотностью, которая позволяет рост клеток. Например, клетки можно посеять с плотностью от низкой (например, от примерно 1000 до примерно 5000 клеток/см²) и до высокой (например, примерно 50000 или больше клеток/см²). В предпочтительном варианте осуществления изобретения клетки культивируют в атмосфере от примерно 0 до примерно 5 процентов СО₂ в воздухе. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения клетки культивируют в атмосфере от примерно 2 до примерно 25 процентов О₂ в воздухе, предпочтительно, от примерно 5 до примерно 20 процентов О₂ в воздухе. Клетки предпочтительно культивировать при температуре от примерно 25°С до примерно 40°С, предпочтительно, при 37°С. Клетки предпочтительно культивировать в инкубаторе. Культуральная среда может быть статичной или может перемешиваться, например, с использованием биореактора. Плацентарные стволовые клетки предпочтительно растить в условиях небольшого окислительного стресса (например, с добавлением глутатиона, аскорбиновой кислоты, каталазы, токоферола, N-ацетилцистеина и т.п.).

После достижения конфлюэнтности 70-90% клетки можно пассировать. Например, клетки можно ферментативно обработать, например, трипсинизировать, с использованием методик, хорошо известных в данной области для открепления от культуральной поверхности. После удаления клеток пипетированием и подсчета клеток примерно 10000-100000 стволовых клеток на квадратный сантиметр, предпочтительно, примерно 50000 стволовых клеток на квадратный сантиметр, пассируют в новый культуральный контейнер, содержащий свежую культуральную среду. Обычно новая среда является средой того же типа как среда, из которой были удалены клетки. Настоящее изобретение относится к популяциям плацентарных стволовых клеток, которые были пассированы, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 или 20 раз, или большее число раз, и их комбинациям.

4.4.3 Популяции плацентарных стволовых клеток

В способах лечения, приведенных в настоящем документе, в некоторых вариантах осуществления изобретения используются популяции плацентарных клеток, например, плацентарных стволовых клеток. Популяции плацентарных стволовых клеток можно выделить непосредственно из одной или нескольких плацент; то есть популяция плацентарных стволовых клеток может представлять собой популяцию плацентарных клеток или пуповинных клеток, содержащих плацентарные стволовые клетки или пуповинные клетки, полученную из перфузата или содержащуюся в нем, или полученную из продукта расщепления или содержащуюся в нем (то есть, коллекцию клеток, полученных ферментативным расщеплением плаценты или ее части, или из пуповины). Выделенные плацентарные стволовые клетки также можно культивировать и размножать для получения популяций плацентарных стволовых клеток. Популяции плацентарных клеток или пуповинных клеток, содержащие плацентарные стволовые клетки, также можно культивировать и размножать для получения популяций плацентарных стволовых клеток.

В различных вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% клеток в выделенной популяции плацентарных клеток или популяции пуповинных клеток составляют плацентарные стволовые клетки. То есть популяция плацентарных клеток или популяция пуповинных клеток, содержащая плацентарные стволовые клетки, может содержать, например, вплоть до 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% не стволовых клеток.

Настоящее изобретение относится к способам получения выделенных популяций плацентарных стволовых клеток путем, например, отбора плацентарных стволовых клеток или пуповинных стволовых клеток, полученных либо в результате ферментативного расщепления, либо перфузией, которые экспрессируют конкретные маркеры и/или имеют конкретные культуральные или морфологические характеристики. В одном варианте осуществления изобретения, например, клеточную популяцию можно получить способом, включающим в себя отбор плацентарных или пуповинных клеток, которые: (а) прикрепляются к субстрату пластика для культивирования тканей, (б) являются CD10⁺, CD34^- и CD105⁺; и выделение указанных клеток из других клеток для формирования клеточной популяции. В другом варианте осуществления изобретения, например, клеточную популяцию можно получить способом, включающим в себя отбор плацентарных или пуповинных клеток, которые: (а) прикрепляются к субстрату, и (б) экспрессируют CD200 и HLA-G; и выделение указанных клеток из других клеток для формирования клеточной популяции. В другом варианте осуществления изобретения способ получения клеточной популяции включает в себя отбор плацентарных или пуповинных клеток, которые: (а) прикрепляются к субстрату, и (б) экспрессируют CD73, CD105 и CD200; и выделение указанных клеток из других клеток для формирования клеточной популяции. В другом варианте осуществления изобретения способ получения клеточной популяции включает в себя отбор плацентарных или пуповинных клеток, которые: (а) прикрепляются к субстрату, и (б) экспрессируют CD200 и OCT-4; и выделение указанных клеток из других клеток для формирования клеточной популяции. В другом варианте осуществления изобретения способ получения клеточной популяции включает в себя отбор плацентарных или пуповинных клеток, которые: (а) прикрепляются к субстрату, и (б) экспрессируют CD73 и CD105, и (в) способствуют образованию одного или нескольких эмбрионоподобных тел в популяции плацентарных клеток, содержащей указанные стволовые клетки, когда указанную популяцию культивируют в условиях, позволяющих образование эмбрионоподобных тел; и выделение указанных клеток из других клеток для формирования клеточной популяции. В другом варианте осуществления изобретения способ получения клеточной популяции включает в себя отбор плацентарных или пуповинных клеток, которые: (а) прикрепляются к субстрату, и (б) экспрессируют CD73, CD105 и HLA-G; и выделение указанных клеток из других клеток для формирования клеточной популяции. В другом варианте осуществления изобретения способ получения клеточной популяции включает в себя отбор плацентарных или пуповинных клеток, которые: (а) прикрепляются к субстрату, и (б) экспрессируют OCT-4 и (в) способствуют образованию одного или нескольких эмбрионоподобных тел в популяции плацентарных клеток, содержащей указанные стволовые клетки, когда указанную популяцию культивируют в условиях, позволяющих образование эмбрионоподобных тел; и выделение указанных клеток из других клеток для формирования клеточной популяции. В любом из вышеперечисленных вариантов осуществления изобретения способ может дополнительно включать в себя отбор плацентарных клеток или пуповинных клеток, которые экспрессируют ABC-p (плацентарный АВС-транспортный белок; смотри, например, Allikmets et al., Cancer Res. 58(23):5337-9 (1998)).

В приведенных выше вариантах осуществления изобретения субстратом может являться любая поверхность, на которой можно выполнять культивирование и/или отбор клеток, например, плацентарных стволовых клеток. Обычно субстратом является пластик, например, пластик чашки для культивирования тканей или пластик мультилуночного планшета. Пластик для культивирования тканей может быть покрыт биомолекулами, например, ламинином или фибронектином.

Клетки, например, плацентарные стволовые клетки, для популяции плацентарных стволовых клеток можно отобрать любыми средствами, известными в области отбора клеток. Например, клетки можно отобрать с использованием антитела или антител к одному или нескольким маркерам клеточной поверхности, например, с помощью проточной цитометрии или FACS. Отбор можно выполнить, используя антитела, связанные с магнитными шариками. Специфичные к некоторым маркерам, связанным со стволовыми клетками, антитела хорошо известны в данной области. Например, антитела к OCT-4 (Abcam, Cambridge, MA), CD200 (Abcam), HLA-G (Abcam), CD73 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), CD 105 (Abcam; BioDesign International, Saco, ME) и т.д. Антитела к другим маркерам также доступны в продаже, например, в продаже доступны антитела к CD34, CD38 и CD45, например, от StemCell Technologies или BioDesign International.

Выделенные популяции плацентарных стволовых клеток можно объединить с одной или несколькими популяциями не стволовых клеток или не плацентарных клеток. Например, выделенную популяцию плацентарных стволовых клеток можно объединить с кровью (например, плацентарной кровью или пуповинной кровью), полученными из крови стволовыми клетками (например, стволовыми клетками, полученными из плацентарной крови или пуповинной крови), популяциями полученных из крови ядросодержащих клеток, полученными из костного мозга мезенхимными клетками, полученными из кости популяциями стволовых клеток, неочищенным костным мозгом, взрослыми (соматическими) стволовыми клетками популяциями стволовых клеток, содержащихся в ткани, культивированными стволовыми клетками, популяциями полностью дифференцированных клеток (например, хондроцитов, фибробластов, амниотических клеток, остеобластов, мышечных клеток, сердечных клеток и т.д.) и т.п. Клетки в выделенной популяции плацентарных клеток можно объединить с клетками другого типа в соотношении примерно 100000000:1, 50000000:1, 20000000:1, 10000000:1, 5000000:1, 2000000:1, 1000000:1, 500000:1, 200000:1, 100000:1, 50000:1, 20000:1, 10000:1, 5000:1, 2000:1, 1000:1, 500:1, 200:1, 100:1, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:100, 1:200, 1:500, 1:1000, 1:2000, 1:5000, 1:10000, 1:20000, 1:50000, 1:100000, 1:500000, 1:1000000, 1:2000000, 1:5000000, 1:10000000, 1:20000000, 1:50000000 или примерно 1:100000000 относительно числа всех ядросодержащих клеток в каждой популяции. Кроме того, клетки в выделенной популяции плацентарных клеток можно объединить с клетками разных типов.

