СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОДЛОЖЕК С МНОНОСЛОЙНЫМ ПОКРЫТИЕМ НА ОСНОВЕ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ МИКРОКАПСУЛ, СОДЕРЖАЩИХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Область техники.

Изобретение относится к областям диагностики, медицины, экологии, сельскому хозяйству, пищевой промышленности, в которых используют биологически активные вещества, размещенные на стеклянных подложках.

Уровень техники

Известны ультратонкие полимерные покрытия, образованные противоположно заряженными полиэлектролитами, на основе которых формируют полупроницаемые покрытия для формирования полиэлектролитных мультислоев и для формирования полиэлектролитных микрокапсул с диаметром от 0,1 мкм [1-3].

Для формирования сферической формы микрокапсул используют разного рода наполнители, в качестве которых используют органические и неорганические материалы. В случаях, когда в качестве активного вещества в микрокапсулах используются биологически активные элементы, например ферменты, очень важно использовать технологию формирования микрокапсул, которая не влияет на активность ферментов.

Известен способ формирования микрокапсул, который включает в себя предварительное формирование ядра микрокапсулы в виде микросферолита СаСО₃ с включенным в него белком и последующее послойное покрытие ядра, состоящее из чередующихся слоев поликатионов и полианионов [4]. В патенте №2369386 [5] в качестве формообразующего компонента также используют СаСО₃, который удаляют из капсул с помощью ЭДТА. В процессе растворения ядра микрокапсулы находятся в свободном состоянии, и удаление СаСО₃ проходит эффективно, поскольку растворитель можно перемешивать, и растворенный СаСО₃ диффундирует через поры микрокапсул.

Однако отдельные микрокапсулы, иммобилизированные на поверхность стеклянной подложки, подвержены любому внешнему воздействию, и такую конструкцию достаточно сложно использовать для применения в диагностических целях.

Наиболее близкое техническое решение по применению микрокапсул с ферментами для построения биосенсоров описано в патенте №2333231 [6]. В патенте описывается ультратонкое полимерное покрытие, состоящее из чередующихся слоев поликатионов и полианионов, между которыми находится один или несколько слоев полиэлектролитных микрокапсул, содержащих молекулы фермента. В патенте №2333231 в качестве формообразующего компонента ядра микрокапсулы также используют СаСО₃, который удаляют из капсул с помощью ЭДТА. Покрытие, защищающее поверхность микрокапсул, выполняет роль полупроницаемых мембран, которые свободно пропускают низкомолекулярные вещества, и позволяет сохранить активность ферментов длительное время.

К недостатку изобретения можно отнести тот факт, что в нем недостаточно полно описана технология освобождения микрокапсул от микросферолита СаСО₃ без снижения активности ферментов. Дополнительный мультислой, покрывающий микрокапсулы, создает замкнутый объем и перемешивание растворителя ЭДТА слабо влияет на эффективность растворения микросферолита СаСО₃ в микрокапсулах. Обычно при растворении СаСО₃ стеклянные подложки с мультислоем устанавливают вертикально, как это происходит при промывках. При этом большая часть растворимого осадка микросферолита СаСО₃ проходит через поры микрокапсул в другие нижележащие микрокапсулы, под действием силы тяжести, только небольшая часть выводится в перпендикулярном направлении по отношению к поверхности мультислоя за счет диффузии. Поэтому процесс вывода микросферолита СаСО₃ занимает длительное время, а не выведенные остатки микросферолитов влияют на активность белков и ферментов,

Задача, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, состоит в обеспечении возможности сохранения активности биологически активных веществ, иммобилизируемых в микрокапсулы и дополнительно защищенных многослойным полимерным покрытием.

Другой задачей является повышение эффективности формирования многослойной конструкции за счет снижения временных затрат на соответствующие промывки для удаления формообразующего компонента микрокапсул.

