СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ РОДА SALMONELLA В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

Изобретение относится к области биохимии и микробиологии, касается выявления бактерий рода Salmonella.

Бактерии рода Salmonella могут присутствовать в патологическом материале в небольшом количестве вместе с большим числом других бактерий. Поэтому предварительное обогащение просто необходимо.

Известен стандартный способ выявления бактерий рода Salmonella в пищевых продуктах, состоящий из двух этапов обогащения: на первом этапе - этапе неселективного обогащения - часть пробы массой 25 г помещают в 225 мл забуференной пептонной воды (ЗПВ) и инкубируют при температуре 37°С 24±3 часа. Далее 1 см³ культуры пересевают в среды для селективного обогащения, благоприятные для накопления сальмонелл: среду Раппапорта-Вассилиадиса с соей (RVS-бульон) и одну из двух сред: Мюллер-Кауфман тетратионатный бульон (МКТ-бульон) или селенитовую среду. После посева RVS-бульон инкубируют при температуре (41,5±1,0)°С в течение (24±3) ч, а МКТ-бульон и селенитовую среду - при температуре (37±1)°С в течение (24±3) ч, т.е. выполняют второй этап обогащения. Для идентификации сальмонелл полученные культуры пересевают на две селективные агаризованные среды: ксилоза-лизин-дезоксихолатный агар (XLD-агар) и на одну из следующих агаризованных сред: висмут-сульфит агар, среду Плоскирева, среду Эндо, среду Левина или бриллиантовый зеленый агар. Посевы на агаризованных средах инкубируют при температуре (37±1)°С в течение (24±3) ч. [1]. Недостатком данного способа является наличие двух обязательных этапов бактериологического анализа, что увеличивает сроки проведения диагностики.

Сальмонеллы образуют кислоту при ферментации пропиленгликоля [2-4].

Пропиленгликоль входит в состав хромогенной дифференциально-диагностической среды для идентификации сальмонелл в пищевых продуктах, сырье и клиническом материале Рамбах-агар (RAMBACH^® agar for the identification of Salmonella, Мерк, Германия). Дезоксихолат натрия ингибирует сопутствующую грамположительную микрофлору. Сальмонеллы продуцируют кислоту из пропиленгликоля, в результате чего происходит изменение рН среды и колонии сальмонелл окрашиваются в красный цвет. Для дифференциации сальмонелл от колиформных бактерий в состав среды включена хромогенная смесь, которая выявляет наличие фермента β-галактозидазы - характерного фермента колиформных бактерий. Колиформные бактерии растут в виде сине-зеленых или сине-фиолетовых колоний. Остальные энтеробактерии и грамотрицательные бактерии, такие как Proteus, Pseudomonas, Shigella, вырастают в виде бесцветных желтоватых колоний. РАМБАХ-агар обеспечивает однозначную дифференциацию сальмонелл от других бактерий.

Состав среды (г/л): пептон 8.0; хлорид натрия 5.0; дезоксихолат натрия 1.0; хромогенная смесь 1.5; пропиленгликоль 10.5; агар-агар 15.0.

Приготовление среды. Добавить 1 флакон жидкой хромогенной смеси среды к 250 мл дистиллированной воды и перемешать до полного растворения. Добавить 1 флакон порошка среды (питательная основа), дать среде набухнуть в течение 20-30 минут, перемешать до полного растворения. Колбу со средой нагревать на кипящей водяной бане с периодическим помешиванием. Среда полностью растворяется. Стандартное время до полного растворения для 250 мл - 20-25 мин. Охладить среду как можно быстрее на водяной бане 45-50°С. Во время этой процедуры (максимум 30 минут) следует помешивать среду время от времени. Разлить по чашкам. Для предотвращения образования осадка следует разместить чашки Петри на охлажденной поверхности стола (максимум 25°С). Готовые чашки со средой опалесцируют и слегка розовые. Перед посевом чашки следует подсушить. рН: 7.3±0.2 при 25°С.

Ход исследования. После этапа селективного обогащения посеять на ¼ поверхности агара петлей. Для того чтобы получить изолированные колонии - той же петлей посеять на оставшуюся поверхность чашки. Инкубировать в аэробных условиях 24-48 часов при 35-37°С.

Недостатком указанной питательной среды является невозможность ее использования на первом этапе селективного обогащения.

Целью заявляемого изобретения является ускорение выявления бактерий рода Salmonella в пищевых продуктах.

