Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИАМИНА КАДАВЕРИНА ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ СТРЕССОВЫХ СИТУАЦИЙ Vibrio cholerae 01 И 0139 СЕРОГРУПП

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к изучению биологических свойств холерных вибрионов, и может быть использовано в лабораторной диагностике при определении диапазона вариабельности штаммов холерных вибрионов в условиях in vitro и in vivo.

Для холерных вибрионов характерным является возможность смены экологических ниш в процессе жизнедеятельности, сильно отличающихся друг от друга по физико-химическим показателям. Поэтому проблема адаптации холерных вибрионов к стрессу, возникающему в процессе перехода из окружающей среды в организм человека и обратно, является актуальной. Воздействие неблагоприятных факторов (стрессоров) способствует формированию у микроорганизмов универсальных механизмов защиты. В качестве таких неспецифических адаптогенов рассматриваются полиамины, которые вовлечены в различные нормальные физиологические процессы, включая регуляцию экспрессии генов, трансляцию, пролиферацию клеток, модуляцию сигнализации клетки, стабилизацию мембран.

Важнейшими полиаминами, содержащимися во всех живых клетках, являются: путресцин, спермидин, спермин и кадаверин. Последний в большей степени отмечается у холерных штаммов O1 и О139 серогрупп. Эксперементально установлено, что в ответ на воздействие сублетальных доз антибиотиков, поступающих через пориновые каналы, в клетках микроорганизмов в несколько десятков раз возрастает содержание кадаверина. В связи с этим задача определения концентрации кадаверина в исследуемых штаммах является актуальной.

Известно влияние полиаминов путресцина и спермидина на устойчивость условно-патогенных бактерий (E.coli, P.aeruginosa и др.) к окислительному, кислотному, тепловому и другим видам стресса за счет их антиоксидантных свойств, а также за счет способности ингибировать проницаемость пориновых каналов клеточной стенки, как бы обосабливая микробную клетку от вредного окружения (см. 1, 2, 3).

В практической медицине известны: способ определения полиаминов по флюоресценции их производных путем денситометрии фотонегативов хроматограмм после разделения дансилированных экстрактов биологического материала хроматографическим методом в тонких слоях селикагеля (см. 4); способ превращения полиаминов в бензоильные производные с последующим определением методом ВЭЖХ с обращенными фазами (см. 5); способ определения полиаминов на готовых пластинках Силуфол UV-254 с последующей флюорометрией фракций дансильных производных полиаминов на автоматизированном микроскопе-анализаторе ПРОТВА-С ("ЛОМО") (см. 6).

Недостатками этих способов являются сложность, трудоемкость, длительность выполнения, недостаточная точность, низкая четкость и качество результатов разделения фракций, а, кроме того, невозможность использования при работе с ПБА I-II групп патогенности.

За прототип выбран способ определения биогенных аминов в пробах пива (см. 7), заключающейся в том, что разработан чувствительный капиллярный электрофоретический метод по одновременному определению 10 биологических аминов в образцах пива, используя лайзер-индукционную флюоресценцию. На первом этапе образцы аминов были подвергнуты дериватизации, мечению флюорохромной меткой, отфильтрованы и затем разделены в капилляре с буфером (50 мМ борат натрия, 20% ацетон) pH 9,3 при напряжении 30 кВ.

Недостатком прототипа является то, что с его помощью невозможно оценивать продукцию кадаверина у микроорганизмов I-II групп патогенности, в частности - холерных вибрионов.

Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка нового способа определения продукции внутри- и внеклеточного полиамина кадаверина при моделировании стрессовых ситуаций как одного из факторов выживания холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп в условиях стресса в различных экологических нишах.

Поставленная задача достигается тем, что способ определения полиамина кадаверина при моделировании стрессовых ситуаций Vibrio cholerae O1 и О139 серогрупп включает следующие стадии:

а) исследуемую культуру V.cholerae выращивают на агаре Мартена при температуре 37°C в течение 24 часов;

б) готовят бактериальную суспензию густотой 1×10⁹ м.к./мл по стандарту мутности ОСО ГИСК им. Тарасевича;

в) проводят культивирование 0,5 мл полученной суспензии в двух емкостях с 4,5 мл бульона Мартена при 37°C в течение четырех суток, причем первую емкость культивируют в эксикаторе по I модели с содержанием кислорода в пределах 10-12% и углекислого газа 5%, являясь имитацией тонкого отдела кишечника, а вторую емкость - в анаэростате по II модели с содержанием кислорода не более 1% и углекислого газа 9-13%, что соответствует газовому составу толстого отдела кишечника;