Поставленные задачи решаются тем, что на этапе растворения и вывода формообразующего компонента из ядра микрокапсул устанавливают стеклянные подложки таким образом, чтобы подложка занимала верхнее положение по отношению к многослойному покрытию, при этом наклон стеклянной подложки, по отношению к горизонтальной поверхности, выбирают в пределах от 0 до 90 градусов, что позволяет обеспечить возможность вывода молекул растворяемого формообразующего компонента из объема микрокапсул не только за счет диффузии, но и за счет действия сил тяжести.

Сущность предлагаемого изобретения

Один из аспектов изобретения заключается в способе получения многослойного покрытия, содержащего биологически активные компоненты, которые находятся внутри микрокапсул, закрепленных на стеклянной подложке с помощью чередующихся слоев поликатионов и полианинов. Указанный способ включает нанесение первого полиэлектролитного мультислоя на стеклянную подложку, нанесение промежуточного слоя микрокапсул на первый мультислой, нанесение второго полиэлектролитного мультислоя на поверхность микрокапсул, образующего вместе с первым мультислоем и промежуточным слоем микрокапсул многослойное покрытие, удаление формообразующего компонента из внутреннего объема микрокапсул. При этом, в процессе растворения и удаления формообразующего компонента из микрокапсул, устанавливают положение стеклянной подложки с нанесенным многослойным покрытием таким образом, чтобы подложка занимала верхнее положение по отношению к многослойному покрытию, что позволяет обеспечить возможность вывода молекул растворяемого формообразующего компонента из объема микрокапсул не только за счет диффузии, но и за счет действия сил тяжести, причем наклон стеклянной подложки, по отношению к горизонтальной поверхности, выбирают в пределах от 0 до 90 градусов.

Следующий аспект изобретения состоит в том, что количество и состав слоев, которые наносят поверх органоминеральных ядер выбирают по формуле: ПСС-(ПААГ-ПСС)_n, n=1-7. Более предпчтительно использовать от 3 до 7 слоев при n=1-3.

Следующий аспект изобретения состоит в том, что количество и состав слоев, которые наносят поверх органоминеральных ядер выбирают по формуле: ПААГ-(ПСС-ПААГ)_n, n=1-7. Более предпочтительно использовать от 3 до 7 слоев при n=1-3.

Следующий аспект изобретения состоит в том, что установку положения стеклянной подложки с закрепленными капсулами осуществляют с помощью действия, входящего в группу, состоящую из: а) однократной установки по меньшей мере одной стеклянной подложки в объеме растворителя под фиксированным углом по отношению к горизонтальной поверхности в пределах от 0 до 90 градусов, б) осуществления возвратно-поступательного регулирования угла положения по меньшей мере одной стеклянной подложки в пределах от 0 до 90 градусов по отношению к горизонтальной поверхности, в) перемешивание растворителя при осуществлении действия по п. а) или б).

Следующий аспект изобретения состоит в том, что многослойное покрытие наносят на всю поверхность стеклянной подложки или многослойное покрытие наносят на отдельные рабочие зоны поверхности подложки.

Другой аспект изобретения состоит в том, что толщина стенок микрокапсулы лежит в пределах от 2 до 100 нм, а размер пор стенок микрокапсулы препятствует выводу из объема микрокапсул биологически активных веществ.

Перечень фигур.

Фиг. 1 Варианты размещения стеклянной подложки с нанесенным многослойным покрытием, где: а) многослойное покрытие, содержащее биологически активное вещество, ориентированно вверх, стеклянная подложка размещена горизонтально; б) многослойное покрытие, содержащее биологически активное вещество, ориентированно вниз, и стеклянная подложка размещена под углом 60° относительно горизонтальной плоскости; в) многослойное покрытие, содержащее биологически активное вещество, ориентированно вниз, и стеклянная подложка размещена горизонтально (под углом 0° относительно горизонтальной плоскости); г) многослойное покрытие, содержащее биологически активное вещество, ориентированно вниз, и стеклянная подложка размещена горизонтально (под углом 0° относительно горизонтальной плоскости) и введено дополнительное перемешивание среды.

