СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НАРУШЕНИЙ РУБЦОВОГО ПИЩЕВАРЕНИЯ У ЖВАЧНЫХ

Изобретение относится к ветеринарии и животноводству, касается метода оценки рубцового пищеварения и диагностики его нарушений у жвачных с целью принятия мер для оптимизации кормления, повышения сохранности и продуктивности животных.

Особенностью пищеварения жвачных является способность переваривать со сравнительно высокой эффективностью и в больших объемах клетчатку растительных кормов. Данная способность присуща жвачным благодаря наличию у них многокамерного желудка и жвачного процесса. Наряду с превращением составных компонентов корма в соединения, доступные для усвоения животными, в рубце образуются витамины группы В и К, в количестве, полностью обеспечивающем потребность в них организма. Продукты расщепления растительных белков, небелковых азотосодержащих веществ рациона и поступающей из крови мочевины усваиваются в рубце бактериями и инфузориями. В результате образуется микробный белок, обеспечивающий 20-30% потребности животных в протеине [Алиев А.А. Обмен веществ у жвачных животных. - М: НИЦ «Инженер». - 1997. - 564 с.; Георгиевский В.И. Физиология сельскохозяйственных животных. М.: Агропромиздат, 1990. - 511 с.; Курилов Н.В., Кроткова А.П. Физиология и биохимия пищеварения жвачных. М.: Колос. - 1971. - 432 с.]. Нарушение рубцового пищеварения сопровождается снижением активности процессов деструктуризации компонентов рациона и наращивания микробиологической массы, что негативно отражается на эффективности кормления и уровне продуктивности животных.

От полноценности функций преджелудков в значительной степени зависит здоровье животных. Дисфункции рубца сравнительно широко распространены среди жвачных животных. Они являются наиболее ранними симптомами поражения органов пищеварения, заболеваемость которых составляет в пределах 40% от всех болезней [Иноземцев В.П. Профилактика незаразных болезней основа сохранности животных /Ветеринария. - 2000. - №11. - С. 9-13]. При этом наблюдаются первичное (атония и гипотония рубца, ацидоз и алкалоз рубца и т.п.) и вторичное поражение преджелудков. Вторичные дистонии преджелудков встречаются у 19,5-31,6% коров. В этиологической структуре вторичных дистоний приоритетное значение имели комплексный гипомикроэлементоз (33,8%) и гиповитаминозы А, Б, Ε (29,9%), далее следуют гепатодистрофия (11,7%), ацидоз рубца (10,8%), кетоз (8,2%) и в меньшей мере остеодистрофия (5,6%) [Хмельков Я.Т. Вторичная гипотония рубца и определяющие ее факторы / Я.Т. Хмельков, Е.Г. Яковлева// Бюлл. науч. работ/Белгородская ГСХА. - Вып.3. - Белгород, 2005. - С. 42-46].

Для выявления дисфункций рубца наиболее часто используются физические методы исследования. Осмотром определяют форму живота и степень заполнения голодных ямок. Методом пальпации оценивают чувствительность и напряженность стенки рубца, силу, ритм и частоту его сокращений. Аускультация позволяет определить частоту и фазы сокращения преджелудков. С целью унификации и повышения информативности клинических методов исследования проводят тонометрию рубца и графическую запись его сокращений с помощью различных конструкций руминографов и тонометров [Кумский, Ш.А. Болезни органов пищеварения. - М.: Колос 2006. - 563 с.; Калюжный И.И. Ацидоз рубца. - Саратов, Приволжское книжное издательство. - 1996. - 238 с.].

Однако изменения показателей руминографии, аускультации, пальпации и тонометрии рубца уже являются симптомами болезней преджелудков, указывающие на наличие клинической стадии патологии. Они имеют сравнительно низкую диагностическую ценность на субклинической стадии патологии и ограниченную информативность при оценке механизмов развития болезни.

В клинической практике сравнительно часто проводят исследования рубцового содержимого. При этом диагностическое патофизиологическое значение исследований зависит от спектра определяемых параметров. Наиболее часто определяют цвет, запах, консистенцию, рН содержимого и скорость образования осадка в нем. Наиболее информативным является показатель рН рубцового содержимого.