г) вносят в эппендорфы (1,2) 1 мл культуры и центрифугируют при 13000 об/мин в течение 15 минут, затем в отдельные эппендорфы (3,4) отбирают 150 мкл надосадочной жидкости, для определения внеклеточной продукции кадаверина, а к оставшемуся в эппендорфах (1,2) осадку добавляют 150 мкл деионизованной воды для определения внутриклеточной продукции кадаверина, при этом в каждый эппендорф вносят по 50 мкл 200 мМ раствора гидрокарбоната натрия pH 9.4, интенсивно перемешивая;

д) готовят контрольную пробу с содержанием кадаверина фирмы «Sigma» 1 мг/мл, для этого в эппендорф вносят 1 мг гидрохлорида кадаверина, кроме того - 49,5 мкл 200 мМ раствора гидрокарбоната натрия и 150 мкл деионизованной воды интенсивно перемешивая;

е) пробы прогревают при 99°C в течение 30 минут в термостате «Термит», после этого в них вносят 100 мкл 10 мМ раствора FITC в 80% ацетоне и 200 мкл 50% ацетона, затем пробы инкубируют 2 часа при температуре 50° C для связывания флуоресцентного красителя FITC с кадаверином;

ж) во все пробы добавляют 500 мкл деионизованной воды, перемешивают и центрифугируют 5 минут при 13000 об/мин, после этого 200 мкл центрифугата разливают в пластиковые пробирки объемом 600 мкл;

з) проводят исследование проб в системе капиллярного электрофореза Backman, для этого 10 нл смеси вводят в кварцевый капилляр, заполненный буфером-электролитом, состоящим из 50 мМ тетрабората натрия pH 9.4, 10% ацетона, 10 мМ β-циклодекстрина;

и) учет результатов получают с помощью компьютерных электрофореграмм, на которых считывают цифровое выражение пиков образцов в момент детекции кадаверина, регистрация которого достигается в виде пика свечения 520 нм при длине возбуждения 488 нм аргоновым лайзером, после этого определяют количество продуцируемого кадаверина в исследуемых пробах по формуле:

,

где С - концентрация кадаверина исследуемого штамма холерных вибрионов, мкг/мл;

Ск - концентрация кадаверина в контрольной пробе, мкг/мл;

Ро - цифровое выражение пика опытного образца;

Рк - цифровое выражение пика контрольного образца.

Способ осуществляется следующим образом:

а) Одну из исследуемых культур Vibrio cholerae O1 и О139 серогрупп выращивают в чашках Петри на агаре Мартена pH 7,8 при температуре 37°C в течение 18-24 часов.

б) Готовят бактериальную суспензию густотой 1·10⁹ м.к./мл из выращенных культур по стандарту мутности ОСО ГИСК им. Тарасевича, которую титруют двухкратно до 10⁷ м.к./мл.

в) Вносят 0,5 мл полученной взвеси в две емкости с 4,5 мл бульона Мартена и культивируют при 37°C в течение 4 суток, причем первую емкость культивируют в эксикаторе (I модель), где содержание О₂ 10-12% и СО₂ 5%, что является имитацией газовой среды тонкого отдела кишечника, а вторую культивируют в анаэростате с газ-пакетами AnaeroGen (II модель), обеспечивающими газовый состав с содержанием кислорода не более 1% и СО₂-9-13%, соответствующим газовому составу толстого отдела кишечника.

г) После культивирования из обеих емкостей переносят по 1 мл исследуемой культуры в эппендорфы(1,2) для первой и второй моделей и центрифугируют при 13000 об/мин в течение 15 минут. Затем в отдельные эппендорфы (3,4) переносят 150 мкл надосадочной жидкости для последующего определения внеклеточной продукции кадаверина, а к оставшемуся в эппендорфах (1,2) осадку добавляют 150 мкл деионизированной воды для определения внутриклеточной продукции кадаверина, при этом в каждый эппендорф вносят по 50 мкл 200 мМ раствора гидрокарбоната натрия pH 9,4 интенсивно перемешивая.

д) Одновременно готовят контрольную пробу с содержанием кадаверина (фирмы «Sigma») 1 мг/мл, для этого последний вносят в эппендорф, туда же вносят 49,5 мкл 200 мМ раствора гидрокарбоната натрия и 150 мкл деионизованной воды, интенсивно перемешивая.