В одном варианте осуществления изобретения выделенную популяцию плацентарных стволовых клеток объединяют с гематопоэтическими стволовыми клетками. Такие гематопоэтические стволовые клетки могут, например, содержаться в необработанной плацентарной, пуповинной крови или периферической крови; в общих ядросодержащих клетках из плацентарной крови, пуповинной крови или периферической крови; в выделенной популяции CD34⁺ клеток из крови, например, пуповинной крови или периферической крови; в необработанном костном мозге; в общих ядросодержащих клетках из костного мозга; в выделенной популяции CD34⁺ клеток из костного мозга и т.п.

4.5 КОНСЕРВАЦИЯ ПЛАЦЕНТАРНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

Плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки можно консервировать, то есть, помещать в условия, которые позволяют длительное хранение, или в условия, которые ингибируют клеточную смерть, например, апоптоз или некроз.

Клетки можно консервировать с использованием, например, композиции, содержащей ингибитор апоптоза, ингибитор некроза и/или переносящий кислород перфторуглерод, как описано в опубликованной патентной заявке США US 2007/0190042. В одном варианте осуществления изобретения популяцию стволовых клеток консервируют в результате контакта популяции с композицией для сбора стволовых клеток, содержащей ингибитор апоптоза и переносящий кислород перфторуглерод, причем указанный ингибитор апоптоза присутствует в количестве и на протяжении отрезка времени, достаточных для уменьшения или предупреждения апоптоза в популяции стволовых клеток по сравнению с популяцией стволовых клеток, которая не контактировала с ингибитором апоптоза. В конкретном варианте осуществления изобретения указанным ингибитором апоптоза является каспазный ингибитор. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанным ингибитором апоптоза является ингибитор JNK. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанный ингибитор JNK не модулирует дифференцировку или пролиферацию плацентарных стволовых клеток. В другом варианте осуществления изобретения указанная композиция для сбора стволовых клеток включает в себя указанный ингибитор апоптоза и указанный переносящий кислород перфторуглерод в отдельных фазах. В другом варианте осуществления изобретения указанная композиция для сбора стволовых клеток включает в себя указанный ингибитор апоптоза и указанный переносящий кислород перфторуглерод в эмульсии. В другом варианте осуществления изобретения композиция для сбора стволовых клеток дополнительно включает в себя эмульгатор, например, лецитин. В другом варианте осуществления изобретения указанный ингибитор апоптоза и указанный перфторуглерод находятся при температуре между 0°С и 25°С на момент контакта со стволовыми клетками. В другом варианте осуществления изобретения указанный ингибитор апоптоза и указанный перфторуглерод находятся при температуре между 2°С и 10°С или между 2°С и 5°С на момент контакта с стволовыми клетками. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения указанный контакт проводят в ходе транспортирования указанной популяции стволовых клеток. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения указанный контакт проводят в ходе заморозки и оттаивания популяции плацентарных стволовых клеток.

В другом варианте осуществления изобретения популяции плацентарных стволовых клеток можно консервировать способом, включающим в себя контакт популяции с ингибитором апоптоза и соединением для консервации органов, причем указанный ингибитор апоптоза присутствует в количестве и на протяжении отрезка времени, достаточных для уменьшения или предупреждения апоптоза в популяции клеток, например плацентарных стволовых клеток, по сравнению с популяцией клеток, которая не контактировала с ингибитором апоптоза. В конкретном варианте осуществления изобретения соединением для консервации органов является UW-раствор (описанный в патенте США № 4798824; также известный как ViaSpan; смотри также статью Southard et al., Transplantation 49(2):251-257 (1990)) или раствор, описанный в патенте США № 5552267 авторов Stern et al. В другом варианте осуществления изобретения указанным соединением для консервации органов является гидроксиэтиловый крахмал, лактобионовая кислота, рафиноза или их комбинация. В другом варианте осуществления изобретения композиция для сбора стволовых клеток дополнительно включает в себя переносящий кислород перфторуглерод либо в двух фазах, либо в качестве эмульсии.

В другом варианте осуществления способа плацентарные стволовые клетки в ходе перфузии контактируют с композицией для сбора стволовых клеток, содержащей ингибитор апоптоза и переносящий кислород перфторуглерод, соединение для консервации органов или их комбинацию. В другом варианте осуществления изобретения контакт осуществляется в ходе процесса разрушения ткани, например, в результате ферментативного расщепления. В другом варианте осуществления изобретения плацентарные стволовые клетки контактируют с указанным соединением для сбора стволовых клеток после их сбора с помощью перфузии, или после их сбора в результате разрушения ткани, например, в результате ферментативного расщепления.

Обычно в процессе сбора, обогащения и выделения плацентарных или пуповинных клеток предпочтительно минимизировать или полностью устранить стресс для клеток, возникающий в результате гипоксии и механического стресса. Поэтому, в другом варианте осуществления способа плацентарные стволовые клетки в ходе сбора, обогащения или выделения находятся в условиях гипоксии меньше шести часов в течение указанной консервации, причем гипоксические условия представляют собой концентрацию кислорода ниже нормальной концентрации кислорода в крови. В более конкретном варианте осуществления изобретения плацентарные стволовые клетки испытывают указанную гипоксию меньше двух часов в ходе указанной консервации. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения плацентарные клетки находятся в указанных гипоксических условиях меньше одного часа или меньше тридцати минут, или не испытывают гипоксии в ходе сбора, обогащения или выделения. В другом конкретном варианте осуществления изобретения плацентарные стволовые клетки не испытывают напряжения сдвига в ходе сбора, обогащения или выделения.

Описанные в настоящем документе плацентарные стволовые клетки можно криоконсервировать, например, в криоконсервирующей среде в небольших контейнерах, например, ампулах. Подходящая криоконсервирующая среда включает, но не ограничена этим, культуральную среду, включая, например, ростовую среду, или среду для замораживания клеток, например, доступную в продаже среду для замораживания клеток, например, среду C2695, C2639 или C6039 (Sigma). Криоконсервирующая среда предпочтительно содержит DMSO (диметилсульфоксид) в концентрации, например, примерно 10% (по объему). Криоконсервирующая среда может содержать дополнительные агенты, например, Плазмалит, метилцеллюлозу и/или глицерин. В ходе криоконсервации плацентарные стволовые клетки предпочтительно охлаждать со скоростью примерно 1°C в минуту. Предпочтительная температура для криоконсервации составляет от примерно -80°С до примерно -180°С, предпочтительно, от примерно -125°С до примерно -140°С. До размораживания для использования криоконсервированные клетки можно перенести в жидкий азот. В некоторых вариантах осуществления изобретения, например, после достижения ампулами температуры -90°С их переносят в хранилище с жидким азотом. Криоконсервированные клетки предпочтительно размораживать при температуре от примерно 25°С до примерно 40°С, предпочтительно, при температуре примерно 37°С.

4.6 КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ПЛАЦЕНТАРНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ

В приведенных в настоящем документе способах можно, например, использовать композиции, содержащие плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки. В настоящем описании приведены неограничивающие типичные примеры таких композиций.

4.6.1.1 Криоконсервированные клетки

Плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки и популяции плацентарных стволовых клеток, например, криоконсервируют для дальнейшего использования. Способы криоконсервации клеток, таких как стволовые клетки, хорошо известны в данной области. Популяции плацентарных стволовых клеток можно получить в форме, которую легко вводить индивидууму. Например, плацентарные стволовые клетки могут содержаться в контейнере, который подходит для медицинского применения. Таким контейнером может быть, например, стерильный пластиковый пакет, флакон, бутыль или другой контейнер, из которого легко распределять популяцию плацентарных стволовых клеток. Например, контейнером может быть пакет для крови или другой медицинский пакет, подходящий для внутривенного введения жидкости реципиенту. Предпочтительно, чтобы контейнер позволял криоконсервацию объединенной клеточной популяции.

Криоконсервированные популяции плацентарных стволовых клеток могут содержать плацентарные клетки или пуповинные клетки, полученные от одного донора или от множества доноров. Популяция плацентарных стволовых клеток может полностью совпадать по HLA с предполагаемым реципиентом либо частично или полностью не совпадать по HLA.

Поэтому, в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей популяцию плацентарных клеток в контейнере. В конкретном варианте осуществления изобретения клеточная популяция является криоконсервированной. В другом конкретном варианте осуществления изобретения контейнером является пакет, флакон или бутыль. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанным пакетом является стерильный пластиковый пакет. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанный пакет подходит для внутривенного введения, позволяет или облегчает внутривенное введение указанной популяции плацентарных клеток. Пакет может содержать множество просветов или отделений, которые соединяются друг с другом, обеспечивая возможность смешивания плацентарных стволовых клеток и одного или нескольких других растворов, например, лекарственного соединения, перед введением или в течение введения. В другом конкретном варианте осуществления изобретения композиция включает в себя одно или несколько соединений, которые облегчают криоконсервацию клеточной популяции. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанная популяция плацентарных клеток содержится в физиологически-приемлемом водном растворе. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанным физиологически-приемлемым водным раствором является 0,9%-ный раствор NaCl. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанная популяция плацентарных клеток содержит плацентарные стволовые клетки, которые совпадают по HLA с реципиентом указанной клеточной популяции. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанная клеточная популяция содержит плацентарные стволовые клетки, которые, по меньшей мере, частично не совпадают по HLA с реципиентом. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные плацентарные стволовые клетки получены от множества доноров.