Известен способ дистанционного контроля рН в рубце у коров специальным устройством, которое включает в себя датчик рН, вводимый в полость рубца, внешнее оборудование, обеспечивающее рентгеноконтрастное изображение рубца [US 6694161 В2; US 10/125,319; опубликован 17.02. 2004]. Данное устройство включает в себя сложное оборудование, ограничивающее применение его в клинической практике.

Известен способ мониторинга рН рубцового содержимого с помощью болюса из диэлектрического материала, который вводится в полость рубца. Датчик, расположенный в болюсе, определяет и передает на приемное устройство электромагнитные параметры рубцового содержимого [US 8694091 B2; PCT/SE 2011/051154; дата публ. 8.04. 2014].

Это способ исследования безопасен и позволяет длительное время контролировать кислотность рубцового содержимого. Однако данное устройство приемлемо в основном для проведения научных исследований, т.к. необходимость специального оборудования ограничивает его использование в клинической практике.

Более широкие возможности у портативного оборудования для получения и анализа рубцовой жидкости, которое позволяет на основании общепринятых параметров выявлять субклинические стадии заболевания крупного и мелкого рогатого скота в полевых условиях. Оборудование включает в себя зевник, набор желудочных зондов, рН-метр и реактивы для настройки его [US 6241688 В1; US 09/142,064; дата публ. 5.06. 2001]. Данное оборудование упрощает процесс отбора проб рубцового содержимого и определения рН, но диагностические возможности его ограничены выявлением только ацидоза или алкалоза рубца.

Способ оценки деструкции волокон корма позволяет оценить функциональные возможности рубцового пищеварения. Данный способ включает в себя этапы отбора проб рубцового содержимого, внесение в него субстрата углеводов и инкубации в герметичном контейнере [US 20090272889 A1; US 12/405,650; опубл. 5.11.2009]. Данный способ значительно расширяет информативность получаемых результатов, позволяющих выявлять ранние стадии нарушения пищеварения в рубце и механизмы их развития. Однако этот способ применим только при проведении научных исследований, т.к. требует наличия специального оборудования и приемлем только при обследовании отдельных животных.

С целью изучения состояния пищеварения в рубце также определяют в его содержимом число бактерий и инфузорий, концентрацию аммиака, общее количество летучих жирных кислот, уксусной, пропионовой и масляной кислот [Профилактика нарушений обмена веществ у сельскохозяйственных животных /Под ред. А.А. Алиева. - М: Агропромиздат, 1986. - 384 с.; Шевелев Н.С., Грушкин А.Г., Тараканов Б.В. Физиологическая роль микробиоты в рубцовом пищеварении /Сельскохозяйственная биология, 2005, №6, С. 9-13]. Определяемые при этом показатели расширяют возможность выявления ранних стадий патологии, механизмов нарушения функций преджелудков и вторичных поражений других органов. Однако необходимость повышения информативности диагностических тестов и углубление знаний патогенеза нарушений рубцового пищеварения определяют потребность в новых методах исследования. Основным направлением поиска новых тестов является отражение процессов, предшествующих изменению рН, активности ферментов и числа микрофлоры.

Известен способ определения в рубцовом содержимом лейкоцитов и/или цитокинов с помощью специфических антител, что позволяет оценивать активность воспаления, проницаемость сосудов стенки рубца и риск развития вторичных поражений, а также выявлять аллергические свойства у кормов и кормовых добавок [WO 2011154924 A1; PCT/IB 2011/052540; дата публ. 15.12.2011]. Однако показатели количества лейкоцитов и активности цитокинов не отражает основные механизмы нарушения рубцового пищеварения, в частности механизма дефаунизации полостей преджелудков. Основной причиной гибели бактерий, дрожжей и инфузорий являются неблагоприятные условия существования или наличие веществ, обладающих цитотоксическим действием. При этом если об изменении среды в рубце можно судить по уровню рН, то тестов оценки токсичности рубцового содержимого в клинической практике нет.

Таким образом, теоретическим обоснованием предлагаемого способа является предположение, что причиной снижения количества бактерий, дрожжей и инфузорий в рубце может быть наличие токсических веществ в рубцовом содержимом. Учитывая, что дефаунизация рубца является постоянным компонентом патогенеза большинства болезней преджелудков, оценка токсичности рубцового содержимого позволит не только уточнить патогенез, но и определить направление лечебных манипуляций.

