ЛАКТОФЕРРИН И РАЗВИТИЕ ЗДОРОВОГО МОЗГА У МЛАДЕНЦЕВ

Настоящее изобретение в основном относится к области здоровья мозга, защиты мозга и развития мозга. Одно из воплощений настоящего изобретения относится к композиции, которая может применяться для лечения или профилактики замедленного мозгового развития и/или замедленного развития нервной системы. Защищаться могут нейрональные клетки в мозге. Также может быть улучшена когнитивная деятельность.

Материнское молоко рекомендовано для всех младенцев. Однако в некоторых случаях грудное вскармливание бывает недостаточным, или безуспешным, или нецелесообразным по медицинским причинам, или же мать отказывается от кормления грудью - вообще или в течение периода более нескольких недель. Для таких случаев разработаны искусственные смеси для вскармливания младенцев. Смеси для вскармливания младенцев в настоящее время широко используются в качестве дополнительного или единственного источника питания на ранних сроках жизни. Они могут использоваться при кормлении младенцев вместо или в дополнение к материнскому молоку. Соответственно, в настоящее время они часто разрабатываются таким образом, чтобы в максимально возможной степени быть сходными с материнским молоком в отношении их состава и функции.

В последнее время набирается все больше свидетельств того, что грудное вскармливание может обеспечивать отдаленные преимущества в отношении когнитивных способностей, в частности у младенцев, рожденных недоношенными или с малой массой тела (Anderson и др., Am J Clin Nutr 1999; 70:525-35; Lucas и др., Lancet 1992; 339:261-4). Однако механизм, лежащий в основе зависимости между грудным вскармливанием и развитием познавательных способностей, остается непроясненным. Было предположено, что некоторую роль в наблюдаемом эффекте могут играть докозагексаеновая кислота (DHA) и арахидоновая кислота (АА), которые присутствуют в женском молоке.

Дальнейшие исследования указывают, что способности к обучению и память у поросят улучшали диетические добавки сиаловой кислоты (Wang и др., 2007, American Journal of Clinical Nutrition, том 85, №2, 561-569). Сиаловая кислота известна в качестве ключевого компонента как олигосахаридов женского молока, так и нервных тканей.

Нервная система представляет собой очень сложную сеть, образованную нейрональными и глиальными клетками. Она имеется у всех видов млекопитающих. Нервная система состоит из центральной нервной системы (головной мозг и спинной мозг) и периферийной нервной системы (соматическая, автономная и кишечная нервная система). Центральная нервная система управляет когнитивными функциями (память, внимание, восприятие, действие и т.д.). Вместе с периферийной нервной системой она играет фундаментальную роль в управлении поведением.

Нервная система развивается во время беременности и затем совершенствуется в зрелую функциональную сеть в послеродовой период. Недоразвитость или задержки в развитии нервной системы приводят к задержкам в установлении важных биологических функций, которые она регулирует. Например, это может привести к замедленному установлению познавательных функций (способность к обучению, внимание и т.д.).

Общеизвестно, что когнитивное развитие и когнитивная работа оказывают значительное влияние на качество жизни. Поэтому было бы желательно располагать композицией, которая позволяла бы поддерживать развитие и функционирование нервной системы и мозга.

Соответственно, задача настоящего изобретения состояла в улучшении существующего уровня техники и обеспечении композиции, которая основывалась бы на натуральных ингредиентах и обеспечивала бы содействие развитию и функционированию нервной системы и мозга, в частности, у младенцев, например у младенцев с задержками внутриутробного развития (IUGR).

Эта задача решается с помощью объектов независимых пунктов формулы изобретения.

Авторы настоящего изобретения смогли продемонстрировать, что для улучшения развития мозга и познавательной функции может использоваться лактоферрин, например, композиция, с добавками лактоферрина.

Кроме того, было показано, что введение лактоферрина позволяет увеличить плотность нейронов и выживаемость нейронов.

Метаболические изменения в гиппокампе, обнаруживаемые магнитно-резонансной спектроскопией (MRS) после введения лактоферрина, предполагают модулирование способностей к обучению и кратковременной памяти.

Метаболические изменения в коре головного мозга после введения лактоферрина подразумевают модулирование долговременной памяти.

Лактоферрин (LF), также известный как лактотрансферрин (LTF), является глобулярным полифункциональным белком, который, как известно, демонстрирует противомикробную активность и является частью врожденной защиты организма, главным образом на слизистых оболочках.

Лактоферрин может быть обнаружен, например, в молоке и сыворотке, а также во многих выделениях слизистых, таких как слезы и слюна. Как таковой лактоферрин может быть выделен, например, из молока или же может быть продуцирован рекомбинантным способом.

Настоящее изобретение относится к лактоферрину, получаемому из любых источников.

Например, лактоферрин из молока или сыворотки имеет то преимущество, что он является натуральным ингредиентом, получаемым из пищевой композиции, и, следовательно, может применяться в виде обогащенной фракции пищевой композиции без дальнейшей очистки.

Лактоферрин, полученный рекомбинантным способом, имеет преимущество возможности его несложной выработки в высоких концентрациях.

Относительно высокую концентрацию лактоферрина имеет молозиво человека, вслед за которым идут женское молоко, а затем коровье молоко.

Композиция настоящего изобретения может быть особенно эффективна для IUGR-млекопитающих. «Задержка внутриутробного развития» (IUGR) является термином, используемым для описания состояния, при котором плод или младенец являются меньшими, чем ожидается для данного количества недель беременности. Плод или младенец с IUGR часто имеют массу, которая снижена по меньшей мере на 10% по сравнению с нормальными плодами или младенцами такого же гестационного возраста. Например, человеческий плод с IUGR может быть рожденным в срок (после 37 недель беременности) или преждевременно (до 37 недель).

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что лактоферрин или обогащенные лактоферрином композиции могут применяться для предохранения нейрональных клеток от дегенерации. Такая дегенерация может являться следствием, например, стресса. Было обнаружено, что лактоферрин содействует выживаемости нейронов и/или ограничивает или предотвращают гибель нейронов в мозге.

У младенцев лактоферрин и/или содержащие лактоферрин композиции настоящего изобретения могут применяться для защиты центральной нервной системы от любых стрессов, происходящих в период нейронального развития и, следовательно, для ограничения и/или предупреждения вызываемого стрессом замедления нейронального роста и связанной с этим когнитивной дисфункции.

Для целей настоящего изобретения термин «младенец» включает детей и охватывает субъектов в возрастном диапазоне от 0 до 14 лет.

Человеческий младенец в возрасте менее месяца является новорожденным. Термин «новорожденный» включает недоношенных младенцев, переношенных младенцев и доношенных новорожденных. Достигшие возраста одного года или начинающие ходить младенцы также именуются «детьми ясельного возраста» (как правило, 12-36 месяцев).

Лактоферрин и/или композиция настоящего изобретения могут вводиться, например,

- недоношенным или рожденным в срок младенцам, испытывающим задержку внутриутробного развития, которая может являться следствием любых неблагоприятных явлений во время беременности (курение матери, лечение матери, низкое качество плаценты, атипичное расположение плаценты, недостаточность питания матери и плода, и т.д.);

- недоношенным детям без задержек внутриутробного развития;

- младенцам с очень низкой/низкой массой тела при рождении;

- младенцам IUGR;

- новорожденным и детям, демонстрирующим замедление роста головного мозга после, например, гипоксии-ишемии при родах или после любых других неблагоприятных событий;

- новорожденным и детям, демонстрирующим когнитивную дисфункцию, умственную отсталость.

Лактоферрин или композиция настоящего изобретения может поэтому вводиться младенцу и/или матери во время беременности и/или в период кормления грудью.