4.6.1.2 Фармацевтические композиции

Популяции выделенных плацентарных стволовых клеток или популяции клеток, содержащих выделенные плацентарные стволовые клетки, можно включить в фармацевтические композиции для использования in vivo, например, в приведенных в настоящем документе способах лечения. Такие фармацевтические композиции включают в себя популяцию выделенных плацентарных стволовых клеток или популяцию клеток, включающую в себя выделенные плацентарные стволовые клетки, в фармацевтически приемлемом носителе, например, солевом растворе или другом физиологически приемлемом растворе для in vivo введения. Фармацевтические композиции, включающие в себя выделенные плацентарные стволовые клетки, описанные в настоящем документе, могут содержать любые или любую комбинацию из выделенных популяций плацентарных стволовых клеток или выделенных плацентарных стволовых клеток, описанных в настоящем документе. Фармацевтические композиции могут содержать эмбриональные, материнские или как эмбриональные, так и материнские выделенные клетки. Фармацевтические композиции, приведенные в настоящем описании, могут дополнительно включать в себя выделенные плацентарные стволовые клетки, полученные от одного индивидуума, из одной пуповины или плаценты, или от множества индивидуумов, из множества пуповин или плацент. Любые из плацентарных стволовых клеток, описанных в настоящем документе, можно ввести в фармацевтическую композицию, как описано ниже.

Фармацевтические композиции, приведенные в настоящем документе, могут включать в себя любое число выделенных плацентарных стволовых клеток. Например, единичная доза выделенных плацентарных стволовых клеток может содержать (в различных вариантах осуществления изобретения) примерно, по меньшей мере, или не больше 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸, 1×10⁹, 5×10⁹, 1×10¹⁰, 5×10¹⁰, 1×10¹¹ или больше выделенных клеток.

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим в себя популяции клеток, которые содержат 50% жизнеспособных клеток или больше (то есть, по меньшей мере, 50% клеток в популяции являются функциональными или живыми). Предпочтительно, чтобы, по меньшей мере, 60% клеток в популяции были жизнеспособными. Более предпочтительно, чтобы, по меньшей мере, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% клеток в популяции в фармацевтической композиции были жизнеспособными.

Фармацевтические композиции, приведенные в настоящем документе, могут включать в себя одно или несколько соединений, которые, например, способствуют приживлению (например, антитела к Т-клеточному рецептору, иммуносупрессант и т.п.); стабилизаторы, такие как альбумин, декстран 40, желатин, гидроксиэтиловый крахмал, плазмалит и т.п.

При составлении в виде раствора для инъекций в одном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит примерно от 1% до 1,5% HSA (сывороточного альбумина человека) и примерно 2,5% декстрана. В предпочтительном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит от примерно 5×10⁶ клеток на миллилитр до примерно 2×10⁷ клеток на миллилитр в растворе, содержащем 5% HSA и 10% декстрана, необязательно, содержащем иммуносупрессант, например, циклоспорин А в концентрации, например, 10 мг/кг.

В других вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция, например, раствор, содержит множество клеток, например, выделенных плацентарных стволовых клеток, причем указанная фармацевтическая композиция содержит от примерно 1,0±0,3×10⁶ клеток на миллилитр до примерно 5,0±1,5×10⁶ клеток на миллилитр. В других вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит от примерно 1,5×10⁶ клеток на миллилитр до примерно 3,75×10⁶ клеток на миллилитр. В других вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит от примерно 1×10⁶ клеток/мл до примерно 50×10⁶ клеток/мл, от примерно 1×10⁶ клеток/мл до примерно 40×10⁶ клеток/мл, от примерно 1×10⁶ клеток/мл до примерно 30×10⁶ клеток/мл, от примерно 1×10⁶ клеток/мл до примерно 20×10⁶ клеток/мл, от примерно 1×10⁶ клеток/мл до примерно 15×10⁶ клеток/мл или от примерно 1×10⁶ клеток/мл до примерно 10×10⁶ клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция не содержит видимых агрегатов клеток (то есть, макроагрегатов клеток), или по существу не содержит видимых агрегатов клеток. Используемый в настоящем документе термин «макроагрегаты клеток» означает отсутствие агрегации клеток, видимой без увеличения, например, видимой невооруженным глазом, и, обычно, относится к агрегатам клеток крупнее примерно 150 микрон. В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит примерно 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 5,5%, 6,0%, 6,5%, 7,0%, 7,5%, 8,0%, 8,5%, 9,0%, 9,5% или 10% декстрана, например, декстрана-40. В конкретном варианте осуществления изобретения указанная композиция содержит от примерно 7,5% до примерно 9% декстрана-40. В конкретном варианте осуществления изобретения указанная композиция содержит примерно 5,5% декстрана-40. В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит от примерно 1% до примерно 15% альбумина из сыворотки человека (HSA). В конкретных вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит примерно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% или 15% HSA. В конкретном варианте осуществления изобретения указанные клетки были криоконсервированы и разморожены. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные клетки были профильтрованы через фильтр с порами от 70 мкм до 100 мкм. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанная композиция не содержит видимых клеточных агрегатов. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанная композиция содержит менее примерно 200 клеточных агрегатов на 10⁶ клеток, причем указанные клеточные агрегаты являются видимыми только под микроскопом, например, световым микроскопом. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанная композиция содержит менее примерно 150 клеточных агрегатов на 10⁶ клеток, причем указанные клеточные агрегаты являются видимыми только под микроскопом, например, световым микроскопом. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанная композиция содержит менее примерно 100 клеточных агрегатов на 10⁶ клеток, причем указанные клеточные агрегаты являются видимыми только под микроскопом, например, световым микроскопом.

В конкретном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит примерно 1,0±0,3×10⁶ клеток на миллилитр, примерно 5,5% декстрана-40 (вес/объем), примерно 10% HSA (вес/объем) и примерно 5% DMSO (по объему).

В других вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит множество клеток, например, множество выделенных плацентарных стволовых клеток, в растворе, содержащем 10% декстрана-40, причем фармацевтическая композиция содержит от примерно 1,0±0,3×10⁶ клеток на миллилитр до примерно 5,0±1,5×10⁶ клеток на миллилитр, а также указанная композиция не содержит агрегатов клеток, видимых невооруженным глазом (то есть, не содержит макроагрегатов клеток). В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит от примерно 1,5×10⁶ клеток на миллилитр до примерно 3,75×10⁶ клеток на миллилитр. В конкретном варианте осуществления изобретения указанные клетки были криоконсервированы и разморожены. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные клетки были профильтрованы через фильтр с порами от 70 мкм до 100 мкм. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанная композиция содержит менее примерно 200 микроагрегатов клеток (то есть, агрегатов клеток, видимых только под микроскопом) на 10⁶ клеток. В другом конкретном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит менее примерно 150 микроагрегатов клеток на 10⁶ клеток. В другом конкретном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит менее примерно 100 микроагрегатов клеток на 10⁶ клеток. В другом конкретном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит меньше 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3% или 2% DMSO, или меньше 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2% или 0,1% DMSO.

Дополнительно настоящее изобретение относится к композициям, содержащим клетки, причем указанные композиции получены одним из способов, раскрытых в настоящем документе. Например, в одном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция включает в себя клетки, причем фармацевтическая композиция получена способом, включающим в себя фильтрование раствора, содержащего плацентарные стволовые клетки, для получения фильтрованного раствора, содержащего клетки; разведение фильтрованного раствора, содержащего клетки, первым раствором до концентрации примерно от 1 до 50×10⁶, от 1 до 40×10⁶, от 1 до 30×10⁶, от 1 до 20×10⁶, от 1 до 15×10⁶ или от 1 до 10×10⁶ клеток на миллилитр, например, перед криоконсервацией; и разведение полученного фильтрованного раствора, содержащего клетки, вторым раствором, содержащим декстран, но не содержащим альбумин из сыворотки человека (HSA), для получения указанной композиции. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное разведение проводят не более чем примерно до 15×10⁶ клеток на миллилитр. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное разведение проводят не более чем примерно до 10±3×10⁶ клеток на миллилитр. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное разведение проводят не более чем примерно до 7,5×10⁶ клеток на миллилитр. В некоторых других вариантах осуществления изобретения если фильтрованный раствор, содержащий клетки, перед разведением содержит меньше 15×10⁶ клеток на миллилитр, то фильтрование является необязательным. В некоторых других вариантах осуществления изобретения если фильтрованный раствор, содержащий клетки, перед разведением содержит меньше 10±3×10⁶ клеток на миллилитр, то фильтрование является необязательным. В некоторых других вариантах осуществления изобретения если фильтрованный раствор, содержащий клетки, перед разведением содержит меньше 7,5×10⁶ клеток на миллилитр, то фильтрование является необязательным.