В качестве прототипа выбран метод определения содержания в крови веществ с молекулярной массой от 500 до 5000 D, условно названной «средней», т.к. молекулярная масса большинства токсинов эндогенного происхождения находится в этом весовом диапазоне. Принцип метода заключается в осаждении высокомолекулярных (>5000 D) соединений раствором кислоты с последующим определением оптической плотности, показатели которой в определенных областях спектра пропорциональны содержанию фракций «средних» молекул [Алехин, Ю.Н. Эндогенные интоксикации у животных и их диагностика (методические рекомендации) / Ю.Н. Алехин - Воронеж, 2000. - 12 с.].

Однако прототип направлен на определение содержания «средних» молекул в крови и не отражает их количество в содержимом рубца, что исключает возможность оценивать токсичность содержимого рубца и выявлять патологии рубцового пищеварения. Помимо этого метод, указанный в прототипе, адаптирован для анализа крови и неизвестно, приемлем ли он для исследования рубцового содержимого.

Изобретение решает задачу разработки способа диагностики нарушений рубцового пищеварения у жвачных животных с достижением технического результата - оценка содержания токсических веществ в рубцовом содержимом.

Для решения поставленной задачи и достижения технического результата в способе диагностики нарушений рубцового пищеварения у жвачных путем фотометрического определения содержания уровня «средних» молекул (ССМ) в организме животного на волнах 237, 254 и 280 нм согласно изобретению ССМ определяют в рубцовом содержимом, оценивают содержание токсических веществ и при наличии ССМ на волне 237 нм более 2,0 усл. ед., на волне 254 нм - более 1,0 усл. ед. и на волне 280 нм - более 1,0 усл. ед. диагностируют возникновение патологии рубцового пищеварения, учитывая, что у клинически здоровых животных данный показатель находится при определении его на волне 237 нм <2,0 усл. ед., на волне 254 нм <1,0 усл. ед., на волне 280 нм <1,0 усл. ед.

Способ позволяет оценить содержание токсических веществ в рубцовом содержимом. Увеличение ССМ используется для ранней диагностики нарушений рубцового пищеварения и наблюдается до появления традиционных симптомов (рН, количество микрофлоры и т.п.), а выраженность изменений ССМ у больных отражает степень тяжести нарушения рубцового пищеварения.

Сущность способа поясняется примерами.

Пример 1. Определение оптимального варианта исследуемого материала и концентрации трихлоруксусной кислоты при исследовании содержания «средних» молекул в рубцовом содержимом.

Объектом исследования были 30 клинически здоровых телят в возрасте 5-6 месяцев, которые содержались в типовом помещении с оптимальными параметрами микроклимата. Животные получали рацион, разработанный в соответствии с нормами кормления, в состав которого входили сено разнотравное 2,0 кг, зерносенаж ячменный 8,0 кг, комбикорм (П63-1) 2,3 кг, патока свекловичная 0,4 кг.

Отбор проб рубцового содержимого проводили с помощью ротопищеводного зонда через 3 часа после очередного кормления. Полученные пробы рубцового содержимого исследовали в течение 2 часов после отбора. Пробу от каждого животного фильтровали через 4 слоя марли и делили на 9 равных частей. №№1, 4 и 7 перед исследованием разбавляли дистиллированной водой в 2 раза, №№2, 5 и 8 разбавляли в 4 раза, №№3, 6 и 9 не разбавляли (исследовали нативный материал). При исследовании проб №№1 и 2 для осаждения белков использовали 9%-ный раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ), для проб №№3 и 4-10%-ный раствор ТХУ, а для №№5 и 6-11%-ный раствор ТХУ. При определении содержания «средних» молекул (ССМ) к 1 мл рубцового содержимого добавляли 0,5 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Через 2 минуты содержимое центрифугировали 15 минут при 3000 об/мин. К 0,5 мл супернатанту добавляли 4,5 мл дистиллированной воды и фотометрировали раствор при длине волны 254 нм против раствора сравнения (1 мл 10% трихлоруксусной кислоты и 29 мл дистиллированной воды).