Соответственно, одно воплощение настоящего изобретения является принимаемой внутрь композицией, обогащенной лактоферрином.

Обогащение означает, что лактоферрин был или добавлен к композиции так, чтобы конечное содержание лактоферрина в композиции было более высоко, чем содержание лактоферрина в композиции без добавления лактоферрина, или что композиция была подвергнута обработке таким образом, чтобы сконцентрировать обычное содержание лактоферрина в композиции.

Лактоферрин может также обеспечиваться в виде чистого вещества.

В качестве варианта лактоферрин может обеспечиваться в виде обогащенной лактоферрином фракции, например, обогащенной лактоферрином фракции молока или сыворотки.

В качестве источника молока или сыворотки могут использоваться, например, коровье молоко, женское молоко, козье молоко, молоко верблюдиц, кобылье молоко или молоко ослиц. Также может применяться молозиво.

В терапевтических применениях композиции вводятся в количестве, достаточном для по меньшей мере частичного излечения или снятия симптомов нарушений и/или осложнений. Подходящее для обеспечения такого действия количество определяется как «терапевтически эффективная доза». Эффективные для этих целей количества зависят от многих известных специалистам в данной области факторов, таких как серьезность заболевания, масса тела и общее состояние пациента. При профилактических применениях композиции согласно изобретению назначаются восприимчивым или иным образом подверженным риску развития определенного заболевания пациентам в количестве, которое является достаточным для по меньшей мере частичного снижения риска развития заболевания. Такое количество определяется как представляющее собой «профилактически эффективную дозу». Аналогично, точные количества зависят от ряда конкретных особенностей пациента, таких как состояние здоровья и масса пациента.

В рамках настоящего изобретения лактоферрин может вводиться в терапевтически эффективной дозе и/или в профилактически эффективной дозе.

Типичные обогащенные лактоферрином композиции могут содержать лактоферрин в количестве по меньшей мере 1,6 г/л.

Например, композиция настоящего изобретения может содержать лактоферрин в концентрации по меньшей мере 0,75 масс.%, предпочтительно по меньшей мере 1 масс.%.

В одном воплощении композиция предназначается для введения в таком количестве, которое соответствует потреблению по меньшей мере 0,25 г лактоферрина, предпочтительно по меньшей мере 0,5 г лактоферрина, более предпочтительно по меньшей мере 1 г лактоферрина в сутки на 1 кг массы тела.

Например, беременными и/или кормящими матерями композиция может потребляться в количестве, соответствующем по меньшей мере 1 г лактоферрина/1 кг массы тела в день.

Композиция может также потребляться детьми в количестве, соответствующем по меньшей мере 200 мг лактоферрина на 1 кг массы тела в день.

Лактоферрин может присутствовать в композиции в концентрации по меньшей мере 0,01 г на 100 ккал, предпочтительно по меньшей мере 0,1 г на 100 ккал. Например, количество присутствующего в композиции лактоферрина может находиться в диапазоне от около 0,01 г до 100 г, предпочтительно 01 г-50 г, еще более предпочтительно 2 г-25 г на 100 ккал композиции.

Лактоферрин может также применяться в комбинации с другими соединениями, такими как, например, сиаловая кислота и/или железо.

Особенно предпочтительная содержащая лактоферрин композиция может содержать дополнительно сиаловую кислоту в количестве, находящемся в диапазоне от 100 мг/100 г (масс.%) до 1000 мг/100 г (масс.%) композиции, например, в диапазоне от 500 мг/100 г (масс.%) до 650 мг/100 г (масс.%) композиции.

Композиция настоящего изобретения может содержать, например, по меньшей мере около 0,001 масс.% сиаловой кислоты. В следующих воплощениях настоящего изобретения композиция может содержать по меньшей мере около 0,005 масс.% или по меньшей мере около 0,01 масс.% сиаловой кислоты.

В качестве варианта или дополнительно содержащая лактоферрин композиция может содержать железо в количестве, находящемся в диапазоне от 1 мг/100 г (масс.%) до 50 мг/100 г (масс.%) композиции, например, в диапазоне от 10 мг/100 г (масс.%) до 30 мг/100 г (масс.%) композиции.

Одна содержащая лактоферрин композиция может содержать например, около 852 мг/100 г (масс.%) сиаловой кислоты и 22 мг/100 г (масс.%) железа.

Содержащая лактоферрин композиция настоящего изобретения может иметь плотность калорий в диапазоне от 30 ккал/100 г до 1000 ккал/100 г композиции, предпочтительно 50 ккал/100 г - 450 ккал/100 г композиции. Она может, например, иметь плотность калорий около 400 ккал/100 г.

Тип композиции специальным образом не ограничивается. Предпочтительно композиция предназначается для перорального или энтерального введения.

Композиция может быть выбрана, например, из группы, состоящей из пищевых продуктов, кормов для животных, фармацевтических композиций, питательных рецептур, нутрицевтиков, биологически активных добавок к пище, напитков и смесей для вскармливания младенцев.

В одном типичном воплощении настоящего изобретения композиция содержит источник белков, источник липидов и источник углеводов.

Например, такая композиция может иметь содержание белка в диапазоне от около 2 до 6 г/100 ккал, липидов в диапазоне от около 1,5 до 3 г/100 ккал и/или углеводов в диапазоне от около 1,7 до 12 г/100 ккал.

Если композиция является жидкостью, ее энергетическая ценность может составлять между 60 и 75 ккал/100 мл.

Если композиция является твердой, ее энергетическая ценность может составлять между 60 и 75 ккал/100 мл.

Тип белка в качестве критически важного для настоящего изобретения не рассматривается. Так, могут применяться источники белка, основанные, например, на сыворотке, казеине и их смесях. Что касается сывороточных белков, то может применяться кислая сыворотка, или сладкая сыворотка, или их смеси, а также альфа-лактальбумин и бета-лактоглобулин в любых желаемых соотношениях. Сывороточный белок может быть модифицированной сладкой сывороткой. Сладкая сыворотка - легко доступный побочный продукт изготовления сыров и часто используется в производстве смесей для детского питания, основанных на коровьем молоке. Однако сладкая сыворотка включает компонент, именуемый казеин-глико-макропептидом (CGMP), который имеет нежелательно высокое содержание треонина и недостаточное - триптофана. Удаление CGMP из сладкой сыворотки приводит к белку с более близким к женскому молоку содержанием треонина. Такая модифицированная сладкая сыворотка затем может быть дополнена теми аминокислотами, содержание которых в ней невысоко (главным образом гистидин и триптофан). Способ удаления CGMP из сладкой сыворотки описан в ЕР 880902, а основанная на этой модифицированной сладкой сыворотке смесь для питания младенцев описана в WO 01/11990. Белки могут быть интактными или гидролизованными, либо являться смесью интактных и гидролизованных белков. Может быть желательным обеспечение частично гидролизованными белками (степень гидролиза 2 - 20%), например, в случае субъектов, которые рассматриваются как подверженные риску развития аллергии к коровьему молоку. Если необходимы гидролизованные белки, процесс гидролиза может быть осуществлен так, как желательно, и известным в данной области способом. Например, гидролизат сывороточного белка может быть приготовлен ферментативным гидролизом сывороточной фракции в одну или несколько стадий, как описано в ЕР 322589. Для получения сильно гидролизованного белка сывороточные белки могут быть подвергнуты троекратному гидролизу с использованием Alcalase 2.4L (ЕС 940459), затем Neutrase 0.5L (предлагается Novo Nordisk Ferment AG) и затем панкреатином при 55°С. Обнаружено, что если используемая в качестве исходного материала сывороточная фракция является по существу не содержащей лактозы, белок претерпевает значительно меньшую степень блокирования лизина во время гидролиза. Это делает возможным снижение степени блокирования лизина от около 15 масс.% общего лизина до менее чем около 10 масс.% лизина, например, около 7 масс.% лизина, что значительно улучшает питательные качества источника белка.