В конкретном варианте осуществления изобретения клетки криоконсервируют в интервале между указанным разведением с помощью первого раствора для разведения и указанным разведением с помощью второго раствора для разведения. В другом конкретном варианте осуществления изобретения первый раствор для разведения содержит декстран и HSA. Декстран в первом растворе для разведения или втором растворе для разведения может иметь любой молекулярный вес, например, молекулярный вес от примерно 10 кД до примерно 150 кД. В некоторых вариантах осуществления изобретения содержание указанного декстрана в первом растворе для разведения или втором растворе для разведения составляет примерно 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 5,5%, 6,0%, 6,5%, 7,0%, 7,5%, 8,0%, 8,5%, 9,0%, 9,5% или 10% декстрана. В другом конкретном варианте осуществления изобретения декстран в указанном первом растворе для разведения или указанном втором растворе для разведения является декстраном-40. В другом конкретном варианте осуществления изобретения декстран в указанном первом растворе для разведения и указанном втором растворе для разведения является декстраном-40. В другом конкретном варианте осуществления изобретения содержание указанного декстрана-40 в указанном первом растворе для разведения составляет 5,0% декстрана-40. В другом конкретном варианте осуществления изобретения содержание указанного декстрана-40 в указанном первом растворе для разведения составляет 5,5% декстрана-40. В другом конкретном варианте осуществления изобретения содержание указанного декстрана-40 в указанном втором растворе для разведения составляет 10% декстрана-40. В другом конкретном варианте осуществления изобретения содержание указанного HSA в указанном растворе, содержащем HSA, составляет от 1 до 15% HSA. В другом конкретном варианте осуществления изобретения содержание указанного HSA в указанном растворе, содержащем HSA, составляет примерно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% или 15% HSA. В другом конкретном варианте осуществления изобретения содержание указанного HSA в указанном растворе, содержащем HSA, составляет 10% HSA. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанный первый раствор для разведения содержит HSA. В более конкретном варианте осуществления изобретения содержание указанного HSA в указанном первом растворе для разведения составляет 10% HSA. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанный первый раствор для разведения содержит криопротектант. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанным криопротектантом является DMSO. В другом конкретном варианте осуществления изобретения содержание указанного декстрана-40 в указанном втором растворе для разведения составляет 10% декстрана-40. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанная композиция, содержащая клетки, содержит от примерно 7,5% до примерно 9% декстрана. В другом конкретном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит от примерно 1,0±0,3×10⁶ клеток на миллилитр до примерно 5,0±1,5×10⁶ клеток на миллилитр. В другом конкретном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит от примерно 1,5×10⁶ клеток на миллилитр до примерно 3,75×10⁶ клеток на миллилитр.

В другом варианте осуществления изобретения фармацевтическую композицию изготавливают способом, включающим в себя: (а) фильтрование раствора, содержащего плацентарные стволовые клетки, перед криоконсервацией для получения фильтрованного раствора, содержащего клетки; (б) криоконсервацию клеток в фильтрованном растворе, содержащим клетки, с концентрацией примерно от 1 до 50×10⁶, от 1 до 40×10⁶, от 1 до 30×10⁶, от 1 до 20×10⁶, от 1 до 15×10⁶ или от 1 до 10×10⁶ клеток на миллилитр; (в) размораживание клеток; и (г) разведение фильтрованного раствора, содержащего клетки, примерно от 1:1 до примерно 1:11 (по объему) раствором декстрана-40. В некоторых вариантах осуществления изобретения если перед стадией (а) число клеток составляет меньше примерно 10±3×10⁶ клеток на миллилитр, то фильтрование является необязательным. В более конкретном варианте осуществления изобретения клетки на стадии (б) криоконсервируют с концентрацией 10±3×10⁶ клеток на миллилитр. В более конкретном варианте осуществления клетки на стадии (б) криоконсервируют в растворе, содержащем от примерно 5% до примерно 10% декстрана-40 и HSA. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное разведение на стадии (б) проводят не более чем примерно до 15×10⁶ клеток на миллилитр.

В другом варианте осуществления изобретения фармацевтическую композицию изготавливают способом, включающим в себя: (а) суспендирование плацентарных стволовых клеток в 5,5%-ном растворе декстрана-40, который содержит 10% HSA, для получения содержащего клетки раствора; (б) фильтрование содержащего клетки раствора через фильтр 70 мкм; (в) разведение содержащего клетки раствора раствором, содержащим 5,5% декстрана-40, 10% HSA и 5% DMSO, до концентрации примерно от 1 до 50×10⁶, от 1 до 40×10⁶, от 1 до 30×10⁶, от 1 до 20×10⁶, от 1 до 15×10⁶ или от 1 до 10×10⁶ клеток на миллилитр; (г) криоконсервацию клеток; (д) размораживание клеток; и (е) разведение содержащего клетки раствора от 1:1 до 1:11 (по объему) 10%-ным раствором декстрана-40. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное разведение на стадии (в) проводят не более чем примерно до 15×10⁶ клеток на миллилитр. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное разведение на стадии (в) проводят не более чем примерно до 10±3×10⁶ клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное разведение на стадии (в) проводят не более чем примерно до 7,5×10⁶ клеток/мл.

В другом варианте осуществления изобретения фармацевтическую композицию, содержащую клетки, изготавливают способом, включающим в себя: (а) центрифугирование множества клеток, например, плацентарных стволовых клеток, для сбора клеток; (б) ресуспендирование клеток в 5,5%-ном растворе декстрана-40; (в) центрифугирование клеток для их сбора; (г) ресуспендирование клеток в 5,5%-ном растворе декстрана-40, который содержит 10% HSA; (д) фильтрование клеток через фильтр 70 мкм; (е) разведение клеток в 5,5%-ном декстран-40, 10%-ном HSA и 5%-ном DMSO до концентрации примерно от 1 до 50×10⁶, от 1 до 40×10⁶, от 1 до 30×10⁶, от 1 до 20×10⁶, от 1 до 15×10⁶ или от 1 до 10×10⁶ клеток на миллилитр; (ж) криоконсервацию клеток; (з) размораживание клеток; и (и) разведение клеток от 1:1 до 1:11 (по объему) 10%-ным раствором декстрана-40. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное разведение на стадии (е) проводят не более чем примерно до 15×10⁶ клеток на миллилитр. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное разведение на стадии (е) проводят не более чем примерно до 10±3×10⁶ клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное разведение на стадии (е) проводят не более чем примерно до 7,5×10⁶ клеток/мл. В некоторых других вариантах осуществления изобретения если число клеток составляет меньше примерно 10±3×10⁶ клеток на миллилитр, то фильтрование является необязательным.

Композиции, например, фармацевтические композиции, содержащие выделенные плацентарные клетки, описанные в настоящем документе, могут содержать любые из выделенных плацентарных стволовых клеток, описанных в настоящем документе.

Можно использовать другие составы для инъекций, подходящие для введения клеточных продуктов.

В одном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит выделенные плацентарные стволовые клетки, которые по существу или полностью не являются материнскими по своему происхождению, то есть имеют эмбриональный генотип; например, по меньшей мере, примерно 90%, 95%, 98%, 99% или примерно 100% клеток не являются материнскими по своему происхождению.

В конкретном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция дополнительно содержит стволовую клетку, которая не получена из плаценты.

Выделенные плацентарные стволовые клетки в композициях, например, фармацевтических композициях, приведенных в настоящем описании, могут включать в себя плацентарные стволовые клетки, полученные от одного донора или от многих доноров. Выделенные плацентарные клетки могут полностью совпадать по HLA с предполагаемым реципиентом, или частично или полностью не совпадать по HLA.

4.6.1.3 Кондиционная среда от плацентарных стволовых клеток

Плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки, приведенные в настоящем документе, можно использовать для получения кондиционной среды. В различных вариантах осуществления изобретения кондиционная среда содержит среду, в которой плацентарные стволовые клетки росли в течение, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или большего числа дней. В других вариантах осуществления изобретения кондиционная среда содержит среду, в которой плацентарные стволовые клетки росли до конфлюэнтности, по меньшей мере, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или до 100%. В другом варианте осуществления изобретения кондиционная среда содержит среду, в которой культивировали плацентарные стволовые клети и не плацентарные, не пуповинные стволовые клетки.