Полученные результаты представлены в таблице №1, из данных которой видно, что разбавление рубцового содержимого сопровождается снижением ССМ при использовании 9%-ного раствора ТХУ на 44,8%, 10%-ного раствора ТХУ - на 50,0% и в пробе с 11%-ным раствором ТХУ - на 43,4%. Разбавление в 4 раза привело к снижению ССМ в 2,28; 3,58 и 2,52 раза соответственно.

Таким образом, разбавление рубцового содержимого приводит к снижению показателей ССМ, но выраженность этого снижения не соответствует степени разбавления. Поэтому более объективные данные получаются при использовании неразбавленного рубцового содержимого.

Изменение концентрации ТХУ также оказывает влияние на определяемый показатель (см. Табл. 1). Так при исследовании неразбавленных проб коэффициент вариации минимальным оказался при использовании 10%-ного раствора ТХУ, в то время как он возрастал на 1,7 и 1,3% при использовании 9 и 11%-ного раствора соответственно.

Таким образом, изменение концентрации рабочего раствора ТХУ оказывает недостоверное изменение коэффициента вариации ССМ, однако наиболее низкая вариабельность отмечена при использовании 10%-ного раствора ТХУ.

Полученные результаты показали, что наиболее стабильные и объективные показатели ССМ получают при исследовании неразбавленного рубцового содержимого, используя для осаждения белков 10%-ный раствор ТХУ.

Пример 2. Унификация метода определения ССМ и изучение его диагностической информативности.

Используя метод моделирования с помощью специальных рационов, воспроизвели наиболее распространенные варианты нарушения рубцового пищеварения у коров - ацидоз и алкалоз.

Объектом исследования были клинически здоровые коровы красно-пестрой и голштино-фризской породы, из числа которых на 40-50 день лактации были сформированы три группы. Все животные, задействованные в опыте, содержались на привязи в индивидуальных станках. Для каждой группы были разработаны рационы, идентичные по содержанию питательных веществ, витаминов и минералов, но отличающиеся уровнем протеина и углеводов. Животные из группы №1 (контроль, n=100) получали базовый рацион, соответствующий рекомендуемым нормам. Коровам группы №2 (n=30) дополнительно к базовому рациону давали 4 кг свекловичной патоки, а группы №3 (n=30) - 250 г мочевины марки А. Приучение к высокой дозе мочевины осуществляли в течение 15 суток.

В первый день опыта, а также на 7 и 25 день, проводили детальное обследование коров с отбором проб крови и рубцового содержимого. Пробы отбирали через 3 часа после первого (утреннего) кормления. Большую часть проб рубцового содержимого исследовали в нативном виде в течение 2-х часов после отбора, но по 10 образцов из каждой группы консервировали 10%-ным раствором формалина (4 капли на 10 мл содержимого).

Результаты наблюдения за коровами из группы контроля показали, что их клиническое состояние в течение опыта существенно не изменялось. У животных из группы №2 изменения клинического статуса были отмечены только на 25 день опыта, когда у большинства (93,3%) из них отмечали снижение продуктивности на 8,7% (группа №1 - 19,4 кг, №2 - 17,7 кг) и содержания жира в молоке на 19,0% (35,9 и 29,1 г/л). Кроме того, у этих коров наблюдалось снижение аппетита, скрежет зубами и слезотечение. В группе №3 у отдельных животных (10%) в течение первых 7 дней опыта наблюдались поносы и временное снижение аппетита. На 25 день опыта отмечалось снижение продуктивности на 5,1%, а у 16,7% (5 голов) животных наблюдалась мышечная дрожь. У большинства коров имело место учащение пульса (110-160/мин) и дыхания (28-34/мин).

Из данных таблиц №№2 и 3 видно, что в начале опыта у всех задействованных в опыте животных показатели рубцового пищеварения были в пределах нормы.

Животные из группы №1 (Табл. 2 и 3) оставались здоровыми в течение всего опыта, а наблюдаемые изменения показателей рубцового содержимого и крови были обусловлены функциональной нагрузкой на организм коров в период раздоя.

У коров из группы №2 в сравнении с исходным уровнем не отмечены достоверные изменения руминации и состава рубцового содержимого в течение первых 7-ми дней опыта. На 25-й день показатель рН снизился на 1,7 ед., в цвете содержимого усилились оттенки серого (молочного), а запах стал кислым. В сравнении с исходным уровнем возросла скорость седиментации на 90,0%, снизилось количество простейших на 62,1%, а число сокращений рубца в 4 раза.