Композиция настоящего изобретения может содержать источник углеводов. Могут использоваться углеводы из любых источников, такие как лактоза, сахароза, мальтодекстрин, крахмал и их смеси.

Композиция настоящего изобретения может содержать источник липидов. Источником липидов может быть любой липид. Предпочтительные источники жиров включают молочный жир, пальмовый олеин, высокоолеиновое подсолнечное масло и высокоолеиновое сафлоровое масло. Также могут добавляться незаменимые жирные кислоты: линолевая и α-линоленовая кислоты, равно как и небольшие количества масел с высоким содержанием арахидоновой кислоты и докозагексаеновой кислоты, такие как рыбий жир или масла, получаемые с помощью микробиологических технологий. Источник жиров предпочтительно имеет величину отношения содержания n-6-жирных кислот к содержанию n-3-жирных кислот от около 5:1 до около 15:1; например, от около 8:1 до около 10:1.

Композиция настоящего изобретения может также содержать в питательно существенных количествах все витамины и минеральные вещества, которые рассматриваются в качестве незаменимых в повседневном пищевом рационе. По некоторым витаминам и минеральным веществам были установлены минимальные требования. Примеры минеральных веществ, витаминов и других питательных веществ, возможно присутствующих в смеси для питания младенцев, включают витамин А, витамин В1, витамин В2, витамин В6, витамин В12, витамин Е, витамин К, витамин С, витамин D, фолиевую кислоту, инозитол, никотиновую кислоту, биотин, пантотеновую кислоту, холин, кальций, фосфор, йод, железо, магний, медь, цинк, марганец, хлор, калий, натрий, селен, хром, молибден, таурин и L-карнитин. Минеральные вещества обычно добавляются в виде солей. Наличие и количества конкретных минеральных веществ и других витаминов варьируют в зависимости от многих факторов, таких как возраст, масса и состояние здоровья человека или животного, которому назначается данная композиция.

Данные композиции могут также содержать по меньшей мере один штамм бактерий-пробиотиков. Пробиотик является препаратом клеток микроорганизмов или компонентов клеток микроорганизмов, обладающих благотворным воздействием на состояние здоровья или самочувствие организма. Подходящие бактериальные пробиотические штаммы включают Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103, предлагаемый Valio Оу (Финляндии) под торговой маркой LGG, Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724, Lactobacillus paracasei CNCM 1-2116, Lactobacillus reuteri ATCC 55730 и Lactobacillus reuteri DSM 17938, предлагаемые BioGaia AB, Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446, продаваемый в числе прочего компанией Christian Hansen (Дания) под торговой маркой Вb12, и Bifidobacterium longum BAA-999, продаваемый Morinaga Milk Industry Co. Ltd. (Япония) под торговой маркой ВВ536. Количество пробиотика, в случае его присутствия, аналогичным образом предпочтительно варьирует в зависимости от возраста человека или животного. В целом содержание пробиотика может увеличиваться с увеличением возраста младенца, например, от 10³ до 10¹² КОЕ на 1 г смеси, более предпочтительно 10⁴-10⁸ КОЕ на 1 г смеси (на сухую массу).

Композиции могут также содержать по меньшей мере один пребиотик в количестве от 0,3 до 10%. Пребиотик - это неусваиваемый компонент пищевого продукта, который благотворно воздействует на организм хозяина, выборочно стимулируя рост и/или активность одного или ограниченного количества видов бактерий в толстой кишке, тем самым улучшая состояние здоровья организма. Такие ингредиенты являются неусваиваемыми в том смысле, что они не расщепляются и не поглощаются желудком или тонкой кишкой и, таким образом, проходят неповрежденными в толстую кишку, где выборочно ферментируются полезными бактериями. Примеры пребиотиков включают некоторые олигосахариды, такие как фруктоолигосахариды (FOS) и галактоолигосахариды (GOS). Может использоваться комбинация пребиотиков, такая как 90% GOS с 10% короткоцепочечных фруктоолигосахаридов, таких как продукт, предлагаемый под торговой маркой Raftilose®, или 10% инулина, такого как продукт, представленный в продаже под торговой маркой Raftiline®.

Особенно предпочтительный пребиотик является смесью галактоолигосахарида(-ов), N-ацетилированного олигосахарида(-ов) и сиалированного олигосахарида(-ов), в котором N-ацетилированный олигосахарид(-ы) составляет от 0,5 до 4,0% смеси олигосахаридов, галактоолигосахарид(-ы) составляет от 92,0 до 98,5% смеси олигосахаридов и сиалированный олигосахарид(-ы) составляет от 1,0 до 4,0% смеси олигосахаридов. Эта смесь в дальнейшем упоминается как "CMOS-GOS". Предпочтительно предназначаемая для применения согласно изобретению композиция содержит в расчете на сухую массу от 2,5 до 15,0 масс.% CMOS-GOS при том условии, что композиция содержит по меньшей мере 0,02 масс.% N-ацетилированного олигосахарида, по меньшей мере 2,0 масс.% галактоолигосахарида и по меньшей мере 0,04 масс.% сиалированного олигосахарида.

Подходящие N-ацетилированные олигосахариды включают GalNAcα1, 3Galβ1, 4Glc и Galβ1, 6GalNAcα1, 3Galβ1, 4Glc. N-ацетилированные олигосахариды могут готовиться действием глюкозаминидазы и/или галактозаминидазы на N-ацетилглюкозу и/или N-ацетилгалактозу. Аналогичным образом с этой целью могут использоваться N-ацетилгалактозилтрансферазы и/или N-ацетилгликозилтрансферазы. N-ацетилированные олигосахариды также могут быть получены с помощью технологии ферментации при использовании соответствующих ферментов (рекомбинантных или природных) и/или микробиологической ферментацией. В последнем случае микроорганизмы могут либо выделять свои естественные ферменты и субстраты, либо могут быть подвергнуты реконструкции для выработки соответствующих субстратов и ферментов. Могут использоваться индивидуальные микробиальные культуры или смешанные культуры. Образование N-ацетилированного олигосахарида может быть инициировано акцепторными субстратами с любой степенью полимеризации (DP), начиная от DP=1 и далее. Другой возможностью является химическое преобразование кетогексоз (например, фруктозы) в свободной или связанной с олигосахаридом (например, лактулоза) форме в N-ацетилгексозамин или в N-ацетилгексозамин, содержащий олигосахарид, как описано в Wrodnigg, T.M.; Stutz, A.E. (1999) Angew. Chem. Int. Ed. 38:827-828.

Подходящие галактоолигосахариды включают Ga1β1, 6Ga1, Ga1β1, 6Ga1β1, 4G1c Ga1β1, 6Ga1β1, 6G1c, Ga1β1, 3Ga1β1, 3G1c, Ga1β1, 3Ga1β1, 4G1c, Ga1β1, 6Ga1β1, 6Ga1β1, 4G1c, Ga1β1, 6Ga1β1, 3Ga1β1, 4G1c Ga1β1, 3Ga1β1, 6Ga1β1,4G1c, Ga1β1, 3Ga1β1, 3Ga1β1, 4G1c, Ga1β1, 4Ga1β1, 4G1c и Ga1β1, 4Ga1β1, 4Ga1β1, 4G1c. Синтезированные галактоолигосахариды, такие как Ga1β1, 6Ga1β1, 4G1c, Ga1β1, 6Ga1β1, 6G1c, Ga1β1, 3Ga1β1, 4G1c, Ga1β1, 6Ga1β1, 6Ga1β1, 4G1c, Ga1β1, 6Ga1β1, 3Ga1β1, 4G1c и Ga1β1, 3Ga1β1, 6Ga1β1, 4G1c, Ga1β1, 4Ga1β1, 4G1c и Ga1β1, 4Ga1β1, 4Ga1β1, 4G1c и их смеси, имеются в продаже под торговыми марками Vivinal® и Elix'or®. Другими поставщиками олигосахаридов являются Dextra Laboratories, Sigma-Aldrich и Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. В качестве варианта для получения нейтральных олигосахаридов могут использоваться некоторые гликозилтрансферазы, такие как галактозилтрансферазы.