4.6.2 Банк плацентарных клеток

Клетки, например, плацентарные стволовые клетки, из послеродовой плаценты и/или пуповины можно культивировать различными способами для получения наборов партий, например, наборов индивидуально вводимых доз, плацентарных стволовых клеток. Такие партии можно, например, получить из стволовых клеток из плацентарного перфузата или пуповинного перфузата, или из расщепленной ферментами плацентарной ткани или пуповинной ткани. Из наборов партий плацентарных стволовых клеток, полученных из одной или ряда плацент, можно организовать банк клеток, например, для длительного хранения. В общем, прикрепленные стволовые клетки получают из первичной культуры плацентарного или пуповинного материала для создания культуры для посева, например, плацентарных стволовых клеток, которые размножают в контролируемых условиях для получения популяций клеток из приблизительно равного числа удвоений. Предпочтительно, чтобы партии были получены из ткани одной плаценты или пуповины, но они могут быть получены из ткани нескольких плацент.

В одном варианте осуществления изобретения партии стволовых клеток получают, как описано ниже. Сначала разрушают ткань, например, измельчая ее, расщепляют соответствующим ферментом, например, коллагеназой (смотри раздел 5.2.3 выше). Предпочтительно, чтобы ткань содержала, например, целый амнион, целый хорион, амнион и хорион, или пуповину из одной плаценты, но она может содержать только часть амниона, хориона или пуповины. Расщепленную ферментами ткань культивируют, например, в течение 1-3 недель, предпочтительно, примерно 2 недели. После удаления неприкрепленных клеток собирают образующиеся колонии с высокой плотностью клеток, например, трипсинизацией. Эти клетки собирают и ресуспендируют в соответствующем объеме культуральной среды, и обозначают как «клетки нулевого пассажа».

Клетки нулевого пассажа затем используют для посева культур под размножение. Размножаемые культуры можно размещать в любом порядке в отдельные аппараты для культивирования клеток, например, Cell Factory от NUNC™. Клетки в культуре нулевого пассажа можно разводить до любой степени, так чтобы высевать для культур под размножение, например, по 1×10³, 2×10³, 3×10³, 4×10³, 5×10³, 6×10³, 7×10³, 8×10³, 9×10³, 1×10⁴, 2×10⁴, 3×10⁴, 4×10⁴, 5×10⁴, 6×10⁴, 7×10⁴, 8×10⁴, 9×10⁴ или 10×10⁴ стволовых клеток. Предпочтительно для посева каждой культуры под размножение использовать от примерно 1×10³ до примерно 1×10⁴ клеток нулевого пассажа. Число размножаемых культур может зависеть от числа клеток нулевого пассажа и может варьировать в зависимости от конкретной плаценты (конкретных плацент), из которых получены стволовые клетки.

Размножаемые культуры растят до тех пор, пока плотность клеток в культуре не достигнет некоторого значения, например, примерно 1×10⁵ клеток/см². В этой точке клетки либо можно собрать и криоконсервировать, или пассировать в новые культуры под размножение, как описано выше. Перед использованием клетки можно пассировать, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 раз. Предпочтительно регистрировать общее число удвоений популяции в ходе размножения культур. Клетки нулевого пассажа можно размножать до 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 или 40 удвоений, или до 60 удвоений. Однако предпочтительно, чтобы число удвоений популяции перед разделением популяции клеток на индивидуальные дозы, составляло от примерно 15 до примерно 30 удвоений. Клетки можно культивировать непрерывно в ходе процесса размножения, или их можно заморозить в одной или нескольких точках в ходе размножения.

Клетки, которые планируется использовать для индивидуальных доз, можно заморозить, например, криоконсервировать для последующего применения. Индивидуальные дозы могут содержать, например, примерно от 1 миллиона до примерно 50 миллионов клеток в мл, и могут содержать всего от примерно 10⁶ до примерно 10¹⁰ клеток.

Поэтому, в одном варианте осуществления изобретения клеточный банк плацентарных стволовых клеток можно изготовить способом, включающим в себя: размножение первичной культуры плацентарных стволовых клеток из послеродовой плаценты или пуповины человека до первого удвоения множества популяций; криоконсервацию указанных плацентарных стволовых клеток для создания Главного клеточного банка; размножение множества плацентарных стволовых клеток из Главного клеточного банка до второго удвоения множества популяций; криоконсервацию плацентарных стволовых клеток для создания Рабочего клеточного банка; размножение множества плацентарных стволовых клеток из Рабочего клеточного банка до третьего удвоения множества популяций; и криоконсервацию плацентарных стволовых клеток в индивидуальных дозах, причем указанные индивидуальные дозы все вместе составляют банк плацентарных стволовых клеток.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения клетки первичной культуры содержат плацентарные стволовые клетки из плацентарного перфузата. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные клетки из первичной культуры содержат плацентарные стволовые клетки из расщепленной плацентарной ткани. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные клетки из первичной культуры содержат плацентарные стволовые клетки из плацентарного перфузата и из расщепленной плацентарной ткани. В другом конкретном варианте осуществления изобретения все указанные плацентарные стволовые клетки в указанной первичной культуре относятся к одной плаценте. В другом конкретном варианте осуществления изобретения способ дополнительно включает в себя стадию отбора CD200⁺ плацентарных стволовых клеток из указанного множества клеток из указанного Рабочего клеточного банка для создания индивидуальных доз. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные индивидуальные дозы содержат от примерно 10⁴ до примерно 10⁵ плацентарных стволовых клеток. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные индивидуальные дозы содержат от примерно 10⁵ до примерно 10⁶ плацентарных стволовых клеток. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные индивидуальные дозы содержат от примерно 10⁶ до примерно 10⁷ плацентарных стволовых клеток. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные индивидуальные дозы содержат от примерно 10⁷ до примерно 10⁸ плацентарных стволовых клеток. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные индивидуальные дозы содержат от примерно 10⁸ до примерно 10⁹ плацентарных стволовых клеток. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные индивидуальные дозы содержат от примерно 10⁹ до примерно 10¹⁰ плацентарных стволовых клеток.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения донора, от которого получают плаценту (например, мать), тестируют, по меньшей мер, на один патоген. Если результаты тестов матери являются положительными на тестируемый патоген, то всю партию из плаценты выбраковывают. Такое тестирование можно проводить в любое время в ходе продукции партий плацентарных стволовых клеток, включая периоды до и после получения клеток нулевого пассажа, или в ходе размножения культуры. Патогены, присутствие которых тестируют, могут включать в себя, без ограничений, гепатит А, гепатит В, гепатит С, гепатит D, гепатит Е, вирус иммунодефицита человека (типы I и II), цитомегаловирус, герпесвирус и т.п.

5. ПРИМЕРЫ

5.1 ПРИМЕР 1: ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, РАССТРОЙСТВ ИЛИ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ ЛЕГКИХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПЛАЦЕНТАРНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

В этом примере приведен пример схем лечения для заболеваний, расстройств и патологических состояний легких.

5.1.1 Лечение острого повреждения легких

У индивидуума наблюдается острое повреждение легких вследствие вдыхания дыма. Индивидууму внутривенно вводят от 1×10⁸ до 5×10⁹ CD10⁺CD34^-CD105⁺CD200⁺ плацентарных стволовых клеток в 0,9%-ном растворе NaCl. Индивидуум находится под наблюдением в течение последующих двух недель для оценки снижения одного или нескольких симптомов, включая увеличение объема форсированного выдоха (FEV). Индивидуум остается под наблюдением в течение следующего года, и плацентарные стволовые клетки в такой же дозировке вводят при необходимости.

5.1.2 Лечение интерстициальной болезни легких

У индивидуума наблюдаются симптомы, включающие в себя одышку, непродуктивный кашель и признаки кровоизлияния в легких. Поставлен диагноз интерстициальной болезни легких. Индивидууму внутривенно вводят от 1×10⁸ до 5×10⁹ CD10⁺CD34^-CD105⁺CD200⁺ плацентарных стволовых клеток в 0,9%-ном растворе NaCl. Индивидуум находится под наблюдением в течение последующих 100 дней до детектируемого улучшения, определяемого с помощью спирометрии или другого измерения объема форсированного выдоха (FEV). Индивидууму необязательно также проводят исследование с помощью одного или нескольких методов из: рентгеновского исследования грудной клетки, компьютерной томографии или магнитно-резонансной томографии, с целью определения уменьшения кровоизлияния.

5.1.3 Профилактика легочного расстройства, ассоциированного с болезнью «трансплантат против хозяина»

Индивидууму, ожидающему аллогенный трансплантат костного мозга, вводят внутривенно от 1×10⁸ до 5×10⁹ CD10⁺CD34^-CD105⁺CD200⁺ плацентарных стволовых клеток в 0,9%-ном растворе NaCl в течение 24 часов перед трансплантацией костного мозга. Введение клеток повторяют в течение 24 часов после трансплантации костного мозга. Индивидуум находится под наблюдением в течение последующих 100 дней, и ему вводят последующую дозу 5-10×10⁸ CD10⁺CD34^-CD105⁺CD200⁺ плацентарных стволовых клеток, если GVHD развивается и прогрессирует выше степени I.

