Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОПОЛИМЕРА 3-ГИДРОКСИБУТИРАТА, 3-ГИДРОКСИВАЛЕРАТА И 4-ГИДРОКСИБУТИРАТА

Изобретение относится к способам получения биоразрушаемых высокомолекулярных биополимеров (гидроксиалкановых кислот (полигидроксиалканоатов, ПГА). Может быть использовано в биотехнологии для получения материалов, применяемых, например, в медицине для изготовления эндопротезов, хирургических шовных и других материалов, для функционирования фармакологических контролируемых систем доставки лекарственных средств, в качестве носителей для клеточной и тканевой инженерии, в сельском и коммунальном хозяйстве в виде разрушаемых тепличных конструкций, упаковки, например для удобрений, препаратов или семян, и в других отраслях народного хозяйства.

Биотехнологические способы получения ПГА основаны на способности прокариотических микроорганизмов продуцировать эти биополимеры в качестве эндогенного депо энергии и углерода.

Известны способы получения многокомпонентных и разнообразных по составу ПГА, образованных не только мономерами 3-гидроксибутирата, но и другими мономерами: 2-гидроксибутирататом, 2-гидроксивалератом, 3-гидроксивалератом, 3-гидроксигексаноатом, 3-гидроксиоктаноатом, 3-гидроксидодеканоатом, а также 4-гидроксибутироатом, 4-гидроксивалератом и их сополимерами, штаммами-продуцентами. Эти ПГА, в отличие от гомогенного П3ГБ, характеризуются большей механической прочностью и эластичностью, способностью перерабатываться в разнообразные изделия с высокими физико-механическими характеристиками и более высокой скоростью биодеградации в биологических средах [патенты США №№: 5,245,023 (September 14, 1993); 6,323,010 (November 27, 2001); 6,316,262 (November 13,2001); 6,593,116 (Jule 15, 2003); 6,689,589 (February 10, 2004); 6,838,493 (January 4, 2005); 7,229,804 (June 12, 2007)].

Недостатки данных решений - использование в качестве продуцентов гетерополимерных ПГА генетически модифицированных организмов, которые требуют для роста специализированных дорогостоящих сред, а также характеризуются нестабильностью в процессе культивирования и возможностью снижения или утраты способности синтезировать ПГА требуемого состава и с высокими выходами.

Особо ценными и перспективными является сополимерные ПГА, содержащие в своем составе мономеры 4-гидроксимаслянй кислоты (4ГБ), которые придают полимерам свойства эластомеров. Для синтеза сополимеров, содержащих мономеры 4ГБ в качестве необходимого субстрата-предшественника в составе питательной среды используют 4-гидроксимасляную кислоту, γ-бутиролактон, 1,4-бутандиол, применение которых приводит к увеличению содержания 4-гидроксибутирата в сополимере, но ингибирует рост бактерий и накопление собственно сополимера. В зависимости от концентрации основного источника углерода (фруктоза, 3-гидроксимасляная кислота, масляная кислота и др.) и субстрата-предшественника (4-гидроксимасляная кислота, γ-бутиролактон, 1,4-бутандиол), а также режима культивирования бактерий, получают полимеры с различным соотношением 3-гидроксибутирата (3ГБ) и 4-гидроксибутирата (4ГБ).

Известны способы получения 3-компонентных ПГА, образованных мономерами 3-гидроксибутирата (3ГБ), 4-гидроксибутирата (ГБ) и 3-гидроксивалерата (3ГВ), которые получены в культурах природных штаммов Cupriavidus sp. USMAA2-4 и Alcaligenes sp. А-04а.

По способу, описанному в работе [Aziz NA, Sipaut CS, Abdullah AA-A. Improvement of the production of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate-co-4-hydroxybutyrate) terpolyester by manipulating the culture condition. J Chem Technol Biotechnol. - 2012. - Vol. 87. - P. 1607-1614.50], в культуре Cupriavidus sp. USMAA2-4 варьированием составом субстратов-предшественников и соотношением C/N в среде получены сополимеры с содержанием мономеров 3ГВ на уровне 23 мол. % и мономеров 4ГБ 26 мол. %.