Подходящие сиалированные олигосахариды включают NeuAcα2, 3Ga1β1, 4G1c и NeuAcα2, 6Ga1β1,4G1c. Эти сиалированные олигосахариды могут быть выделены хроматографическим способом или с помощью фильтрационной технологии из естественных источников, таких как молоко животных. В качестве варианта они могут быть также получены биотехнологическим способом, используя определенные сиалилтрансферазы, либо с помощью технологии ферментации при использовании соответствующих ферментов (рекомбинантных или природных), либо технологией микробиологической ферментации. В последнем случае микроорганизмы могут либо экспрессировать свои естественные ферменты и субстраты, либо могут быть подвергнуты реконструкции для выработки соответствующих субстратов и ферментов. Могут использоваться индивидуальные микробиальные культуры или смешанные культуры. Образование сиалилолигосахарида может быть инициировано акцепторными субстратами с любой степенью полимеризации (DP), начиная от DP=1 и выше.

Композиции могут содержать и другие способные оказывать благоприятное воздействие вещества, такие как нуклеотиды, нуклеозиды и т.п.

Применяемые в данном изобретении композиции, например смесь для питания младенцев, могут быть приготовлены любым подходящим способом. Например, смесь для питания младенцев может быть приготовлена смешиванием в подходящих соотношениях источника бежа, источника углеводов и источника липидов. В случае их применения, в смесь могут быть включены эмульгаторы. На данном этапе могут также добавляться витамины и минеральные вещества, но обычно они прибавляются позднее во избежание теплового разложения. Любые липофильные витамины, эмульгаторы и другие подобные могут быть перед смешиванием растворены в источнике жиров. Затем для получения жидкой смеси может примешиваться вода, предпочтительно вода, подвергнутая обработке обратным осмосом. Жидкая смесь может быть затем подвергнута термической обработке для снижения бактериальной нагрузки. Например, жидкая смесь может быть быстро нагрета до температуры в диапазоне от около 80°С до около 110°С в течение от около 5 секунд до около 5 минут. Это может быть осуществлено нагнетанием пара или с помощью теплообменника, например пластинчатого теплообменника. Затем жидкая смесь может быть охлаждена до температуры от около 60°С до около 85°С, например, мгновенным охлаждением. После чего жидкая смесь может быть гомогенизирована, например, в два этапа: при давлении от около 7 МПа до около 40 МПа на первом этапе и от около 2 МПа до около 14 МПа на втором этапе. Далее гомогенизированная смесь может быть дополнительно охлаждена для добавления каких-либо чувствительных к нагреванию компонентов, таких как витамины и минеральные вещества. На данном этапе удобно стандартизуются величина рН и содержание сухих веществ в гомогенизированной смеси. Гомогенизированная смесь поступает в подходящее сушильное устройство, такое как распылительная сушилка или установка для сублимационной сушки, и преобразуется в пороIUGR. ПороIUGR должен иметь влажность менее чем около 5 масс.%. Если желательно добавление пробиотика(-ов), они могут быть выращены в соответствии с любым подходящим способом и подготовлены к добавлению к смеси для питания младенцев, например, сублимационной сушкой или распылительной сушкой. В качестве варианта, бактериальные препараты могут быть закуплены у специализированных поставщиков, таких как Christian Hansen и Morinaga, в подходящем, уже подготовленном для добавления к пищевым продуктам, таким как смеси для питания младенцев, виде. Такие бактериальные препараты могут быть добавлены к порошкообразной смеси для питания младенцев посредством сухого смешивания.

В ходе реализации этой методики лактоферрин может добавляться на любой стадии, но предпочтительно его добавление после этапа нагревания.

Композиция содержит источник белка, который может присутствовать в количествах, находящихся в диапазоне между 1,4 и 100 г/100 ккал, предпочтительно между 1,4 и 6,0 г/100 ккал композиции. Поскольку лактоферрин является белком, его следует рассматривать как часть источника белка.

Известно, что определенную пользу здоровью обеспечивает сывороточный белок. Например, он является легко усвояемым. Белковая фракция в сыворотке (приблизительно 10% общего содержания сухих твердых веществ в сыворотке) содержит несколько белковых фракций, например бета-лактогаобулин, альфа-лактальбумин, бычий сывороточный альбумин и иммуноглобулины. В одном воплощении по меньшей мере 50 масс.%, предпочтительно по меньшей мере 75 масс.%, еще более предпочтительно по меньшей мере 85 масс.% источника белка является сывороточным белком.

В случае его присутствия, вклад источника липида в общее энергосодержание композиции может составлять 30-55%. Источник углеводов может вносить 35-65% общего энергосодержания композиции.

Также к композиции настоящего изобретения может быть добавлена сиаловая кислота. Сиаловая кислота является обобщенным наименованием для N- или O-замещенных производных нейраминовой кислоты, моносахарида с главной цепью, содержащей девять атомов углерода.

Для целей настоящего изобретения может применяться любая разновидность сиаловой кислоты. Однако предпочтительно, если сиаловая кислота имеет следующую химическую формулу

R1=Н, ацетил, лактил, метил, сульфат, фосфат, ангидросиаловая кислота, фукоза, глюкоза или галактоза

R2=N-ацетил, N-гликозил, амино, гидроксил, N-гликозил-О-ацетил или N-гликозил-O-метил

R3=Н, галактоза, N-ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин, сиаловая кислота, N-гликолилнейраминовая кислота.

R1 может быть выбран из группы, состоящей из Н, ацетила, лактила, метила, сульфата, фосфата, ангидросиаловой кислоты, фукозы, глюкозы и/или галактозы.

R2 может быть выбран из группы, состоящей из N-ацетила, N-гликозила, амино, гидроксила, N-гликозил-О-ацетила или/или N-гликозил-О-метила.

R3 может быть выбран из группы, состоящей из Н, галактозы, N-ацетилглюкозамина, N-ацетилгалактозамина, сиаловой кислоты и/или N-гликолилнейраминовой кислоты.

Группы в положении R1 могут быть одинаковыми или могут отличаться друг от друга.

Например, сиаловая кислота может быть N-ацетилнейраминовой кислотой с R1=Н, R2=N-ацетил и R3=Н. Согласно следующему воплощению настоящего изобретения, сиаловая кислота может быть выбрана из группы, состоящей из 2-кето-5-ацетамидо-3,5-дидеокси-d-глицеро-d-галактононулозоновой кислоты (Neu5Ac) и N-гликолилнейраминовой кислоты или их смесей.

Сиаловая кислота, которая применяется в настоящем изобретении, содержит N-ацетилнейраминовую кислоту, которая имеет следующие синонимы и аббревиатуры: о-сиаловая кислота; 5-ацетамидо-3,5-дидеокси-D-глицеро-D-галакто-2-нонулозоновая кислота; 5-ацетамидо-3,5-дидеокси-D-глицеро-D-галактононулозоновая кислота; аценейраминовая кислота; N-ацетилнейраминат; N-ацетилнейраминовая кислота; NANA и Neu5Ac.