5.1.4 Лечение легочного расстройства, вызванного болезнью «трансплантат против хозяина»

У индивидуума, которому была проведена пересадка аллогенного трансплантата костного мозга, наблюдается облитерирующий бронхиолит и третья степень болезни «трансплантат против хозяина». Индивидууму внутривенно вводят от 5×10⁸ до 1×10⁹ CD10⁺CD34^-CD105⁺CD200⁺ плацентарных стволовых клеток в 0,9%-ном растворе NaCl в течение 24 часов после появления признаков болезни, и с использованием спирометрии за индивидуумом ведется ежедневное наблюдение в течение одной недели для определения улучшений в дыхании. Если дыхание значительно не улучшается в течение 4-7 дней после первого введения (что оценивают как, по меньшей мере, 10%-ное улучшение либо в объеме форсированного выдоха за 1 секунду (FEV₁), либо в форсированной жизненной емкости легких (FVC), или как увеличение соотношения FEV₁/FVC, по меньшей мере до 80%), то повторяют введение клеток. В дополнение к плацентарным стволовым клеткам индивидууму, необязательно, вводят один или несколько из: вводимого с помощью ингаляции стероида, перорального стероида или азитромицина (например, 250 мкг один раз в день в течение приблизительно 3 месяцев после проявления симптомов). Индивидуум находится под наблюдением в течение последующих 100 дней, и ему вводят последующую дозу от 5×10⁸ до 1×10⁹ CD10⁺CD34^-CD105⁺CD200⁺ плацентарных стволовых клеток в любое время при повторном возникновении GVHD III степени (или более высокой степени), или если FEV₁ или FVC снижаются в любое время на 10% или больше, или если соотношение FEV₁/FVC падает ниже 70%.

5.1.5 Лечение легочного расстройства, вызванного болезнью «трансплантат против хозяина»

У индивидуума, которому была проведена пересадка печени, наблюдается облитерирующий бронхиолит и третья степень болезни «трансплантат против хозяина». Индивидууму внутривенно вводят от 2×10⁸ до 8×10⁸ CD10⁺CD34^-CD105⁺CD200⁺ плацентарных стволовых клеток в 0,9%-ном растворе NaCl (0-й день); второе введение проводят через 7 дней. В интервале между дозами и в течение 7 дней после введения последней дозы за индивидуумом ведется ежедневное наблюдение с использованием спирометрии для определения улучшений в дыхании. Если дыхание значительно не улучшается в течение 4-7 дней после второго введения (что оценивают как, по меньшей мере, 10%-ное улучшение либо в объеме форсированного выдоха за 1 секунду (FEV₁), либо в форсированной жизненной емкости легких (FVC), или как увеличение соотношения FEV₁/FVC, по меньшей мере до 75%), или если GVHD не снижается до степени II или ниже, то повторяют введение клеток, и в дополнение к плацентарным стволовым клеткам индивидууму вводят один или несколько из: вводимого с помощью ингаляции стероида, перорального стероида или азитромицина (например, 250 мкг один раз в день в течение приблизительно 3 месяцев после проявления симптомов). Индивидуум находится под наблюдением в течение последующих 100 дней, и ему вводят последующую дозу 5×10⁸ до 1×10⁹ CD10⁺CD34^-CD105⁺CD200⁺ плацентарных стволовых клеток в любое время при повторном возникновении III степени (или более высокой степени) GVHD, или если FEV₁ или FVC снижаются в любое время на 10% или больше, или если соотношение FEV₁/FVC падает ниже 70%.

5.1.6 Лечение легочных расстройств, ассоциированных с ревматоидным артритом

У индивидуума наблюдается ревматоидный артрит, затрагивающий легкие. Индивидууму внутривенно вводят 1-5×10⁸ CD10⁺CD34^-CD105⁺CD200⁺ плацентарных стволовых клеток в 0,9%-ном растворе NaCl. Индивидуум получает метотрексат в стандартной дозировке и наблюдают снижение воспалительного процесса в легких.

У второго индивидуума наблюдается ревматоидный артрит, затрагивающий легкие. Поражение легких частично обусловлено введением метотрексата. Терапию метотрексатом приостанавливают, и индивидууму вводят комбинацию немодифицированных плацентарных клеток и плацентарных клеток, которые были модифицированы для продукции слитого полипептида, включающего в себя IL-1Ra и DHFR, причем два типа стволовых клеток вводят в соотношении 1:1. Генно-модифицированные и немодифицированные клетки составляют 1-5×10⁸ CD10⁺CD34^-CD105⁺CD200⁺ плацентарных стволовых клеток в 0,9%-ном растворе NaCl. У индивидуума наблюдают снижение воспалительного процесса в легких.

5.1.7 Лечение легочного расстройства, ассоциированного с системным волчаночным эритематозом

У индивидуума наблюдается пневмония и васкулит легких, в дополнение к лихорадке, слабости, артралгии (боли в суставах), диплопии (двоению в глазах), страбизму и гипоэстезии в двух руках и ногах, микрогематурии (детектируемого количества крови в моче), гипокомплементемии и высоким титрам аутоиммунных антител. Поставлен диагноз системного волчаночного эритематоза. Индивиуум плохо поддается лечению с помощью пульсотерапии метилпреднизолоном и циклофосфамидом. Индивидууму внутривенно вводят от 1×10⁹ до 5×10⁹ CD10⁺CD34^-CD105⁺CD200⁺ плацентарных стволовых клеток в 0,9%-ном растворе NaCl (0-й день), и вводят вторую дозу через 7 дней. За индивидуумом ведется наблюдение в течение последующих 30-100 дней в отношении снижения легочной функции, на которое указывают снижение либо в объеме форсированного выдоха за одну секунду (FEV₁), либо в форсированной жизненной емкости легких (FVC), или снижение соотношения FEV₁/FVC. С учетом состояния индивидуума, введение плацентарных стволовых клеток считается эффективным, если любой из этих показателей не ухудшается.

5.1.8 Лечение легочного расстройства, ассоциированного с воспалительной болезнью кишечника

У индивидуума, которому ранее был поставлен диагноз воспалительной болезни кишечника, наблюдается диспноэ, не ассоциированное с сульфасалазином или 5-аминосалициловой кислотой. Другие причины диспноэ (например, аллергия, астма и т.п.) были исключены. Кроме того индивидуум плохо поддавался лечению пероральными стероидами и иммуносупрессантами. В связи с подозрением на то, что воспалительная болезнь кишечника затрагивает легкие, индивидууму вводят внутривенно от 5×10⁸ до 1×10⁹ CD10⁺CD34^-CD105⁺CD200⁺ плацентарных стволовых клеток в 0,9%-ном растворе NaCl. В течение последующих 7-14 дней индивидуум находится под наблюдением на предмет улучшения диспноэ, оцениваемого как, по меньшей мере, 10%-ное улучшение либо в объеме форсированного выдоха за 1 секунду (FEV₁), либо в форсированной жизненной емкости легких (FVC), или как увеличение соотношения FEV₁/FVC, по меньшей мере, до 75%.

5.1.9 Лечение легочного расстройства, ассоциированного со склеродермой

У индивидуума, у которого ранее была диагностирована склеродерма, наблюдается поражение легких, диагностируемое как интерстициальная болезнь легких, о которой свидетельствует снижение диффузионной способности по окиси углерода (DLCO) по сравнению с нормой, и которую подтверждает присутствие лимфоцитов и эозинофилов в бронхоальвеолярном лаваже. Индивидууму вводят внутривенно от 5×10⁸ до 1×10⁹ CD10⁺CD34^-CD105⁺CD200⁺ плацентарных стволовых клеток в 0,9%-ном растворе NaCl. За индивидуумом ведется наблюдение в течение последующих 30-100 дней в отношении любого детектируемого улучшения в DLCO, диспноэ и/или присутствия лимфоцитов и эозинофилов в бронхоальвеолярном лаваже; любое снижение указывает на то, что введение плацентарных клеток является эффективным.

5.1.10 Лечение интерстициальной болезни легких

У индивидуума наблюдаются диспноэ, потеря веса, сухой непродуктивный кашель и соотношение FEV₁/FVC ниже 80%. Поставлен диагноз интерстициальной болезни легких. Вследствие того, что причина заболевания легких не очевидна, заболевание характеризуют как идиопатическое. Индивидууму вводят внутривенно от 5×10⁸ до 1×10⁹ CD10⁺CD34^-CD105⁺CD200⁺ плацентарных стволовых клеток в 0,9%-ном растворе NaCl. За индивидуумом ведется наблюдение, по меньшей мере, один раз в месяц в течение года в отношении любого детектируемого улучшения или снижения скорости ухудшения либо объема форсированного выдоха за 1 секунду (FEV₁), либо форсированной жизненной емкости легких (FVC), или снижения соотношения FEV₁/FVC. Введение плацентарных стволовых клеток считается эффективным, если любой из этих показателей не ухудшается. Если возникает ухудшение любого из этих параметров, то индивидууму вводят следующую дозу, такую же как исходная доза.