Известен способ синтеза 3-компонентных ПГА - П(3ГБ/3ГВ/4ГБ) в культуре Ralstonia eutropha при культивировании в ферментере на глюкозе; обепечивший высокий выход по биомассе (136 г/л) и сополимера (62%). Доминирующими в 3-компонентном сополимере были мономеры 3ГБ, а содержание мономеров 3ГВ и 4ГБ были на низком уровне, 2 и 5 мол. % соответственно [Madden LA, Anderson AJ, Asrar J, Berger P, Garrett P. Production and characterization of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate-co-4-hydroxybutyrate) synthesized by Ralstonia eutropha in fed-batch cultures. Polymer. - 2000. - Vol. 41. = P. 3499-3505.52].

Недостаток способов аналогов - невысокий общий выход сополимера и невысокое содержание в них мономеров 4ГБ и 3ГВ.

Прототипом изобретения является способ получения ПГА, заключающийся в культивировании штамма-продуцента Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646 в условиях аэрации и перемешивания на жидкой солевой среде, содержащей основной углеродный субстрат и субстраты-предшественники в качестве дополнительного источника углерода, при лимите азота на первом этапе и в безоазотной среде - на втором этапе [Патент РФ №2439143, опубл. 10.01.2012 г.]. Способ обеспечивает синтез сополимерных ПГА, в том числе трехкомпонентных, образованных мономерами 3-гидроксибутирата (3ГБ), 3-гидроксивалерата (3ГВ) и 4-гидркосибутирата (4ГБ) 3ГБ, 3ГВ, 4ГБ в различном соотношении; при этом содержание мономеров 3-гидрокисбутирата от 34,8 до 70,1 мол. %; 4-гидроксибутирата - ниже 30 мол. %, максимально до 28,5 мол. %; 3-гидроксивалерата максимально до 36,6 мол. %.

Недостаток способа - невысокое содержание в сополимерных ПГА мономеров 4ГБ и 3ГВ; невысокие общие выходы сополимеров (28-49% от веса сухого вещества биомассы клеток), вариабельные значения степени кристалличности в диапазоне 12-46%.

Задачей изобретения является увеличение общего выхода сополимера при его получении, улучшение физико-химических, физико-механических, технологических свойств полимера путем повышения содержания мономеров 4ГБ и 3ГВ в его составе и снижения степени кристалличности сополимеров, пригодных для получения эластичных пленок.

Задача решается тем, что в способе получения сополимера 3-гидроксибутирата, 3-гидроксивалерата и 4-гидркосибутирата, включающем культивирование штамма-продуцента Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646 в условиях аэрации и перемешивания на жидкой солевой среде, содержащей основной углеродный субстрат и дополнительный источник углерода - субстраты-предшественники в виде валерата калия и гамма-бутиролактона, согласно изобретению жидкая солевая среда содержит дрожжевой экстракт в концентрации 2 г/л, в качестве основного углеродного субстрата используют глюкозу или олеиновую кислоту, при этом валерат калия при концентрации 1,0-2,0 г/л и гамма-бутиролактон при концентрации 1,5-2,5 г/л вводят на первом этапе процесса ферментации постепенно в течение 1,5-2 ч при общей продолжительности процесса не менее 32 ч.

Способ осуществляют следующим образом. Культуру штамма-продуцента Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646 выращивают в периодическом режиме при постоянной аэрации и перемешивании на солевой среде Шлегеля на сахарах или органических кислотах в качестве основного углеродного субстрата: на первом этапе при избытке углеродного субстрата на полной солевой среде и при лимитировании роста бактерий по азоту; на втором этапе - в безазотной среде при полной обеспеченности углеродным субстратом. На первом этапе в состав среды дополнительно вносят дрожжевой экстракт в концентрации 2 г/л. В качестве основного углеродного субстрата используют глюкозу или олеиновую кислоту. На первом этапе процесса ферментации в культуру вносят дополнительный углеродный субстрат (субстраты-предшественники) - гамма-бутиролактон и валерат калия в концентрациях, не вызывающих резкого ингибирования роста бактерий и синтеза полимеров. Валерат калия вводят при концентрации 1,0-2,0 г/л и гамма-бутиролактон при концентрации 1,5-2,5 г/л постепенно в течение 1,5-2 ч при общей продолжительности процесса не менее 32 ч.