е) Полученные смеси, в том числе и контрольную, прогревают при 99C° в течение 30 минут в твердотельном термостате «Термит» и вносят в них 100 мкл 10 мМ раствора FITC (флюорохрома изотиоционат) в 80% ацетоне и 200 мкл 50% ацетона, после этого пробы инкубируют 2 часа в термостате «Гном» при температуре 50° C для связывания флуоресцентного красителя FITC с кадаверином.

ж) Добавляют во все пробы 500 мкл деионизованной воды, перемешивают и центрифугируют 5 минут при 13000 об/мин, после этого 200 мкл центрифугата разливают в пластиковые пробирки объемом 600 мкл.

з) Полученные пробы исследуют в системе капиллярного электрофореза Backman, для этого смесь из каждой пробы в объеме 10 нл вводят в кварцевый капилляр, заполненный буфером-электролитом, состоящим из 50 мМ тетрабората натрия pH 9,4, 10% ацетона, 10 мМ β-циклодекстрина.

и) Учет результов способа осуществляют на компьютере в виде электрофореграмм (см.чертеж), где получена кривая на каждую пробу, в том числе и контрольную, отражающую в системе FITC-кадаверин момент, когда кадаверин достигает зоны детекции и регистрируется в виде пика свечения 520 нм при длине возбуждения 488 нм аргоновым лайзером. Полученные с помощью электрофореграмм цифровые выражения пиков опытных и контрольных образцов позволяют определять количество продуцируемого кадаверина у исследуемых штаммов холерных вибрионов по формуле:

где С - концентрация кадаверина исследуемого штамма холерных вибрионов, мкг/мл;

Ск - концентрация кадаверина в контрольной пробе, мкг/мл;

Ро - цифровое выражение пика опытного образца;

Рк - цифровое выражение пика контрольного образца.

Пример 1

Изучение влияния стрессовой ситуации на штаммах холерных вибрионов O1 серогруппы:

а) штамм № 18774, выделенный из воды реки Темерник (2005 г.), эпидемически не опасный (ctx- tcp-).

Стресс создают на модели тонкого отдела кишечника, имеющего заданный газовый состав кислорода и углекислого газа. Используют технологию, описанную выше, и, получив цифровое выражение пиков, рассчитывают кадаверин по формуле и выражают в мкг/мл:

1. Продукция внутриклеточного кадаверина:

Ро=6997; Рк=141069; Ск=1 мг/мл=1000 мкг/мл

2. Продукция внеклеточного кадаверина:

Ро=8960; Рк=122724; Ск=1 мг/мл=1000 мкг/мл

б) штамм №18826, выделенный от больного человека в г. Тверь (2005 г.), эпидемически опасный (ctx+tcp+):

1. Продукция внутриклеточного кадаверина:

Ро=24894; Рк=141069; Ск=1 мг/мл=1000 мкг/мл

2. Продукция внеклеточного кадаверина:

Ро=35804; Рк=122724; Ск=1 мг/мл=1000 мкг/мл

Следовательно, холерные вибрионы штамма №18826 продуцируют как внеклеточный, так и внутриклеточный кадаверин в большем количестве, чем водный штамм №18774. При этом продукция внеклеточного кадаверина в обоих случаях значительно больше, чем внутриклеточного.

Пример 2

Изучение влияния стрессовой ситуации на штаммах холерных вибрионов О139 серогруппы:

а) штамм №18772, выделенный из воды р. Москвы (2005 г.), эпидемически не опасный (ctx- tcp-).

Условия стресса создают на модели толстого отдела кишечника человека, имеющего заданный газовый состав кислорода и углекислого газа. Используют технологию такую же, как в примере 1, и, получив цифровое выражение пиков, рассчитывают кадаверин по формуле:

и выражают в мкг/мл.

1. Продукция внутриклеточного кадаверина:

Ро=5695; Рк=141069; Ск=1 мг/мл=1000 мкг/мл

2. Продукция внеклеточного кадаверина:

Ро=25770; Рк=122724; Ск=1 мг/мл=1000 мкг/мл

б) штамм №16065, выделенный от больного человека в г. Азове (1993 г.), эпидемически опасный (ctx+tcp+):

1. Продукция внутриклеточного кадаверина:

Ро=11913; Рк=141069; Ск=1 мг/мл=1000 мкг/мл

2. Продукция внеклеточного кадаверина:

Ро=48686; Рк=122724; Ск=1 мг/мл=1000 мкг/мл

Таким образом, холерные вибрионы штамма №16065 продуцируют как внеклеточный, так и внутриклеточный кадаверин в большем количестве, чем водный штамм №18772. При этом продукция внеклеточного кадаверина в обоих случаях значительно больше, чем внутриклеточного.