Настоящее изобретение распространяется на применение лактоферрина для получения композиции, предназначенной для лечения или профилактики замедленного мозгового развития и/или замедленного развития нервной системы.

Для применений настоящего изобретения существенно, чтобы композиция содержала лактоферрин или соединение, которое приводит к лактоферрину после его употребления. Композиция не обязательно должна быть обогащенной лактоферрином, хотя это может быть предпочтительным, поскольку таким образом большее количество лактоферрина может быть введено в более малых объемах.

Лактоферрин может использоваться для приготовления композиций любого вида. Однако предпочтительно, чтобы лактоферрин обеспечивался в виде композиция в соответствии с приведенным выше описанием.

В одном воплощении настоящего изобретения содержащая лактоферрин композиция может использоваться для лечения или профилактики задержек развития зрения.

В другом воплощении настоящего изобретения содержащая лактоферрин композиция может использоваться для лечения или профилактики задержек миграции нейронов.

В следующем воплощении настоящего изобретения содержащая лактоферрин композиция может использоваться для лечения или профилактики задержек развития когнитивной функции.

Композиция настоящего изобретения может использоваться для увеличения плотности нейронов и/или выживаемости нейронов.

Композиции настоящего изобретения могут дополнительно применяться при лечении или профилактике сниженной способности к обучению, ослабленной умственной деятельности или сниженной продолжительности концентрации внимания.

Для достижения этого композиция может вводиться матерям во время беременности, матерям во время кормления грудью, недоношенным или рожденным в срок младенцам, младенцам с низкой/очень низкой массой тела при рождении, младенцам IUGR, младенцам, детям ясельного возраста, детям и/или подросткам.

Притом, что композиции настоящего изобретения могут использоваться в целом для лечения или профилактики мозговых нарушений и/или для восстановления последствий церебральные нарушений у младенцев любых возрастных групп, было обнаружено, что композиции настоящего изобретения являются особенно полезными для лечения или профилактики мозговых нарушений и/или для восстановления последствий церебральные нарушений у младенцев IUGR.

Специалистам в данной области ясно, что они могут свободно объединять все описанные здесь признаки настоящего изобретения без отступления от его раскрываемого здесь объема. В частности, признаки, описанные для применения настоящего изобретения, могут быть применены к композиции настоящего изобретения и наоборот.

Дальнейшие признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующих далее Фигур и Примеров.

Фигура 1 показывает процент позитивных NS20Y клеток при росте аксонов в базальных условиях (не подвергавшиеся обработке клетки) и после обработки клеток либо нейротрофическим фактором CNTF (100 нг/мл, позитивный контроль), либо обогащенной лактоферрином фракцией коровьего молока при различных концентрациях. Данные представлены в виде среднего ±SEM (стандартная погрешность среднего) при n=от 3 до 7 в зависимости от группы (базальная n=7; CNTF n=3; 1 мкг/л n=3; 10 мкг/л n=7; 100 мкг/л n=3; 1 мг/л n=3; 10 мг/л n=5; 100 мг/л n=7; 1 г/л n=6). Данные сравнивались с показателями базальной необработанной группы с использованием критерия Стьюдента t. Различия считалась значимыми при Р<0,05.

Фигура 2 показывает высвобождение нейрон-специфической енолазы (NSE), маркера гибели нейрональных клеток, первичной культурой энтерических нейронов после провокации Н₂O₂ и профилактики с лактоферрином коровьего молока. Данные представлены в виде средней величины ±SEM при n=8. Различия считалась значимыми при Р<0,05.

Фигура 3 показывает процентную долю 7-AAD позитивных клеток в культуре клеток SH-SY5Y после провокации Н₂О₂ в условиях отсутствия или наличия в различных концентрациях лактоферрина коровьего молока в диапазоне от 0,001 до 1 г/л.

Фигура 4 представляет показатель отношения массы мозга к массе тела на момент Р1 (день 1 постанатального периода) у нормальных и младенцев IUGR. Было найдено, что соотношение масс мозга и тела после введения во время беременности лактоферрина увеличивается как у нормальных младенцев, так и в еще большей степени у младенцев IUGR.

Фигура 4b представляет показатель отношения массы мозга к массе тела у нормальных и младенцев IUGR в Р7 (день 7 постанатального периода). Было найдено, что соотношение масс мозга и тела после введения лактоферрина увеличивается как у нормальных младенцев, так и в еще большей степени у младенцев IUGR.

Фигура 5 показывает наличие в гиппокампе нормальных младенцев, младенцев IUGR и младенцев IUGR, подвергнутых лечению лактоферрином при Р7, нескольких метаболических маркеров, индикативных для развития и активности мозга. Гиппокампальная активность связана со способностями к обучению и кратковременной памятью.

Фигура 6 показывает наличие на момент Р7 в коре головного мозга нормальных младенцев, младенцев IUGR и младенцев IUGR, подвергнутых лечению лактоферрином, нескольких метаболических маркеров, индикативных для развития и активности мозга. Активность коры головного мозга связана с долговременной памятью.

Фигура 7 представляет морфологию ядер в области СА2-СА3 гиппокампа после окрашивания DAPI.

Фигура 8 демонстрирует, что диетические добавки лактоферрина значительно увеличили экспрессию генов нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) на 7 день постнатального периода.

Фигура 9 показывает результаты теста на свободную адаптацию крыс в возрасте 4,5 месяцев, n=10 для контрольной группы, получавшей носитель, и группы bLf-носитель, n=7 для группы контроль-DEX, n=14 для группы bLf-DEX, один параметр - визиты.

Примеры

Биологическая активность обогащенной лактоферрином фракции коровьего молока оказывает воздействие на стимуляцию выживания нейрональных клеток и рост аксонов in vitro.

Процесс роста аксонов содержит отрастание аксонов от нейронов и является частью нейронального развития. Влияние фракций коровьего молока, обогащенных лактоферрином, на рост аксонов было изучено с помощью общепринятого и широко используемого метода определения биологической активности in vitro.

Вкратце, мышиные NS20Y нейробластомные клетки (DSMZ) были разморожены из криогенного хранения, высеяны с плотностью приблизительно 27×10³ клеток на см² в культуральных флаконах с обработанной поверхностью (Falcon) и размножены в присутствии DMEM (Gibco), содержащего 10% FCS (Gibco) и 2 ммоль L-глютамина (Gibco). Через два дня после засева клетки были отделены от флакона механическим перемешиванием (обстукиванием флакона) и пропусканием суспензии несколько раз через оплавленную стеклянную пипетку была получена моноклональная культура. Затем клетки были высеяны на 13 мм круглых стеклянных покровных стеклах в присутствии DMEM, содержащего 10% FCS и 2 ммоль L-глютамин, с плотностью 2000 клеток на одно покровное стекло. На следующий день питательная среда была заменена на DMEM, содержащий 0,5% FCS, 2 ммоль L-глютамина и предназначенные для испытания молочные фракции в различных концентрациях. Один день спустя клетки фиксировались 4% параформальдегидом и готовились препараты для микроскопических исследований.

Со всех покровных стекол были получены изображения с помощью микроскопа Axioplan 2 (Zeiss). Были получены цифровые изображения 25 ограниченных областей по диаметру покровного стекла (объектив 20Х, Axiocam MRc, Zeiss). Клетки подсчитывались систематически от первой области на краю покровного стекла и через все покровное стекло до тех пор, пока не насчитывалось 100 клеток. Клетки атрибутировались как позитивные или негативные в отношении роста аксонов. Клетки считались позитивными в отношении роста аксонов, если исходящие из тела клетки аксоноподобные выросты достигали длины, превышающей размеры клетки.