Выделение полимера из биомассы проводят дихлорметаном. Полученный экстракт после его концентрирования на роторном испарителе Rotavapor R-210 (Швейцария) осаждают изопропанолом. Для получения высокоочищенных образцов процедуру перерастворения и осаждения проводят многократно. Полимер сушат в боксе-ламинаре. Исследуют и анализируют физико-химические характеристики. Получают изделия, например пленки, одним из известных способов.

Физико-механические характеристики пленок изучали с использованием универсальной испытательной машины Instron 5565, 5KN (Instron, Великобритания) при комнатной температуре. Базовая (начальная) длина образцов - от 20,0 до 50,0 мм; скорость растяжения 3 мм/мин. Регистрировали относительное разрывное удлинение как показатель эластичности образцов.

Адгезионные свойства поверхности пленок с различным содержанием мономеров 3ГБ, 3ГВ и 4ГБ исследованы в культуре линейных фибробластов NIH 3Т3. Образцы пленок помещали на дно 24-луночных планшетов (Orange Scientific). В качестве контроля были использованы планшеты без полимерных мембран из полистирола. Засев матриксов клетками проводили из расчета 10⁵ клеток на см². Культивирование клеток проводили от 3-х до 7-ми суток и более. Фибробласты культивировали на среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и раствора антибиотиков (стрептомицин 100 мкг/мл, пенициллин 100 ЕД/мл) (Sigma, США) в СO₂-инкубаторе при 5% атмосфере СO₂ при 37°C. Замену среды производили раз в три дня.

Сущность изобретения поясняется графическими материалами.

На фиг. 1 представлены структурная формула и ¹H-ЯМР спектр сополимера 3-гидрокисмасляной, 3-гидроксивалеиановой и 4-гидроксимасляной кислот [П(3ГБ/3ГВ/4ГБ)], содержащего мономеры 3-гидроксибутирата (3ГБ), 3-гидроксивалерата (3ГВ), 4-гидроксибутирата (4ГБ).

На фиг. 2 представлены ионная хроматограмма и масс-спектры мономеров, входящих в состав сополимера: 3-гидрокисмасляной, 3-гидроксивалериановой и 4-гидроксимасляной кислот.

На фиг. 3 представлены РЭМ снимки пленок, полученных из сополимеров П(3ГБ/3ГВ/4ГБ)] с различным содержанием мономеров.

На фиг. 4 представлены результаты оценки жизнеспобности фибробластов мыши линии NIH 3Т3 в МТТ тесте, культивируемых на полимерных пленках из сополимеров П(3ГБ/3ГВ/4ГБ), в сравнении с контролем (полистирол) и гомополимер 3-гидроксимасляной кислоты (П3ГБ).

На фиг. 5 представлены фото фибробластов, адгезированных и пролиферирующих на полимерных пленках из сополимеров П(3ГБ/3ГВ/4ГБ), в сравнении с контролем (полистирол) и гомополимер 3-гидроксимасляной кислоты (П3ГБ). Окраска флуоресцентными красителями FITC и DAPI (маркеры на цитоплазму и ядерную ДНК).

Технический результат изобретения заключается в следующем. Предложенный способ культивирования штамма-продуцента при дозированной и постепенной подаче в культуру субстратов-предшественников и варьирование их доз и последующего времени культивирования обеспечивает синтез трехкомпонентных ПГА с выходами от 52 до 60% с суммарным содержание мономеров 3ГВ и 4ГБ выше 50 мол.% (от 51.7 до 74.7 мол. %) при содержании мономеров 3ГБ ниже 50 мол.% (от 25.30 до 46.20 мол.%). Образцы сополимеров П(3ГБ/3ГВ/4ГБ) имеют степень кристалличности ниже 30% (максимально 24%, минимально 8%). Полученные полимерные пленки характеризуются эластичностью и имеют показатель удлинения при разрыве свыше 100% (от 146 до 318%). Обеспечивают более эффективную адгезию и рост клеток по сравнению с гомополимером 3-гидрокибутиратом (3ГБ) и контрольным полистиролом. Обеспечивают высокие показатели по адгезии, росту и жизнеспособности фибробластов NIH 3Т3.