Перечень сокращений:

ПСС - полистиролсульфонат,

ПААГ - полиаллиламин гидрохлорид,

ПЭИ - полиэтиленимин,

ЭГТА - этиленгликоль-бис(2-аминоэтиловый эфир)N,N,N′,N′-тетрауксусной кислоты.

Описание изобретения

В процессе изучения вопросов формирования многослойных конструкций было обнаружено, что способ вывода из многослойного покрытия формообразующего компонента является определяющим, поскольку влияет непосредственным образом на активность биологически активных компонентов, находящихся внутри иммобилизованных микрокапсул покрытия.

Известно [3], что при удалении формообразующих ядер из микрокапсул, иммобилизированных на поверхности стеклянной подложки и не защищенных вторым верхним мультислоем, не возникает проблем с с удалением формообразующего компонента из внутреннего объема микрокапсул, поскольку практически вся внешняя поверхность микрокапсул доступна для растворителя, который может дополнительно аккуратно перемешиваться. Процесс удаления формообразующих ядер на основе СаСО₃ занимает длительное время и составляет до 12 часов [7].

В случае, когда на стеклянной подложке сформирована многослойная конструкция [6], содержащая: стеклянную подложку, первый мультислой, содержащий два-три слоя чередующихся полиэлектролитов, слой микрокапсул, второй мультислой, содержащий два-три слоя чередующихся полиэлектролитов, то микрокапсулы дополнительно защищены вторым мультислоем от внешнего воздействия. В пространстве между первым и вторым мультислоями, где расположены микрокапсулы, создается не перемешиваемая среда.

При этом вывод фрагментов и молекул формообразующего вещества происходит только за счет диффузии. Дополнительные пористые слои внешнего второго мультислоя затрудняют диффузию растворяемого материала в среду растворителя. Таким образом, резко возрастает время вывода формообразующего компонента из микрокапсул многослойного покрытия даже при перемешивании растворителя и падает активность биологически активных компонентов, иммобилизированных в объеме микрокапсул.

Из практики изготовления подложек с многослойным покрытием на основе микрокапсул известно, что стеклянные подложки вводят в растворитель либо перпендикулярно горизонтальной поверхности растворителя, либо устанавливают на дно емкости с растворителем, стеклянной подложкой вниз с тем, чтобы открыть доступ растворителя к многослойной конструкции, содержащей микрокапсулы.

Поскольку компоненты, которые входят в состав формообразующих ядер под действием силы тяжести опускаются в нижнюю часть микрокапсул, которая прилегает к следующему нижнему слою микрокапсул, создается градиент концентрации вещества, используемого для формообразования по всей длине многослойного покрытия.

При изучении процесса очистки внутреннего объема микрокапсул от формообразующего компонента было обнаружено, что вывод молекул растворяемого формообразующего компонента ускоряется в том случае, когда стеклянная подложка занимает верхнее положение по отношению к многослойному покрытию. Это позволяет обеспечить возможность вывода молекул растворяемого формообразующего компонента из объема микрокапсул не только за счет диффузии, но и за счет действия сил тяжести.

Эффективность вывода формообразующего компонента возрастает при установке стеклянной подложки с обращенной в сторону действия сил тяжести многослойным покрытием под углом в пределах от 0 до 90 градусов к горизонтальной поверхности. Предпочтительно под углом от 0 до 45 градусов, более предпочтительно под углом от 0 до 5 градусов.

Таким образом, наиболее высокая эффективность удаления формообразующего компонента (минеральной части) ядер микрокапсул наблюдалась тогда, когда в процессе растворения ядер многослойное покрытие с ферментами было обращено своей лицевой поверхностью к нижней части резервуара.

Установку положения стеклянной подложки с закрепленными капсулами можно осуществить разными способами. Например, по меньшей мере, одну стеклянную подложку размещают в объеме растворителя под фиксированным углом по отношению к горизонтальной поверхности в пределах от 0 до 90 градусов с помощью крепежных элементов, выполненных, например, в виде решетки или многоярусной конструкции. Другой вариант состоит в осуществлении возвратно-поступательного перемещения положения стеклянной подложки в пределах от 0 до 90 градусов по отношению к горизонтальной поверхности.