Поставленная цель достигается тем, что при выявлении бактерий рода Salmonella в пищевых продуктах на этапе обогащения сальмонелл в неселективной жидкой среде во флаконы с 225 мл с готовой забуференной пептонной водой вводят 0,6 г пропиленгликоля для продуцирования кислоты сальмонеллами.

Заявляемый способ выявления бактерий рода Salmonella в пищевых продуктах позволяет через 24 часа исследования получить ответ о присутствии бактерий рода Salmonella в образце продукта на основании изменения рН питательной среды в кислую сторону в результате продуцирования кислоты сальмонеллами, что сокращает срок микробиологического анализа на 24 часа.

Забуференная пептонная вода служит средой первичного обогащения, которую используют для повышения высеваемости поврежденных сальмонелл из пищевых продуктов (перед селективным обогащением и выделением). Она рекомендована также международным комитетом (ISO 6579: 1993). Состав: протеозопептон - 10,0 г/л; натрия хлорид - 5,0 г/л; натрия гидрофосфат - 3,5 г/л; калия дигидрофосфат - 1,5 г/л. Выпускается в виде гомогенного светло-желтого порошка.

Пропиленгликоль - бесцветная вязкая жидкость со слабым характерным запахом, сладковатым вкусом, обладающая гигроскопическими свойствами. Синонимы: 1,2-пропиленгликоль, пропандиол, монопропиленгликоль. Выпускается промышленностью. Изменяет рН питательной среды в кислую сторону в результате продуцирования кислоты сальмонеллами.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Приготовление питательной среды.

Для приготовления питательной среды размешивали 20,0 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды. Разливали в стерильные флаконы и стерилизовали автоклавированием при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин пропиленгликолем. К 225 мл стерильной забуференной пептонной воды добавляли 0,6 г пропиленгликоля.

Пример 2. Неселективное обогащение сальмонелл.

В работе использовали 4 штамма сальмонелл: S. choleraesuis №1348, S. typhimurium №79, S. enteritidis №5765, S. dublin №780. Во флаконы серии №1 (n=40) с питательной средой, согласно прим. 1, инокулировали по 0,5 мл микробной взвеси 10⁵ млрд/мл.

В качестве контроля во флаконы серии №2 (n=20) с забуференной пептонной водой инокулировали по 0,5 мл микробной взвеси 10⁵ млрд/мл.

Для сравнительного анализа во флаконы серии №3 (n=20) инокулировали по 0,1 мл микробной взвеси 10⁵ млрд/мл из штаммов E. coli 675 №240417 и Shigella flexori1a 851b №232412.

Все посевы во флаконах серий №1, №2, №3 имели нейтральный уровень рН. Все посевы во флаконах серий №1, №2, №3 инкубировали при температуре 37°С в течение 24 часов.

На вторые сутки исследований определяли водородный показатель, который составил: во флаконах серии №1 (согласно предлагаемому изобретению) - 6,35±0,18 (сдвиг рН в кислую среду), во флаконах №2 (контроль) - 6,94±0,2 (сохранялся нейтральный уровень рН); во флаконах №3 - 6,93±0,2 (сохранялся нейтральный уровень рН).

Таким образом, после первого этапа исследований во флаконах серии №1 сдвиг реакции среды в кислую сторону указывает на наличие сальмонелл в исследуемой пробе продукта.

Пример 3. Идентификация сальмонелл.

Микробиологической петлей распределяли материал из питательной среды флаконов серии 1, согласно прим.2, на поверхность висмут-сульфит агара в чашках Петри (n=40). Через 24 часа в 35 чашках наблюдали рост единичных культур, через 48 часов - более 100 культур во всех чашках. По результатам биохимической и серологической идентификации выращенные нами сальмонеллы соответствуют заявленным серотипам.

В патентной и научно-технической литературе не обнаружены технические решения, аналогичные заявляемому с использованием пропиленгликоля на первом этапе неселективного обогащения сальмонелл, что свидетельствует о новизне предлагаемого решения.

Литература

1. ГОСТ Ρ 52814 - 2007. Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella.

2. Rambach Α. // Environ. Microbiol. - 1990. - Vol. 56. - P. 301.

3. Greenberg A.E., Trussel R.R., Clesceri L.S. (Eds.). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 16th ed., APHA, Washington, D.C. - 1985.

4. Greenwald R., Henderson R.W. and Yappaw S. // J. Clin. Microbiol. - 1991. - Vol. 29. - P. 2354.