Для повышения продуктивности процесса на первом этапе в состав среды дополнительно вносят дрожжевой экстракт в концентрации 2 г/л. В качестве основного углеродного субстрата используют глюкозу или олеиновую кислоту. На первом этапе процесса ферментации в культуру вносят дополнительный углеродный субстрат (субстраты-предшественники) - гамма-бутиролактон и валерат калия в концентрациях, не вызывающих резкого ингибирования роста бактерий и синтеза полимеров. Валерат калия вводят при концентрации 1,0-2,0 г/л и гамма-бутиролактон при концентрации 1,5-2,5 г/л постепенно в течение 1,5-2 ч при общей продолжительности процесса не менее 32 ч.

Получение 3-компонентных сополимерных полигидроксиалканоатов П(3ГБ/3ГВ/4ГБ) на основе штамма Cupriavidus eutrophus В-10646 и их свойства иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1. Музейную культуру штамма-продуцента Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646, хранящуюся на агаризованной среде в при 5°С, суспендируют в жидкой солевой среде, содержащей (г/л): глюкозу - 20 г/л, Na₂HPO₄·H₂O - 9.1, KН₂РO₄ - 1.5; MgSO₄·H₂O - 0.2, Fе₃C₆ H₅O₇·7H₂O - 0.25, CO(NH₂)₂ - 1.0. Стандартный раствор микроэлементов по Хоагланду из расчета 3 мл на 1 л питательной среды, который содержит: H₃ВО₃ - 0.228, СоСе₂×6H₂O - 0.030, CuSO₄×5H₂O - 0.008, MnCe₂×4Н₂O - 0.008, ZnSO₄×7H₂O - 0.176, NaMoO₄×2H₂O - 0.050, NiCe₂ - 0.008 (г/л), и раствор железа лимоннокислого 5/г/л из расчета 5 мл раствора на 1 л среды. Культивирование штамма-продуцента проводят в периодическом режиме в стеклянных колбах объемом 1 л при коэффициенте заполнения 0.5 с использованием термостатируемого шейкера-инкубатора «Incubator Shaker Innova® серии 44» «New Brunswick Scientific» (США). Культивирование проводят в течение 15-18 ч при 30°C и pH 7.0. Полученную культуру используют в качестве инокулята для последующего выращивания бактерий в периодическом режиме синтеза полимеров в двустадийной культуре, при котором на первом этапе синтез полимеров стимулируется лимитирующей концентрацией азота (50% от физиологической потребности культуры в концентрации 0,5 г/л); на втором - в безазотной среде. В составе среды содержится дрожжевой экстракт в концентрации 2 г/л. Коэффициент заполнения стеклянных колб объемом 1-2 л составляет от 0,3 до 0,5. Выращивание бактерий проводят при 30°C и pH 7.0 при текущей концентрации глюкозы в культуре не менее 5 г/л. Через 12 ч от начала культивирования с помощью насоса-дозатора в культуру в течение 2 ч подают субстрат-предшественник гамма-бутиролактон в концентрации 1,5 г/л и валерат калия - 2 г/л, продолжая культивирования еще 10 ч. Общее время культивирования на первом этапе составляет 22 ч. После отключения подачи азота в культуру культивирование продолжают при подпитке культуры глюкозой в концентрации не ниже 5 г/л 15 ч. Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 37 ч. Общий выход полимера 52% (к весу сухого вещества клетки). Состав сополимера: 3-гидроксибутират - 46.20; 3-гидроксивалерат - 30.2; 4-гидроксибутират - 23,6 мол.%. Свойства сополимера представлены в таблице. Степень кристалличности образца составила 24%; температура плавления и термической деградации 171 и 280°C; средневесовая молекулярная масса (М_в) 745 кДа. Удлинение при разрыве изготовленной из образца пленки 146%. Количество фибробластов, адгезированных и пролиферирующих на сополимерной пленке данного состава на 7-е сутки культивирования, составило 4,00±0,55×10³ кл./см².

Пример 2. Культивирование штамма-продуцента проводят аналогично Примеру 1. Через 10 ч от начала культивирования с помощью насоса-дозатора в культуру в течение 2 ч подают субстрат-предшественник гамма-бутиролактон в концентрации 2,0 г/л и валерат калия - 1,5 г/л, продолжая культивирование еще 10 ч. Общее время культивирования на первом этапе составляет 20 ч. После отключения подачи азота в культуру культивирование продолжают при подпитке культуры глюкозой в концентрации не ниже 5 г/л еще 12 ч. Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 32 ч. Общий выход полимера 57,4% (к весу сухого вещества клетки). Состав сополимера: 3-гидроксибутират - 45.80; 3-гидроксивалерат - 23.30; 4-гидроксибутират - 31,30 мол.%. Свойства сополимера представлены в таблице. Степень кристалличности образца составила 21%; температура плавления и термической деградации 168 и 283°C; средневесовая молекулярная масса (М_в) 756 кДа. Удлинение при разрыве изготовленной из образца пленки 168%. Количество фибробластов, адгезированных и пролиферирующих на сополимерной пленке данного состава на 7-е сутки культивирования, составило 3,84±0,17×10³ кл/см².