У животных группы №3 достоверные изменения показателей рубцового пищеварения были отмечены только на 25-й день опыта, когда в сравнении с исходным уровнем рН возросла на 0,9 ед., время седиментации уменьшилось в 2,8 раза, а количество инфузорий - на 39,0%. Цвет содержимого стал более темный, а запах вначале аммиачный, а затем появились гнилостные оттенки. Число жвачных движений во время пережевывания одной жвачки уменьшилось на 27,6%, а руминация ослабла в 2 раза.

Таким образом, используя метод моделирования, были сформированы ацидоз рубца у коров из группы №2 и алкалоз рубца - в группе №3. Характерные для каждого метаболического профиля изменения моторики рубца и свойств его содержимого появлялись в период с 7 по 25 день действия неблагоприятных факторов кормления.

Используя базовый вариант метода определения ССМ (см. Пример 1) на 25-й день опыта, провели оценку динамики ССМ в диапазоне от 200 до 300 нм. Анализ полученных результатов показал, что в интервале от 200 до 233,0±0,28 нм наблюдается высокая вариабельность показателей. Так коэффициент вариабельности (С) у здоровых животных составил 37,2%, у коров с ацидозом рубца - 29,5%, а при алкалозе - 26,8%. Затем у здоровых животных диаграмма формирует относительно стабильные интервалы от 233,7±0,32 до 245,2±0,5 нм (С=10,14%) и от 250,2±0,5 до 285,0±0,025 нм (С=8,07%). У больных с ацидозом и алкалозом имеется только один относительно стабильный интервал (С=6,8%) в диапазоне от 234,9±0,45 до 266,0±0,6 нм.

Таким образом, при исследовании рубцового содержимого наиболее приемлемы замеры ССМ в диапазонах 235-245 и 250-285 нм. Учитывая это, а также для сохранения возможности сравнения показателей крови с рубцовым содержимым следует определять ССМ на длинах волны 237; 254 и 280 нм.

Полученные результаты позволили сформировать оптимальный вариант метода определения ССМ в рубцовом содержимом.

Реактивы: 1) рабочий раствор: 10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты; 2) раствор сравнения: смешать 1 мл рабочего раствора и 29 мл дистиллированной воды.

Материалы для исследования: рубцовое содержимое, которое перед исследованием фильтруют через 4 слоя марли. При отсутствии возможности исследовать в течение 2 часов после отбора, пробы консервируют 10%-ным раствором формалина, добавляя 4 капли на 10 мл профильтрованного содержимого.

Оборудование: центрифуга, спектрофотометр.

Ход определения. В центрифужную пробирку вносят 1 мл рубцового содержимого и 0,5 мл рабочего раствора, перемешивают стеклянной палочкой. Через 2 минуты центрифугируют 15 минут при 3000 об/мин. В чистую пробирку вносят 0,5 мл супернатанта и 4,5 мл дистиллированной воды, перемешивают и фотометрируют. Измеряют экстинцию на длинных волн 237, 254 и 280 нм в кювете с толщиной слоя 1 см против раствора сравнения.

Результаты исследования ССМ в сыворотки крови и рубцовом содержимом представлены в таблице №3, из данных которой видно, что у контрольных животных в течение опыта достоверных отклонений ССМ в крови и рубцовом содержимом не было.

У коров из группы №2 ССМ в рубцовом содержимом на длине волны 237 нм увеличилось на 7 день опыта в 2,7 раза, а на 25 день - в 3,0 раза. На длине волны 254 нм в указанные дни опыта рост показателей составил 46,8 и 82,4%, а на 280 нм - 21,0 и 34,8%. В группе №3 при анализе на длине волны 237 нм ССМ у животных возросло через 7 дней в 3,9 раза, а через 25 день - в 4,1 раза. При определении показателя на длине волны 254 нм, он увеличился на 43,6% и в 1,6 раза, а на 280 нм - на 43,5 и 64,6%.