У индивидуума наблюдаются диспноэ, потеря веса, сухой непродуктивный кашель и соотношение FEV₁/FVC ниже 80%. Поставлен диагноз интерстициальной болезни легких. По-видимому, интерстициальная болезнь легких является следствием недавнего воздействия асбеста, что подтверждается информацией о работе, сухим треском при вдохе, и рентгенографией грудной клетки, показывающей бляшки выше диафрагмы. Индивидууму вводят внутривенно от 5×10⁸ до 1×10⁹ CD10⁺CD34^-CD105⁺CD200⁺ плацентарных стволовых клеток в 0,9%-ном растворе NaCl, необязательно, в комбинации с пероральном кортикостероидом. За индивидуумом ведется наблюдение, по меньшей мере, один раз в месяц в течение всей оставшейся жизни индивидуума в отношении любого детектируемого улучшения или снижения скорости ухудшения либо объема форсированного выдоха за 1 секунду (FEV₁), либо форсированной жизненной емкости легких (FVC), или снижения соотношения FEV₁/FVC. Учитывая состояние индивидуума, введение плацентарных стволовых клеток считается эффективным, если любой из этих показателей не ухудшается. Если возникает ухудшение любого из этих параметров, то индивидууму вводят следующую дозу, такую же как исходная доза.

5.1.11 Лечение интерстициальной болезни легких

У индивидуума наблюдаются диспноэ, постоянный кашель и увеличение грудной клетки. У индивидуума наблюдается соотношение FEV₁/FVC ниже 60%, даже после бронходилаторной терапии. Исходя из информации о пациенте, как о курильщике, поставлен диагноз хронической обструктивной болезни легких (эмфиземе). Индивидууму вводят внутривенно от 5×10⁸ до 1×10⁹ CD10⁺CD34^-CD105⁺CD200⁺ плацентарных стволовых клеток в 0,9%-ном растворе NaCl, необязательно, в комбинации с бронходилатором, таким как альбутерол, и кортикостероидом для введения с помощью ингаляции. За индивидуумом ведется наблюдение с помощью спирометрии, по меньшей мере, один раз в месяц в течение всей оставшейся жизни индивидуума в отношении любого детектируемого улучшения или снижения скорости ухудшения либо объема форсированного выдоха за 1 секунду (FEV₁), либо форсированной жизненной емкости легких (FVC), или снижения соотношения FEV₁/FVC. Учитывая состояние индивидуума, введение плацентарных стволовых клеток считается эффективным, если любой из этих показателей не ухудшается.

5.2 ПРИМЕР 2: СПЕЦИФИЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ПЛАЦЕНТАРНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В ЛЕГКИХ

Биораспределение плацентарных стволовых клеток оценивали на иммунокомпрометированных мышах.

В пилотном исследовании CD10⁺CD34^-CD105⁺CD200⁺ плацентарные стволовые клетки вводили в качестве одиночных и/или повторных инъекций в хвостовую вену самцов и самок мышей NOD-SCID или самцов мышей C57BL/10SgSnAi-Rag2(tmi)γc(tmi) (Taconic Farms, Germantown, New York). Мышей забивали на 4-й, 14-й, 28-й или 47-й дни после лечения, и образцы легких, печени, сердца, почек, селезенки, надпочечников, костного мозга и головного мозга получали и анализировали с помощью количественной ПЦР. После внутривенного введения ДНК человека детектировалась в выделенной общей ДНК из образцов легких, головного мозга, сердца и/или печени у мышей, которых забивали через 4 дня после введения клеток. Наиболее высокий уровень ДНК детектировался в легких. Результаты указывают на то, что биораспределение плацентарных стволовых клеток в основном было ограничено легкими на 4-й день после введения клеток. ДНК человека не детектировалась в образцах тканей мышей, забитых на 14-й, 28-й или 47-й дни после введения клеток.

Было проведено второе исследование, в котором у мышей, которым внутривенно вводили плацентарные стволовые клетки либо в качестве одной дозы или повторных доз на 1-й, 4-й и 7-й дни, оценивали биораспределение и сохранность плацентарных стволовых путем детекции гена теломеразной обратной транскриптазы человека (hTERT). Мышей забивали через 4 и 24 часа после первой внутривенной дозы плацентарных стволовых клеток, а также через 4 часа после дозы в день 7 (3-я повторная доза) и на 37-й и 92-й день. ДНК человека детектировали через 4 часа после введения дозы в большинстве тестируемых тканей, включая большинство образцов легких, места инъекции, печени, селезенки и сердца, что указывает на быстрое распределение клеток по органам с усиленным кровотоком. Однако через 24 часа после введения клеток только легочная ткань неизменно содержала ДНК человека, в то время как другие ткани за исключением мест инъекции и одного образца головного мозга были свободны от ДНК человека. Через 7 дней после введения дозы только легкие и небольшое число образцов из места инъекции все еще были положительными по ДНК человека. На 37-й день только один образец легочной ткани был слабоположительным по ДНК человека. На 92-й день ДНК человека не детектировалась ни в одной ткани ни одного животного. После повторной внутривенной инъекции 1×10⁶ клеток на мышь плацентарные стволовые клетки детектировались в тех же тканях через 4 часа спустя третьей инъекции, в каких они детектировались через 4 часа спустя одной внутривенной инъекции, и все ткани были полностью свободны от ДНК человека на 92-й день.

5.3 ПРИМЕР 3: АНАЛИЗ ПЛАЦЕНТАРНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В БЛЕОМИЦИНОВОЙ МОДЕЛИ МЫШЕЙ C57BL/6

В этом примере приведены исследования, демонстрирующие эффективность плацентарных стволовых клеток при лечении фиброзной болезни легких. В этом примере плацентарные стволовые клетки представляют собой размноженные в культуре CD34^-, CD10⁺, CD105⁺, CD200⁺ клетки из плаценты, прикрепляющиеся к пластику для культивирования тканей. После размножения клетки сохраняли нормальный кариотип, и имели концентрацию приблизительно 7,5×10⁶ клеток/мл.

Исследование на мышах

Блеомицин является цитостатическим лекарственным соединением, обычно используемым для лечения рака. Введение блеомицина обычно приводит к хроническому легочному воспалению, которое может развиться в фиброз. В связи с этим, введение блеомицина экспериментальным животным является принятой моделью легочного фиброза у человека.

Восемьдесят четыре самца 6-недельных мышей C57CL6 с весом 20-22 граммов оставляли акклиматизироваться на 72 часа, а затем разделяли по 12 на каждую из семи различных групп: (1) введение физиологического раствора (отрицательный контроль); (2) блеомицин; (3) физиологический раствор+1,5×10⁶ плацентарных стволовых клеток; (4) блеомицин+носитель; (5) блеомицин+1,5×10⁶ плацентарных стволовых клеток; (6) блеомицин (в 0,9%-ном растворе NaCl)+1,5×10⁶ нормальных дермальных фибробластов человека (NHDFs); и (7) блеомицин+пирфенидон. Блеомицин, физиологический раствор и клетки вводили внутривенно в хвостовую вену в объеме раствора 400 мкл. Перфенидон вводили перорально в количестве 400 мг/кг/день в 0,5%-ном растворе карбоксиметилцеллюлозы. В каждой группе шесть мышей забивали через 10 дней после введения, а оставшихся шесть мышей забивали на 21-й день.

Результаты введения оценивали с помощью бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) и иммуногистохимии. Уровень TNF-α, TGF-β, фактора роста соединительной ткани (CTGF), тромбоцитарного фактора роста (PDGF), фактора роста кератиноцитов (KGF), фактора роста гепатоцитов (HGF), интерлейкина-13 (IL-13), IL-1β, IL-10 и IL-8 в БАЛ и гомогенате легких определяли с помощью ELISA или сравнительной методологии.

Для иммуногистохимии легочные доли перфузировали формалином+коктейль для ингибирования фосфатаз. Степень отложения коллагена анализировали отчасти путем измерения гидроксипролина в легочной ткани. Кратко, легкие гомогенизировали в 5 мл физиологического раствора и расщепляли в 2 мл 6N HCl в течение 16 часов при 110°С. После нейтрализации с помощью NaOH до рН 7, добавляли один мл реагента хлорамина Т, 0,5 моль/л, и реакцию оставляли при комнатной температуре на 20 минут. Затем к каждому образцу добавляли 1 мл 3,15N перхлорной кислоты и п-диметиламинобензальдегида и инкубировали в течение 20 минут при 65°С. Образцы охлаждали в течение 10 минут, затем измеряли поглощение при 557 нм на спектрофотометре, используя концентрации транс-24-гидрокси-L-пролина от 0 до 5 мг/мл в качестве стандартной кривой. Более высокое содержание гидроксипролина указывает на большее количество отложений коллагена. Смотри статью Krishna, G., et al. Am. J. Path. 158:997-1004 (2001).

Гистопатологическое исследование включает исследование ткани легких на присутствие фиброза или фиброзные образования. Плацентарные стволовые клетки идентифицировали окрашиванием антителами, специфичными к виментину человека.