Для сравнения различий между средними значениями в одной контрольной совокупности и средними значениями по всем другим испытаниям в каждой группе использовался критерий Стьюдента.

Исследованию были подвергнуты обогащенные фракции коровьего молока со следующими концентрациями лактоферрина: 1 мкг/л, 10 мкг/л, 100 мкг/л, 1 мг/л, 10 мг/л, 100 мг/л и 1 г/л. Был выполнен положительный контроль (CNTF, цилиарный нейротрофический фактор, 100 нг/мл), который является хорошо известным нейротрофическим фактором, о способности которого стимулировать рост аксонов различных нейронных групп сообщалось ранее (Oyesiku and Wigston, 1996 (Oyesiku NM, Wigston DJ: Ciliary neurotrophic factor stimulates neunte outgrowth from spinal cord neurons. J Comp Neurol 1996; 364: 68-77). Базальный контроль состоял из необработанных клеток. Результаты представлены на Фигуре 1.

Защита нейрональных клеток от стресса

Первичные культуры энтерических нейрональных клеток были высеяны в лунки и инкубировались в течение 48 час с различными концентрациями обогащенных бычьим лактоферрином фракций. После трехкратной промывки фосфатно-солевым буфером (стерильный PBS, 37°С) клетки в течение 12 часов инкубировались в клеточной питательной среде без лактоферрина, содержащей Н₂О₂ или носитель (контроль). Защитное действие лактоферрина против индуцированной воздействием Н₂О₂ гибели нейрональных клеток оценивалось по результатам измерений высвобождения в питательную клеточную среду нейрон-специфической енолазы (NSE). После оксидантного стресса отбиралась питательная среда из различных групп и центрифугировалась в течение 10 мин на 12000 об/мин (4°С). Отбирался супернатант и с помощью радиоиммунного анализа определялись количества выделившейся в культуральную среду NSE. Результаты представлены в виде нг/мл. Как видно из Фигуры 2, Н₂О₂ вызывал значимое увеличение содержания NSE в среде (р<0,05, n=8). Обработка первичных клеток энтерических нейронов обогащенной лактоферрином фракцией значительно препятствовала индуцированному Н₂О₂ высвобождению NSE (р<0,05, n=8).

Нейропротекторные свойства бычьего лактоферрина были подтверждены с помощью линии нейроподобных клеток человека (нейробластомные клетки SH-SY5Y). Вкратце, высеянные клетки SH-SY5Y инкубировались в течение 24 час и к питательной клеточной среде на следующие 48 час добавлялась фракция, обогащенная бычьим лактоферрином с различными концентрациями. Клетки в течение 6 час подвергались воздействию Н202. В завершение перед снятием трипсином-ЭДТА клетки были промыты 0,1М PBS. Суспензия клеток затем объединялась с супернатантом и центрифугировалась в течение 5 мин на 2000 об/мин. Осадок после центрифугирования ресуспендировался в 500 микролитрах 0,1М PBS. Цитометрией в потоке с использованием в качестве флуоресцентного маркера 7-AAD (7-аминоактиномицин) была оценена мембранная проницаемость. Для этого перед выполнением обнаружений с помощью биоанализатора BD FACS Array^TM 200 микролитров суспензии клеток в течение 10 мин выдерживались в 7-AAD. Этот проточно-цитометрический анализ с применением 7-аминоактиномицина D (7-AAD) позволил различить живые (7-ААВ-негативные) и находящиеся на поздних стадиях апоптоза/некротические (7-ААD-позитивные) в ответ на оксидантный стресс клетки SH-SY5Y. Представленные на Фигуре 3 результаты были выражены в виде процентной доли 7-ААD-позитивных клеток от общего количества клеток. Как видно из Фигуры 3, H₂O₂ вызывал значимое увеличение процентной доли 7-ААD-позитивных клеток (р<0,05, n=6). Обработка SH-SY5Y клеток лактоферрином препятствовала индуцированному Н₂O₂ увеличению процентной доли 7-ААD-позитивных клеток.

Лактоферрин улучшает показатель отношения массы мозга к массе тела у нормальных и младенцев IUGR.

Исследования на животных: крысы линии Wister

Самки были подвергнуты обработке дексаметазоном (DEX) во время третьей недели беременности. Этот кортикостероид подавался в ходе 3-й недели беременности с помощью осмотического насоса Alzet®, внедренного подкожно; в качестве контроля использовались ложнооперированные животные с осмотическим насосом, содержащим солевой буфер. План исследования представляет модель высокой индивидуальной уязвимости детенышей, имитирующую ситуацию уязвимости во время перинатального периода у человека, которая является качественной моделью для доказательства способности лактоферрина улучшать развитие мозга, исключая какие-либо другие вмешательства. Предусматривалась проверка воздействия добавок лактоферрина 1) во время как беременности, так и грудного вскармливания, 2) во время грудного вскармливания и 3) безо всяких добавок. Для установления логичного экспериментального плана, делающего возможным выполнение адекватных сравнений, такой же протокол внесения добавок был применен и для случаев нормальных беременностей.

Детеныши IUGR: модель задержки внутриутробного развития (IUGR) была обеспечена обработкой самок дексаметазоном (100 мкг/кг/день) во время третьей недели беременности. В качестве предлагаемой вынашивающим самкам питательной добавки предусматривалось пероральное введение лактоферрина с 15-го дня беременности и до момента прекращения грудного вскармливания, при этом корм давался ad libitum (неограниченно). Лактоферрин подавался новорожденным крысам с постнатального дня 1 и до момента прекращения грудного вскармливания.

Использовались следующие 6 групп животных:

Группа 1: нормальные детеныши; никаких пищевых воздействий на контрольных самок (симуляция=осмотический насос с солевым буфером).

Группа 2: детеныши IUGR; никакого пищевого воздействия на самок, подвергнутых обработке DEX.

Группа 3: нормальные детеныши; добавки bLf (1 г/кг/день) контрольным самкам (симуляция) с начала беременности до конца грудного вскармливания.

Группа 4: детеныши IUGR; добавки bLf (1 г/кг/день) подвергнутым обработке DEX самкам с начала беременности до конца грудного вскармливания.

Группа 5: детеныши IUGR; никакого пищевого воздействия на подвергнутых обработке DEX самок; капельное питание (200 мг/кг/день) детенышей носителем (такие же объемы, как и bLf) - смесью аминокислот, имитирующих белок казеина, в дополнение к грудному вскармливанию с 1 до 21 постнатальные дни.

Группа 6: детеныши IUGR; никакого пищевого воздействия на подвергнутых обработке DEX самок; капельное питание (200 мг/кг/день) детенышей добавками bLf в дополнение к грудному вскармливанию с 1 по 21 постнатальный день.

Были получены следующие результаты, проиллюстрированные на Фигурах 4а и 4b.

Масса тела при рождении потомства от самок из контрольной группы с DEX и из группы DEX с добавками лактоферрина была на около 20-25% меньше, чем из контрольной группы с носителем. Это показывает, что модель DEX является достоверным инструментом для имитации ситуации уязвимости во время перинатального периода у человека.

Таким образом, эта модель является качественной моделью для демонстрации способности лактоферрина усиливать мозговое развитие, исключая любые другие вмешательства.

Масса мозга как в контрольной группе DEX, так и в группе DEX с добавками лактоферрина была меньше, чем в контрольной группе с носителем. Однако уменьшение массы мозга было более мало, чем уменьшение массы тела в группах с добавками Lf, таким образом в постнатальный день 1 соотношение массы мозга и массы тела в Dex-группе с LF-обработкой по сравнению с контрольной Dex-группой было выше.