В сыворотке крови достоверное увеличение ССМ на 7 день опыта были отмечены только на длине волны 254 нм. На 25 день у коров из группы №2 ССМ увеличилось на длине волны 237 нм в 2,2 раза, 254 нм - на 43,4% и 280 нм - на 23,7%. У животных из группы №3 аналогичные показатели возросли в 2,3 раза, на 40,5 и 30,9% соответственно.

Сравнительные исследования нативного и консервированного рубцового содержимого показали, что внесение раствора формалина не оказывает достоверного влияния на определяемые показатели. Исключение составляет ССМ, которое в консервированной пробе в среднем увеличивается на 0,08±0,011 (-0,05÷0,22) усл. ед. При этом наиболее выраженное влияние консерванта отмечено при использовании длины волны 237 и 280 нм. Однако отмеченное влияние формалина близко к диапазону индивидуальной вариации ССМ у животных (5-12% или 0,08-0,150 усл. ед.), что дает основание игнорировать влияние консерванта на данный показатель.

Расчет референсного интервала ССМ в рубцовом содержимом у здоровых животных проводились с использованием программы Reference Value Advisor на базе Microsoft Excel [Geffre A., Concordet D., Braun J.P., Trumel C. Reference Value Advisor: a new freeware set of macro instructions to calculate reference intervals with Microsoft Excel, Vet Clin Pathol. 2011 40(1) 107-112]. Полученные результаты показали, что референсный интервал здоровых животных (n=100) ССМ при определении на длине волны 237 нм составляет 0,5-2,0 усл. ед., 254 нм 0,3-1,0 усл. ед. и 280 нм 0,25-1,0 усл. ед.

Таким образом, нормальными величинами ССМ в рубцовом содержимом следует считать: при длине волны 237 нм - <2,0; при 254 и 280 нм - <1,0 усл. ед. (условные единицы оптической плотности).

Степень связи показателя ССМ в рубцовом содержимом с нарушением метаболического профиля в рубце оценивали на основании показателя достоверности связи методом хи-квадрат (χ²) [Хамитов Г.П., Ведерникова Т.И. Вероятности и статистика, Иркутск: БГУЭП, 2006. - 272 с.]. Информативность показателей ССМ как теста ранней диагностики оценивали результатами сопоставления его уровня на 7 день опыта и частотой нарушений рубцового пищеварения в конце опыта (Табл. 4). Полученные при этом результаты показали, что на ранних этапах развития ацидоза и алкалоза (7 день опыта), когда отсутствуют достоверные отклонения традиционных показателей рубцового пищеварения, уже имеются достоверные отклонения ССМ. Так значения χ² на длине волны 237 нм составил 124,8, а коэффициент детерминации (r_d) - 0,77 (Ρ0,001). При определении ССМ на 254 нм указанные параметры составили 90,0 и 0,49, а на 280 нм - 65,7 и 0,4 (Р0,001).

Это указывает на то, что между уровнем СММ в рубцовом содержимом у жвачных животных и нарушениями метаболического профиля в рубце имеется достоверная корреляционная связь при использовании длины волны 237 нм сильной, а при 254 и 280 нм - средней степени выраженности. Доля влияния увеличения ССМ на длине волны 237 нм (выше 2,0 усл. ед.), 254 нм (выше 1,0 усл. ед.) и 280 нм (выше 1,0 усл. ед.) на нарушение рубцового пищеварения составляет соответственно 77,0; 49,0 и 40,0%, что позволяет расценивать его как достоверный показатель ранней диагностики с высоким уровнем прогностического значения.

ССМ, определяемое на длине волны 237 нм, превышает норму у 94,0% животных с выраженными симптомами ацидоза и алкалоза (25 день опыта), а коэффициент корреляции (r) с изменениями рН составил 0,88. На длине волны 254 нм эти показатели составили при 254 нм - 85,0% и 0,5, а на 280 нм - 72,5% и 0,46.

Таким образом, новый способ диагностики нарушений рубцового пищеварения у жвачных животных характеризуется сравнительно высокой прогностической и диагностической информативностью. Его применение позволяет выявлять нарушения рубцового пищеварения на ранних стадиях их развития, что является основанием для проведения корректировки рациона кормления или превентивной терапии, которая является более эффективной и экономически менее затратной. Применение данного теста также позволяет оценивать тяжесть метаболических нарушений в рубце, что является основанием для определения тактики лечения и оценки ее эффективности.