Анализ примеров 1, 2 показывает (см. таблицу 1, 2), что в условиях стресса при изменении концентрации кислорода и углекислого газа у исследованных с помощью данных моделей штаммов продукция внутриклеточного кадаверина снижается, а внеклеточного увеличивается. Следовательно, чем выше уровень кадаверина, тем микроорганизм устойчивее к стрессу.

Пример 3

Изучение влияния кислотности среды на продукцию кадаверина холерными вибрионами.

Штамм №17899 холерных вибрионов O1 серогруппы, выделенный из воды р. Темерник (1999 г.), эпидемически не опасный (ctx- tcp-).

Технология проведения способа осуществлялась, как в примерах 1, 2, за исключением того, что стресс создавали за счет закисления среды при утилизации содержащейся в среде глюкозы. Для этого при культивировании штамма в бульон Мартена pH 7,8 добавляли глюкозу до конечной концентрации 1%, в результате чего pH снижалась до 5,0. Получив цифровое выражение пиков рассчитывают кадаверин по формуле:

и выражают в мкг/мл.

Культивирование в бульоне Мартена без глюкозы (контроль):

1. Продукция внутриклеточного кадаверина:

Ро=1999; Рк=151458; Ск=1 мг/мл=1000 мкг/мл

2. Продукция внеклеточного кадаверина:

Ро=1647; Рк=151458; Ск=1 мг/мл=1000 мкг/мл

Культивирование в бульоне Мартена с добавлением 1% глюкозы (опыт):

1. Продукция внутриклеточного кадаверина:

Ро=20978; Рк=151458; Ск=1 мг/мл=1000 мкг/мл

2. Продукция внеклеточного кадаверина:

Ро=39471; Рк=151458; Ск=1 мг/мл=1000 мкг/мл

Таким образом, холерные вибрионы штамма №17899 практически не продуцируют кадаверин при выращивании их в обычных условиях (бульон Мартена), однако в условиях стресса (закисление среды при утилизации содержащейся в среде глюкозы) продукция кадаверина резко возрастает (см. таблицу 3).

Использование предлагаемого изобретения позволяет по количественной концентрации кадаверина оценивать потенциал холерных вибрионов в реализации их адаптивных функций и возможности выживания в различных средах, приближенных путем моделирования к различным экологическим нишам.

Кроме того, изучение влияния кадаверина на холерные вибрионы O1 и О139 серогрупп дает возможность этим способом использовать приемы, допустимые при работе с микроорганизмами II группы патогенности с учетом требований биологической безопасности, а повышение уровня антибиотикорезистентности штаммов выводит холеру на центральное место в повестке дня проблем здравоохранения.

Источники информации

1. Ткаченко А.Г., Федотова М.В. Зависимость защитных функций полиаминов Escherichia coli от стрессорных воздействий супероксидных радикалов // Биохимия. - 2007. - Т. 72. - №1. - С. 128-136.

2. Ткаченко А.Г. Молекулярные механизмы стрессорных ответов у микроорганизмов. - Изд.: Екатеринбург, УрО РАН. - 2012. - 267 с.

3. Шумков М.С. Полиамины как фактор множественной стрессорной устойчивости Escherichia coli. Автореф… дисс. к.б.н. - Пермь. - 2007. - 26 с.

4. Чудинов А.А., Чудинова Л.А., Коробов В.П. Метод определения низкомолекулярных олигоаминов в различном биологическом материале // Вопросы медицинской химии. - 1984. - №4. - С. 127-128.

5. Asotra S., Miadenov P.V., Burke R.D. Improved method for benzoyl chloride derivatization of polyamines for high-performance liquid chromatography // J. Chromatog. - 1987. - V. 408. - P. 227-233.

6. Сяткин С.П., Березов T.T. Микрометод флюорометрического определения содержания полиаминов и путресцина в тканях животных тонкослойной хроматографией на пластинках Силуфол UV-254 // Вопросы медицинской химии.-1981.- №6.- С.848-849.

7. Cortacero-Ramirrez S., Arrarez-Romarn D., Segura-Carretero A., Fernarndez-Gutierrez A. Determination of biogenic amines in beers and brewing-process samples by capillary electrophoresis coupled to laser-induced fluorescence detection//Food Chemistry.-2007.- V.100.- P.383-389.