Примечательно, что к постнатальному дню 21 Dex-Lf-группа догнала по массе мозга контрольную группу с носителем.

Лактоферрин усиливает метаболизм в мозге.

С помощью LC-моделирования в коре головного мозга и в гиппокампе количественно определялись следующие 18 метаболитов: аланин (Аlа), аспартат (Asp), креатин (Сr), аминомасляная кислота (GABA), глюкоза (Glc), глутамат (Glu), глютамин (Gin), глютатион (GSH), глицерофосфорилхолин (GPC), фосфорилхолин (PCho), мио-инозитол (Ins), лактат (Lac), N-ацетиласпартат (NAA), N-ацетиласпартилглутамат (NAAG), фосфокреатин (PCr), фосфорилэтаноламин (РЕ), сцилло-инозитол и таурин (Таu).

Оно было направлено на визуализацию изменений мозгового развития после неблагоприятных пренатальных воздействий с применением in vivo МР-методик (использовался Tesia scanner 9.4 в EPFL - Федеральной политехнической школе Лозанны) и на оценку эффекта пищевых вмешательств в раннем возрасте на мозговое развитие и метаболизм главным образом во время первого месяца жизни в модели на грызунах. Для изучения местного церебрального и метаболизма гиппокампа использовались изображения, полученные методом быстрого скан-эха (FSE), и спектры -МР-спектроскопии. Вкратце, для позиционирования объема интереса MRS (размер векселя VOI - 1,5×1,5×2,5 мм³) были получены изображения FSE (TR/TE=6000/80 мс; FOV=25×25 мм и размерность матрицы=256×128). Магнитные шиммы первого и второго порядка регулировались с помощью FASTMAP [Martin E, 2001, Ann Neurol 49:518-521]. Ширина линий воды находилась в диапазоне 8-15 Гц. Снятие спектров, относящихся как к поражениям в коре, так и в контралатеральной корковой области было выполнено с использованием ультракороткого эхо-времени (TE/TR=2,7/4000 мс) с применением метода спектроскопии SPECIAL. Этот метод объединяет ID метод прижизненной спектроскопии по селективному изображению (ISIS) в вертикальном (Y) направлении со срезо-селективным спин-эхом в Х и Z направлениях и обеспечивает полную интенсивность сигнала в возбужденной области. Были сняты от 35 до 70 серий FID (спад свободной индукции) (по 12 средних величин в каждой), индивидуально скорректированы по уходу частоты, просуммированы вместе и скорректированы с учетом остаточных вихревых токов с использованием эталонного сигнала воды.

Были получены следующие результаты, проиллюстрированные на Фигурах 5 и 6. Через 7 дней после рождения имеются значимые (Р<0,05 ~0,01) различия в концентрациях фосфокреатина (PCr); N-ацетиласпартилглутамата (NAAG), N-ацетиласпартата (NAA), NAA+NAAG и креатина (Сr)+фосфокреатина (PCr) у детенышей из контрольной группы с носителем (n=5) и детенышей из контрольной Dex-группы (n=4). При этом в Dex-группе детенышей, подвергшейся терапии LF (n=6), проявилась тенденция к полному изменению на день Р7 концентраций вышеуказанных метаболических маркеров, найденных в контрольной Dex-группе, однако эти различия не достигли статистической значимости ни в гиппокампе, ни в коре головного мозга.

N-ацетиласпартат (NAA), или N-ацетиласпарагиновая кислота, является производным аспарагиновой кислоты с формулой С₆Н₉O₅ и молекулярной массой 175,139.

NAA - вторая по уровню своей концентрации в мозге молекула после глутаминовой аминокислоты. NAA синтезируется в нейронах из аспарагиновой аминокислоты и ацетилкоэнзима А. Главные исполняемые ею функции включают:

- она является источником ацетата для синтеза липидов и миелина в олигодендороцитах, глиальных клетках, которые миелинизируют нейронные аксоны;

- она является предшественником для синтеза важного нейронального дипептида N-ацетиласпартилглутамата;

- она является нейрональным осмолитом, вовлеченным в жидкостный баланс мозга;

- NAA может также включаться в выработку энергии из глутаминовой аминокислоты в митохондриях нейронов.

Сигнал NAA отражает концентрации в тканях как NAA, так и N-ацетиласпартилглутамата (NAAG). Как сообщается, NAA отражает присутствие в ЦНС нейронов, клеток олигодендроглиального происхождения и аксонов (Urenjak J, 1993, J Neurosci 13:981-989; Martin E, 2001, Ann Neurol 49:518-521; Bjartmar C, 2002, Ann Neurol 51:51-58). Было выдвинуто предположение, что NAA(G) может быть переносчиком ацетильной группы между митохондриями и цитоплазмой в нейрональных клетках (Patel ТВ, 1979, Biochem J 184:539-546; Trockenmuler ME, 1985, J Neurochem 45:1658-1662). Снижение уровня сигнала NAA обычно интерпретируется как уменьшение количества нейронов, но может также отражать изменения функций нейронных митохондрий. Ранее было описано подробно и подтверждено в настоящем исследовании увеличение соотношения NAA/Cho в мозговой ткани в ходе взросления (van der Knaap MS, 1990, Radiology 176:509-515;Kreis R, 2002, Magn Reson Med 48:949-958).

N-ацетиласпартилглутаминовая кислота (N-ацетиласпартилглутаминат или NAAG) представляет собой нейропептид, который является третьим среди самых распространенных нейромедиаторов в нервной системе млекопитающих. NAAG состоит из N-ацетиласпарагиновой кислоты (NAA) и глютаминовой кислоты, связанных через пептидную связь. NAAG была обнаружена как специфический для нервной системы пептид в 1965 г. Curatolo и коллегами (Isaacks RE, 1994, Neurochem Res 19:331-338), но не подвергалась подробному изучению на протяжении почти 20 лет. Она отвечает критериям нейромедиатора, включая нахождение в концентрированном виде в нейронах, в упакованном в синаптических пузырьках состоянии, высвобождение кальцийзависимым образом и гидролиз в синаптическом пространстве под действием ферментативной активности. NAAG активизирует особый рецептор, метаботропный глутаматный рецептор типа 3. Она синтезируется ферментативным способом из двух предшественников и катаболизируется пептидазами NAAG в синапсе. Ингибирование последних ферментов показало в моделях на животных наличие потенциально важных терапевтических эффектов в отношении нескольких неврологических состояний и нарушений.

Мио-инозитол является критически существенной составной частью живых клеток и участвует в реализации нескольких физиологических функций. Он является основным осмолитом и также служит в качестве предшественника фосфатидилинозитола. Мио-инозитол применялся в качестве маркера глиальных клеток (Isaacks RE, 1994, Neurochem Res 19:331-338). Lac может использоваться в качестве топлива для мозга, а также для синтеза миелина (Sanchez-Abarca LI, 2001, Glia 36:321-329).

Уменьшение отношения N-ацетиласпартат/холин (NAA/Cho) у доношенных новорожденных с асфиксией прогнозирует неблагоприятные результаты нервно-психического развития (Groenendaal F, 1994, Pediatr Res 35:148-151; Peden CJ, 1993, Dev Med Child Neurol 35:502-510; Roelants-van Rijn AM, 2001, Pediatr Res 49:356-362). Мио-инозитол (mI), который является одним из осморегуляторов мозга, может быть найден в астроцитах и рассматривается в качестве маркера глиальных клеток (Isaacks RE, 1994, Neurochem Res 19:331-338).

Лактоферрин улучшает плотность нейронов и выживаемость нейронов и способен восстанавливать и/или излечивать повреждения нейрональных клеток.