Эффективность действия плацентарных стволовых клеток была установлена путем демонстрации более низкого уровня любого воспалительного цитокина по сравнению с контролями, в которых вводили только блеомицин, или значительно меньшим уровнем гидроксипролина в гомогенате легких в присутствии плацентарных стволовых клеток относительно контролей, в которых вводили только блеомицин.

Исследование на крысах

Шестьдесят 7-8-недельных самцов крыс SD® (Charles River Laboratories) весом приблизительно 176-225 г разделяли на пять групп: (1) внутритрахеальное введение носителя (0,9%-ный раствор NaCl) с последующим внутривенным введением носителя через 15 минут; (2) внутритрахеальное введение носителя с последующим внутривенным введением 4,0×10⁶ плацентарных стволовых клеток в объеме раствора 800 мкл; (3) внутритрахеальное введение блеомицина (например, БЛЕНОКСАН®, 3 единицы на кг) с последующим внутривенным введением носителя через 15 минут; (4) внутритрахеальное введение блеомицина (3 единицы на кг) с последующим внутривенным введением 1,0×10⁶ плацентарных стволовых клеток в объеме раствора 800 мкл; и (5) внутритрахеальное введение блеомицина (3 единицы на кг) с последующим внутривенным введением 4,0×10⁶ плацентарных стволовых клеток через 15 минут в объеме раствора 800 мкл.

Через 15 дней у животных оценивали различные физиологические параметры. У всех животных определяли вес тела. У всех животных отбирали образцы крови (0,2 мл) через яремную вену и анализировали содержание газов в периферической крови, и другой образец, ~3,5 мл, отбирали через периорбитальную пазуху для выделения сыворотки. Анализ содержания газов в крови включает в себя анализ pH, pCO₂, pO₂, aHCO₃ (актуальная HCO₃), tCO₃, CO-оксиметрических измерений (например, гемоглобина, процентного содержания оксигемоглобина, насыщенного оксигемоглобина, карбоксигемоглобина и метгемоглобина).

Всех животных дополнительно тестировали перед смертью на легочную функцию, используя аппарат flexiVent (SCIREQ®), и собирали данные по Ньютоновскому сопротивлению (измерению сопротивления центральных дыхательных путей) и изменению объема легких при колебаниях давления.

Шесть животных из каждой группы забивали и легкие анализировали на сырой вес, отношение веса к весу животного, отложение коллагена (с помощью анализа содержания гидроксипролина, смотри выше); а также проводили гистопатологический анализ (на присутствие фиброза и степень воспаления с помощью окрашивания гематоксилином/эозином). У оставшихся шести животных в каждый группе проводили бронхоальвеолярный лаваж, и в лаважной жидкости анализировали общее содержание лейкоцитов.

Данные, полученные в исследовании как описано выше, анализировали с помощью вариационного анализа, сравнивая группу 1 с группами 2-5; сравнивая группу 2 с группами 4 и 5; сравнивая группу 3 с группами 4 и 5; и сравнивая группы 4 и 5. Ожидается, что общий эффект лечения будет достоверным (p<0,05). Ожидается, что введение плацентарных стволовых клеток даст значительный эффект у животных, подвергавшихся воздействию блеомицина, получавших клетки (группы 4 и 5), по сравнению с животными, подвергавшихся воздействию блеомицина, не получавших клетки (группа 3), в отношении, по меньшей мере, одной из легочных функций, определяемых с помощью flexiVent, фиброза (по отложению коллагена, определяемого с помощью измерения гидроксипролина), или воспаления (о котором свидетельствует снижение содержания воспалительных клеток, присутствующих в бронхоальвеолярной лаважной жидкости, или иммуногистохимия легочной ткани).

5.4 ПРИМЕР 4: ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛЕЧЕНИЯ ВОСПАЛЕНИЯ ЛЕГКИХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЖИВОТНОЙ МОДЕЛИ

В этом пример описано проведение доклинического исследования, демонстрирующего, что выделенные плацентарные стволовые клетки, введенные внутривенно, снижают воспаление дыхательных путей.

В эксперименте использовали группу, включающую 8-12-недельных (соответствующих по возрасту) самцов мышей C57BL/6. Мыши содержались в 12-часовом световом/темновом цикле в виварии барьерного типа. Пища и жидкость для питья были доступны ad libitum.

В эксперимент были включены семь групп, состоящие из 18 мышей каждая. Мышам в группах 1-4 и 6 вводили по каплям в дыхательные пути бактериальный липополисахарид (LPS), стандартный индуктор воспаления, один раз в день в течение пяти дней для индукции воспаления в дыхательных путях, от среднего до тяжелого (по данным гистологического исследования). Мыши в группах 1 и 2 получали выделенные плацентарные стволовые клетки или плацентарные стволовые клетки в количестве 0,5 или 1,0 миллиона клеток на животное с помощью внутривенной инъекции, например, в хвостовую вену. Мышам из 3-й группы вводили с помощью инъекций дермальные фибробласты человека в количестве 1,0 миллиона клеток на животное с помощью внутривенной инъекции, и они служили в качестве клеточного отрицательного контроля. Мыши из 4-й группы получали носитель и служили в качестве базовой отрицательной контрольной группы. Мыши из 5-й группы служили в качестве контрольной группы для заболевания и им вводили по каплям фосфатно-солевой буфер, и они не получали LPS. Лечение проводили через 1 час после введения LPS. Мыши из 6-й группы служили в качестве положительного контроля и получали референсное соединение, дексаметазон, в количестве 10 мг/кг, который вводили с помощью внутрибрюшинной инъекции через 1 час после воздействия LPS. Мыши из 7-й группы получали только внутривенное введение 1,0 миллиона выделенных плацентарных стволовых клеток или плацентарных стволовых клеток для контроля введения клеток, например, относительно проникновения макрофагов в легочные ткани.

Воспаление в легких вызывали введением 2 мкл LPS в 30 мкл PBS посредством внутритрахеального введения по каплям один раз в день в течение пяти дней. Животным из контрольной группы для заболевания вводили по каплям равный объем фосфатно-солевого буфера. Группу для каждого воздействия разделяли на три подгруппы по 6 мышей в каждой. У групп из 6 мышей проводили бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ) и ткани собирали через 6, 24 или 48 часов после воздействия LPS.

От каждого животного собирали следующие образцы через 6, 24 и 48 часов: периферическую кровь; БАЛ-жидкость, собранную после закапывания 3×1 мл 0,1%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина в фосфатно-солевом буфере через трахеальную канюлю; и легкие. Клеточный состав бронхоальвеолярной лаважной жидкости определяли с помощью FACS-анализа с анти-Grl, анти-CD11b (Mac1) и анти-CD45 антителами, используя цитометр Becton Dickinson FACScan. Клеточный состав лаважа выражен в процентах Grl⁺ и CD11b⁺ клеток из отобранной популяции лимфоцитов. Одно из легких гомогенизировали и использовали для определения уровней TNFα, IL-1β, mKC (мышиного гомолога IL-8), IL-10, MIP-1α и MIP-2. Второе легкое фиксировали в 10%-ном формалине и обрабатывали для гистопатологического анализа с помощью H&E. Также в сыворотке мышей измеряли с помощью ELISA уровни TNFα, IL-1β, mKC, IL-10, MIP-1a и MIP-2.

Степень воспаления в дыхательных путях определяли анализом инфильтрации нейтрофилов, детектируемой с помощью FACS-анализа легочных и бронхоальвеолярных лаважных жидкостей, по увеличению содержания CD45⁺CD11b⁺ клеток, представляющих первичные моноциты/макрофаги и полиморфные гранулоциты, и CD45⁺Grl⁺ клеток, преимущественно являющихся нейтрофилами и полиморфными гранулоцитами. Введение плацентарных стволовых клеток после индукции воспаления вызывает значительное снижение содержания либо CD45⁺CD11b⁺ клеток, CD45⁺Grl⁺ клеток, либо двух этих типов клеток, присутствующих в жидкостях легочного или бронхоальвеолярного лаважа. Воспаление также определляли по уровню TNFα, IL-lβ, mKC, IL-10, MIP-1a и MIP-2 в жидкости БАЛ. Введение плацентарных стволовых клеток снижает уровень одного или нескольких, или всех этих цитокинов. Лечение дексаметазоном (референсное соединение) в концентрации 10 мг/кг снижает появление нейтрофилов в легких и лаваже после введения LPS.

Эквиваленты:

Композиции и способы, раскрытые в настоящем документе, не ограничены по объему конкретными вариантами осуществления, описанными в настоящем документе. Напротив, из приведенного выше описания и сопровождающих фигур опытным специалистам в данной области будут очевидны различные модификации композиций и способов в дополнение к описанным. Предполагается, что такие модификации попадают в объем приложенной формулы изобретения.

В настоящем описании приведены различные публикации, патенты и патентные заявки, раскрытие которых полностью включено путем ссылки.