Многослойное покрытие может быть сформировано из двух мультислоев, между которыми размещен слой микрокапсул [6]. Многослойное покрытие может содержать промежуточный слой микрокапсул, который состоит из нескольких слоев микрокапсул, разделенных слоями полиионной структуры [8].

Многослойное покрытие может быть нанесено на всю поверхность стеклянной подложки или многослойное покрытие наносят на отдельные рабочие зоны поверхности подложки.

Полученные микрокапсулы (см. пример 1) имеют диаметр от 5 мкм. Толщина стенки микрокапсулы может лежать в пределах от 2 до 100 нм, а размер пор стенок микрокапсулы выбирается таким, что препятствует выводу из объема микрокапсул биологически активных веществ. Биологически активное вещество, входящее в микрокапсулу, выбирают из группы, состоящей из белков, ферментов, антител, фрагментов ДНК. Дополнительно на микрокапсулы иммобилизуют красители, например флуоресцентные или колориметрические красители.

Все изменения, модификации и варианты, совпадающие по смыслу или эквивалентные изложенному в пунктах формулы, должны рассматриваться как входящие в объем патентуемого технического решения.

Пример 1. Формирование многослойного покрытия на стеклянной подложке

Способ изготовления многослойного покрытия аналогичен способу, описанному в [6]. На первом этапе изготавливают органоминеральные ядра, в состав которых входит композиция из формообразующей основы, например, СаСО₃ и один или несколько биологически активных веществ. Биологически активное вещество выбирают из группы, состоящей из белков, ферментов, антител и фрагментов ДНК. Органоминеральные ядра изготавливаются следующим образом. К 0,33 М раствору хлористого кальция, содержащему 1-3 мг/мл биологически активного вещества, добавляют при непрерывном помешивании равный объем 0,33 М водного раствора Na₂CO₃. Образующуюся взвесь микрочастиц карбоната кальция с захваченными молекулами биологически активного вещества отстаивают и затем дважды промывают водным раствором 0,1 М NaCl с рН 6,5.

На втором этапе промытый осадок заливают раствором 1 мг/мл ПСС в 0,5 М NaCl и ставят на шейкер на 15 мин. После адсорбции полимера на поверхности микрочастиц суспензию центрифугируют 40-60 с при 1500 об/мин. Надосадочный раствор сливают, а оставшийся осадок заливают 0,1 М NaCl, переводят его в суспензию, как описано выше, встряхивают 2 мин и снова центрифугируют. Эту процедуру промывки повторяют три раза с целью удаления несвязанных остатков полиэлектролита.

На третьем этапе промытый осадок заливают раствором ПААГ 1 мг/мл 1 в 0,5 М NaCl. Наслаивание ПААГ на микрочастицы производят таким же образом, как и ПСС. Проводят трехкратную промывку в 0,1 М NaCl.

На четвертом этапе адсорбируют последний слой ПСС так, как описано выше. Затем производят финальную трехкратную промывку микрокапсул, причем последний раз суспензию не центрифугируют. Таким образом, поверх органоминеральных ядер наносят от 2 до 3 слоев полиэлектролитов по формуле: ПСС-(ПААГ-ПСС)_n, n=1-7. Предпочтительно формировать микрокапсулы, содержащие от 3 до 7 слоев при n=1-3.

В другом исполнении получают капсулы, количество внешних слоев которых выбирают по формуле ПААГ-(ПСС-ПААГ)_n, n=1-7. В этом случае на втором этапе сначала используют раствор ПААГ. Предпочтительно формировать микрокапсулы, содержащие от 3 до 7 слоев, по формуле: ПСС-(ПААГ-ПСС)_n, при n=1-3.