Вслед за МР-исследованиями проводилась морфологическая экспертиза. Были собраны соседние срезы на уровне стриатума, дорсальной и латеральной частей гиппокампа для оценки корковой и гиппокампальной архитектуры и повреждений белого вещества. Клетки определенных типов были подвергнуты мечению с помощью иммуногистохимии для определения специфических клеточных реакций. Было выполнено специфическое маркирование нейронов (NeuN), астроцитов (GFAP) и радиальной глии (Nestin) в сочетании с маркерами миелинизации белого вещества (МВР). Вкратце, была использована следующая методика.

На день Р7 и Р21, соответственно, детеныши из каждой группы были глубоко анестезированы с помощью кеталара (50 мг/мл; 0,2-0,5 мл интраперитонеально). Животные были интракардиально перфузированы 0,9% NaCl, а затем 4% параформальдегидом. Мозг извлекался, взвешивался и постфиксировался в 4% параформальдегиде в течение ночи, а затем не менее 24 час в 30% растворе сахарозы с последующим хранением до иссечения при -80°С. В криостате (Microm, Cryo-Star HM 560М, Microm International, Германия) были приготовлены коронарные срезы (10 мкм) на уровне дорсального гиппокампа. От каждого животного было получено по три среза через 200 мкм интервалы.

Иммуногистохимия

Мозговая ткань была обработана с помощью авидин-биотин-пероксидазного комплекса (АВС; Vector Laboratories, Burlingame, Калифорния, США) для обеспечения иммунореактивности к МВР (1:400). Срезы были блокированы в 4% бычьем сывороточном альбумине (BSA), затем инкубированы в течение 24 час при 4°С с первичным антителом, после чего они инкубировались со вторичным антителом (1:200), а затем с авидин-биотиновым комплексом (1:200, Vector Laboratories, Burlingame, CA, США). Срезы были обработаны хромогеном 3,3-диаминобензидином (DAB) в 0,01% пероксиде водорода и затем препараты были заключены под покровные стекла.

Аналогичный протокол использовался для флуореспентной иммуногистохимии с нестином (1:500), GFAP (1:400) и NeuN (1:200), за исключением того, что срезы не выдерживались в авидин-биотиновом комплексе и DAB.

Окрашивания препаратов, полученных во всех экспериментальных группах и в их соответствующих контрольных группах, выполнялись одновременно. В случаях, когда обработка первичными антителами не предпринималась, окрашивания не происходило.

Были выполнены количественные анализы с использованием системы обработки изображений MetaMorph® Imaging System (Meta Imaging Software, Molecular Devices Corporation, Пенсильвания, США). Показатели по каждому животному были объединены и для каждой группы вычислены средние значения±SEM. Измерения выполнялись на закодированных слайдах, кодировка которых была закрыта для наблюдателя до получения результатов анализов.

Были получены следующие результаты, проиллюстрированные на Фигуре 7.

Гистологический анализ показал, что на день Р7 добавки LF в Dex-группе детенышей (n=5) имеют значимое воздействие на морфологию ядер и увеличение плотности нейронов в области СА2-СА3 гиппокампа по сравнению с контрольной Dex-группой. Снижение показателя плотности нейронов в коре головного мозга на день Р7 предполагает утрату нейронов. Такая плотность нейронов подобна представленной в нормальной контрольной группе с носителем (Фигура 7). Лактоферрин, вводимый в течение этого особого в отношении развития временного интервала, будет влиять на плотность нейронов в гишюкампе и области большой уязвимости по отношению к недостаточности питания и связанным со стрессом мозговым расстройствам. Это подразумевает, что введение LF увеличивает выживаемость нейронов и защиту нейронов, например, у молодых крыс IUGR.

Добавки лактоферрина усиливают экспрессию генов нейротрофического фактора головного мозга (BDNF).

Фигура 8 демонстрирует, что диетические добавки лактоферрина значительно увеличили экспрессию генов нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) на 7 день постнатального периода.

BDNF является нейротрофическим фактором, который стимулирует нейрональную дифференциацию, выживаемость и пластичность в периферийной нервной системе и центральной нервной системе (ЦНС). Он является ключевой молекулой, вовлеченной во многие нейрональные аспекты развивающихся и зрелых нейронов. В ЦНС BDNF приводит к установлению долговременной потенциации, которая соотносится с синаптической пластичностью. BDNF стимулирует нейрогенез. В частности, BDNF стимулирует рост аксонов и усиливает экспрессию синаптических белков, необходимых для установления синаптических связей или функций в процессе развития. Таким образом, диетический лактоферрин играет роль как в нейрональном развитии, так и в обеспечении нейропротективного действия.

Экспрессия генов является процессом, с помощью которого кодируемая геном информация преобразуется в белок. Данное исследование является первым, анализирующим действие добавок лактоферрина на геномный анализ уровней BDNF в мозге с использованием хорошо разработанного метода.

Вкратце, из гиппокампа была извлечена общая РНК с помощью RNeasy Mini Kit® согласно протоколу изготовителя (Qiagen, Базель, Швейцария). 2,5 мкг общей рНК было подвергнуто обратной транскрипции с помощью 800 единиц обратной транскриптазы вируса лейкоза мышей Moloney (Invitrogen, Базель, Швейцария) в присутствии 0,3 единиц/мкл RNAsin (Promega Corp, Madison, WI), 7,5 мкмоль случайных праймеров (oligo(dN)6), 1,2 ммоль dNTP и 12 мкмоль DTT. Экспрессия кДНК для крысиного BDNF определялась количественной ПНР в реальном времени на установке ABI StepOne Plus Detection System (Applera Europe, Rotkreuz, Швейцария) и нормализовалась с помощью обязательного рибосомного гена 36 В4. Продукты ПЦР были количественно определены с помощью комплекта SYBR Green Core Reagent kit (Applera Europe, Rotkreuz, Швейцария) и результаты выражены в условных единицах (A.U.) относительно величин в контрольной группе. Праймеры были разработаны, используя программное обеспечение Primer Express software (Applera Europe, Rotkreuz, Швейцария).

Поведенческие характеристики животных

Для оценки влияния лактоферрина коровьего молока (bLF) на поведение животных OLF добавлялся крысам-матерям на протяжении всего периода беременности и лактации (всего 6 недель) в уровнях дозы 1 г/кг/день в 4 различных группах: (1) контроль-носитель (СЕ); (2) контроль-DEX (CD); (3) лактоферрин-носитель (LE) и (4) лактоферрин-Dex (LD) в возрасте 4,5 месяцев с применением системы Intellicage.

Тест на свободную адаптацию (соответствующий тесту «открытого поля») заключался в помещении крыс в hitellicage, новую среду обитания, на 3 дня с тем, чтобы контролировать перемещение крысы и взаимодействие со средой (количество посещений различных углов). Отслеживалось исследовательское поведение/любопытство для анализа того, как крысы приспособились к новой среде.

Результаты показали, что крысы из контрольной DEX-группы имели в Intellicage сниженную исследовательскую активность/любопытство по сравнению с контрольной группой носителя (нормальный контроль), группой bLF-носитель и крысами из bLF-DEX группы на протяжении всех 3 дней испытания. Различия между Dex-контрольной группой и обеими группами контроль-носитель и bLf-Dex на день 3 теста на свободную адаптацию были значимыми (Р<0,05). Эти результаты дают основание предполагать, что пренатальные добавки LF усиливали подобное тревожному поведение, включая большую исследовательскую активность, любопытство и взаимодействие с новой средой, у взрослых животных в возрасте 4,5 месяцев - здоровых, а также перенесших в раннем возрасте повреждение мозга (Фиг.9). Полученные данные предполагают явное нейропротективное действие LF и несколько менее выраженное действие на нейрональное развитие (Фиг.1).