Пример 3. Культивирование штамма-продуцента проводят аналогично Примеру 1. Через 10 ч от начала культивирования с помощью насоса-дозатора в культуру в течение 2 ч подают субстрат-предшественник гамма-бутиролактон в концентрации 2,5 г/л и валерат калия - 2,0 г/л, продолжая культивирование еще 15 ч. Общее время культивирования на первом этапе составляет 25 ч. После отключения подачи азота в культуру культивирование продолжают при подпитке культуры глюкозой в концентрации не ниже 5 г/л еще 10 ч. Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 35 ч. Общий выход полимера 60,0% (к весу сухого вещества клетки). Состав сополимера: 3-гидроксибутират - 39.45; 3-гидроксивалерат - 25.40; 4-гидроксибутират - 34,50 мол. %. Степень кристалличности образца составила 16%; температура свойства и средневесовая молекулярная масса - без существенных изменений (таблица). Удлинение при разрыве изготовленной из образца пленки 259%. Количество фибробластов, адгезированных и пролиферирующих на сополимерной пленке данного состава на 7-е сутки культивирования? составило 3,96±1,12×10³ кл/см².

Пример 4. Культивирование штамма-продуцента проводят аналогично Примерe 1. При этом среда в качестве основного С-субстрата содержит вместо глюкозы олеиновую кислоту в концентрации 10 г/л. Через 10 ч от начала культивирования с помощью насоса-дозатора в культуру в течение 2 ч подают субстрат-предшественник гамма-бутиролактон в концентрации 2,5 г/л и валерат калия - 1,0 г/л, продолжая культивирование еще 15 ч. Общее время культивирования на первом этапе составляет 25 ч. После отключения подачи азота в культуру культивирование продолжают при подпитке культуры олеиновой кислотой при ее текущей концентрации в культуре бактерий не ниже 5 г/л еще 12 ч. Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 37 ч при общем выходе полимера 64,8% (к весу сухого вещества клетки). Состав сополимера: 3-гидроксибутират - 48.30; 3-гидроксивалерат - 16.90; 4-гидроксибутират - 34,80 мол.%. Степень кристалличности образца составила 8%; температура свойства и средневесовая молекулярная масса - без существенных изменений (таблица). Удлинение при разрыве изготовленной из образца пленки 236%. Количество фибробластов, адгезированных и пролиферирующих на сополимерной пленке данного состава на 7-е сутки культивирования, составило 5,36±1,06×10³ кл/см².

Пример 5. Культивирование штамма-продуцента проводят аналогично Примеру 4. Через 10 ч от начала культивирования с помощью насоса-дозатора в культуру в течение 2 ч подают субстрат-предшественник гамма-бутиролактон в концентрации 2,5 г/л и валерат калия - 1,0 г/л, продолжая культивирование еще 5 ч; после этого вносят вторую добавку бутиролактона в культуру в концентрации 1,5 г/л в течение 1 ч, продолжая культивирование еще 6 ч. Общее время культивирования на первом этапе составляет 21 ч. После отключения подачи азота в культуру культивирование продолжают при подпитке культуры олеиновой кислотой при текущей концентрации не ниже 5 г/л еще 15 ч. Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 36 ч. Общий выход полимера 58,7% (к весу сухого вещества клетки). Состав сополимера: 3-гидроксибутират - 25.30; 3-гидроксивалерат - 12.20; 4-гидроксибутират - 62,50 мол.%. Степень кристалличности образца составила 12%; температура свойства и средневесовая молекулярная масса - без существенных изменений (таблица). Удлинение при разрыве изготовленной из образца пленки 318%. Количество фибробластов, адгезированных и пролиферирующих на сополимерной пленке данного состава на 7-е сутки культивирования, составило 5,45±0,66×10³.