На следующих этапах изготовления многослойного покрытия проводят нанесение на выбранную стеклянную подложку всех имеющихся компонентов покрытия. Вначале на стеклянную подложку методом поочередной адсорбции наносят последовательно два слоя полиэлектролитов: ПЭИ, ПСС. Стеклянную подложку погружают в водный раствор каждого из этих полиэлектролитов с концентрацией 0,5-1 мг/мл в 0,5 М NaCl на 15 мин. Стеклянную подложку с адсорбированными слоями дважды промывают в растворе 0,1 М NaCl для удаления остатков несвязанного полиэлектролита. Затем наносят слой ПААГ и после адсорбирования ПААГ стеклянную подложку извлекают из раствора и без промывания наносят на нее накалыванием определенное количество суспензии микрокапсул ПСС-(ПААГ-ПСС)_n, n=1-3, изготовленных ранее. Налитую суспензию подсушивают до полного испарения свободной воды при комнатной температуре. На следующем этапе осуществляют защиту слоя микрокапсул тремя слоями полиэлектролитов. С этой целью стеклянную подложку с микрокапсулами однократно промывают в 0,1 М NaCl и затем наносят поверх слоя микрокапсул три слоя полиэлектролитов: ПААГ, ПСС и ПААГ согласно процедуре, описанной выше.

В случае, когда приготовлены капсулы ПААГ-(ПСС-ПААГ)_n, n=1-3, на стеклянную подложку наносят методом поочередной адсорбции только два слоя полиэлектролитов - ПЭИ и ПСС. А затем накапывают суспензию микрокапсул ПААГ-(ПСС-ПААГ)_n, n=1-3. Далее слои наносят аналогично предыдущему абзацу с соблюдением чередования зарядов.

На заключительном этапе многослойное покрытие, нанесенное на стеклянную подложку, помещают в растворитель для удаления формообразующей основы органоминеральных ядер, размещенных внутри микрокапсул. В случае если в качестве формообразующей основы, использовано СаСО₃, в качестве растворителя используют раствор ЭДТА в концентрации 0,1-30 мМ. Предпочтительно в Трис буфере, с концентрацией 2 мМ и рН от 6,5 до 7,5 использовать концентрацию ЭДТА в диапазоне 20-30 мМ. При растворении и удалении формообразующей основы стеклянные подложки с нанесенным многослойным покрытием устанавливают таким образом, чтобы стеклянная подложка располагалась сверху по отношению к многослойному покрытию, при этом наклон стеклянной подложки, по отношению к горизонтальной поверхности, выбирают в пределах от 0 до 90 градусов, что позволяет обеспечить возможность вывода молекул растворяемого формообразующего компонента из объема микрокапсул не только за счет диффузии, но и за счет действия сил тяжести,

Стеклянная подложка с многослойным покрытием выдерживается в растворителе до полного растворения минеральной части ядер. Затем производят двукратную промывку многослойного покрытия и проверку активности многослойного покрытия.

Проведены измерения активности биологически активных веществ, иммобилизованных в микрокапсулах, в которых органоминеральные ядра удалялись с помощью разных типов растворителей. В качестве биологически активных веществ использованы ферменты пероксидазы хрена или уреазы. В таблице 1 и таблице 2 приведены данные по значению активности ферментов пероксидазы хрена или уреазы, помещенных в микрокапсулы, по сравнению с активностью свободного фермента, принятого за 100%, для разных сред, в которых удаляют кальций-карбонатные ядра. Измерены значения активности ферментов при удалении минеральной части ядер тремя способами: а) удаление минеральной части ядер осуществляется только за счет диффузии F1, при этом стеклянная подложка 1 установлена горизонтально на дне емкости 4 с растворителем 3 (см. фиг 1а), при этом многослойное покрытие 2 расположено сверху стеклянной подложки, б) удаление минеральной части ядер осуществляется под действием диффузии F1 и силы тяжести F2 при наклоне стеклянной подложки под углом 60° относительно горизонтальной поверхности дна емкости 4, когда многослойное покрытие 2 размещено под подложкой 1 и ориентированно вниз (см. фиг. 1б), в) удаление минеральной части ядер осуществляется под действием диффузии F1 и силы тяжести F2 при горизонтальном положении стеклянной подложки 1 (что соответствует наклону под углом 0° относительно горизонтальной плоскости), при этом многослойное покрытие 2 ориентированно вниз (см. фиг. 1в), г) удаление минеральной части ядер осуществляется под действием диффузии F1, силы тяжести F2 и за счет дополнительного перемешивания растворителя 3 мешалкой 5 (см. фиг. 1г), при расположении многослойного покрытия 2, ориентированного вниз для горизонтального положения стеклянной подложки 1 (что соответствует наклону стеклянной подложки под углом 0° относительно горизонтальной плоскости).

Измерение проводилось в двух разных средах. В деионизированной воде с концентрацией ЭДТА, 0,2 мМ (см Таблицу №1) и в Трис буфере с концентрацией 2 мМ и рН 7,0 и концентрацией ЭДТА в 25 мМ. (см Таблицу №2).

Данные эксперимента показывают, что эффективность удаления органоминеральных ядер и, следовательно, увеличение активности ферментов, содержащихся в микрокапсулах исследуемого многослойного покрытия, возрастает в несколько раз при расположении многослойного покрытия, ориентированного вниз для горизонтального положения стеклянной подложки. Кроме того, важную роль играет выбор среды, в которой размещены растворители, например ЭДТА.

Промышленное применение.

Настоящее изобретение может быть с успехом использовано для создания новых типов многослойных покрытий, содержащих биологически активные компоненты, внутри микрокапсул. Разработанный способ позволяет сократить время удаления формообразующего компонента с 12-16 до 1-3 часов и увеличить активность фермента, помещенного в микрокапсулы покрытия, от четырех до шести раз. Указанные многослойные покрытия могут быть использованы для исследования и анализа биологических материалов, например крови, мочи, а также для определения биологически активных соединений в экологии, пищевой промышленности, сельском хозяйстве.

Литература

1. Caruso et al. Fabrication of multilayer-coated particles and hollow shells via electrostatic self-assembly of nanocomposite multilayers on decomposable colloidal templates. US Patent №6,479,146 (November 12, 2002).

2. Donath et al. Production of nanocapsules and microcapsules by layer-wise polyelectrolyte self-assembly. US Patent №7,101,575 (September 5, 2006).

3. Voigt, et al. Production of polyelectrolyte capsules by surface precipitation. US Patent №7,056,554 (June 6, 2006).

4. Sukhorukov GB, Montrel MM, Petrov AI, Shabarchina LI. Multilayer films containing immobilized nuclecie acids. Their structure and possibilities in biosensor application. Biosens Bioelectron 1996; 11: 913.

5. Сухоруков Б.И. и др. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЗАГРУЖЕННЫХ БЕЛКОМ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ НАНО- И МИКРОКАПСУЛ. Патент RU №2369386 (10.10.2009).

6. Монтрель М.М. и др. УЛЬТРАТОНКОЕ ПОЛИМЕРНОЕ ПОКРЫТИЕ, СПОСОБ ЕГО ИЗГОТОВЛЕНИЯ И ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ БИОСЕНСОР НА ЕГО ОСНОВЕ. Патент RU №2333231 (10.10.2009).

7. Shabarchina L.I. et al. Design of Enzyme-containing Polyelectrolyte Nano- and Microcapsules and Creation of Microdiagnosticum (www.medline.ru/news/conf/konf-nanobio.pdf).

8. Дементьев А.А. и др. ТОНКОПЛЕНОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ, СОДЕРЖАЩИЙ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ КОМПОНЕНТЫ, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТОНКОПЛЕНОЧНОГО МАТЕРИАЛА, СОДЕРЖАЩЕГО ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ КОМПОНЕНТЫ. Патент RU №2326898 (20.06.2008).