Результат интеллектуальной деятельности: КОНЦЕНТРИРОВАННЫЙ СОСТАВ ДЛЯ ОБРАБОТКИ СЕМЯН И ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА РАСТЕНИЙ ПРОТИВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ И ГРИБКОВЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Изобретение относится к области сельского хозяйства и представляет собой состав для защиты растений от бактериальных и грибковых болезней путем предпосевной обработки семян овощных культур: томаты, капуста, морковь, редис, тыква; зерновых культур, а также посадочного материала (клубни картофеля и декоративных культур).

В настоящее время имеется широкий арсенал высокоэффективных химических средств для предпосевной обработки семян против болезней, которые нередко являются экологически опасными, например тетраметилтиурамдисульфид - ТМТД. [Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов разрешенных к применению на территории РФ. - М. 2006 г. С. 131, 132, 134]. Для безопасности человека и окружающей среды необходимо создание малотоксичных препаратов. С целью снижения концентрации биоцида созданы композиции, сочетающие токсичные биоциды с нетоксичными водорастворимыми полимерами (карбоксиметилцеллюлозой, поливинилпирролидоном, сополимерами N-винилпирролидона) [Лебединцева О.В., Тютерев С.Л. Стратегия и тактика использования защитно-стимулирующих составов для обработки семян сельскохозяйственных культур. Агрохимия, 1994, №10, С. 67-80.; С.Ш. Рашидова и др. Водорастворимые полимеры для семеноведения. Тезисы докладов III Всесоюзной конференции. Иркутск, 1987, С. 165]. Основной недостаток таких композиций - это высокотоксичные свойства биоцидов, входящих в их состав. Экологически безвредными препаратами, способными конкурировать с пестицидами, могут быть синтетические полимеры с собственной биологической активностью, например, полимерный препарат Катапол, представляющий собой соль сополимера N-винилпирролидона и кротоновой кислоты с диметилбензилалкиламмонием [Афиногенов Г.Е., Панарин Е.Ф. Антимикробные полимеры, Санкт-Петербург: Гиппократ, 1993, 263 с.]. В патенте РФ №2133568 подтверждено эффективное действие Катапола для предпосевной обработки семян [Панарин Е.Ф., Кочеткова И.С., Тютерев С.Л., Лебединцева О.В., Выцкий В.А. Способ предпосевной обработки семян. Патент РФ №2133568, 1999]. Катапол эффективно действует на возбудителей болезней, находящихся на поверхности семян сельскохозяйственных культур и клубней картофеля, но из-за ограниченной способности поверхностно-активного полимера проникать внутрь семян препарат недостаточно эффективен против внутрисемейной бактериальной инфекции.

Известен состав [Патент РФ №2342833, 2009], содержащий, в мас.%:

Однако этот состав не является концентрированным, а представляет собой водный раствор и, несмотря на приемлемую эффективность против фитопатогенов, имеет существенные и очевидные недостатки:

1. Не удобен для широкого использования. Из-за слабой растворимости фурацилина препарат представляет собой готовый к применению рабочий раствор, с высоким содержанием воды до 99,6%, где концентрация катапола составляет 0,05-0,2%, а фурацилина 0,005-0,015%, что экономически не целесообразно для широкого внедрения в практику, а также при транспортировке препарата на большие расстояния, так как требует больших объемов.

2. Состав стабилен только при низкой концентрации входящих в него компонентов, а при более высоких выпадает в осадок.

3. Состав имеет малые сроки хранения (до 6 месяцев), так как фурацилин в водных растворах постепенно выпадает в осадок и состав теряет свои биологические (антибактериальные) свойства.

4. Состав недостаточно активен в отношении возбудителей грибковых болезней и устойчивых форм бактерий.

Концентрированные составы на основе катапола и фурацилина до сих пор не могли быть созданы из-за слабой растворимости фурацилина в водных растворах.

Технической задачей и положительным результатом предлагаемого изобретения является разработка концентрированного состава: стабильного в процессе длительного хранения, обладающего повышенной бактерицидной и фунгицидной активностью, и экономически выгодного для применения против широкого круга возбудителей грибковых и бактериальных болезней, включая устойчивые к фурацилину и катаполу формы бактерий.

Задача решается путем перехода от водного раствора состава к полимерному на основе полиэтиленгликоля-400 и подбором необходимого соотношения компонентов: фурацилина и катапола. Состав является концентрированной полимерной формой при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Концентрированный состав представляет собой вязкий раствор лимонно-желтого цвета, водорастворим и обладает пленкообразующей способностью, имеет слабокислую реакцию (pH 6.0). Стабилен в процессе длительного хранения, обладает повышенной бактерицидной и фунгицидной активностью против широкого круга возбудителей болезней, включая устойчивые к фурацилину бактерии. В форме рабочих растворов не фитотоксичен.

Компоненты состава и свойства:

Катапол - антисептик широкого спектра действия, разрешенный к применению в медицине, ветеринарии, птицеводстве и пищевой промышленности [Афиногенов Г.Е., Панарин Е.Ф. Антимикробные полимеры, Санкт-Петербург: Гиппократ, 1993, 263 с.].

Полиэтиленгликоль-400 (ПЭГ-400), общая формула НО(C₂H₄O)_nH - представляет собой нейтральную, вязкую, бесцветную, прозрачную, умеренно гигроскопичную жидкость физиологически индифферентную. ПЭГ-400 широко используется для повышения растворимости действующих веществ, для улучшения препаративной формы и повышения эффективности [Кондратьева Т.С, Иванова Л.А., Зеликсон Ю.И., Куприна Н.А., Денисова Т.В. Технология лекарственных форм, М. «Медицина», 1991, С. 214].

Полиэтиленгликоль-400 входит в состав стимуляторов роста, таких как «Марс-У» и «Марс-I», Ноостим, способствуя лучшему проникновению в клетки растений компонентов средств защиты, применяемых для обработки семян и растений различных сельхозкультур [Пестициды и агрохимикаты Украины: Практический справочник для специалистов сельского хозяйства. Днепропетровск: Арт-Пресс, 2006. 319 с.].

В процессе разработки концентрированного состава для увеличения растворимости фурацилина использовали ПЭГ-400; в 26,0% растворе которого растворимость фурацилина в 25 раз больше, чем в воде [Кондратьева Т.С, Иванова Л.А., Зеликсон Ю.И., Куприна Н.А., Денисова Т.В. Технология лекарственных форм, М. «Медицина», 1991, С. 214].

Фурацилин (семикарбазон 5-нитрофурфурола) - синтетическое соединение, подавляющее грамотрицательные и грамположительные бактерии за счет ингибирования деления их клеток. Препарат мало растворим в воде, быстро разлагается на свету [Красильников А.П., «Справочник по антисептикам», Минск, «Высшая школа», 1995, С. 126].

Диметилсульфоксид (ДМСО) - используется в качестве агента, повышающего проникающую способность препаратов в растительные ткани [Афиногенов Г.Е., Панарин Е.Ф. Антимикробные полимеры, СПб.: Гиппократ, 1993, 263 с.].

Изобретательский уровень предлагаемой концентрированной формы состава определяется тем, что включение ПЭГ-400 приводит к сохранению стабильности, повышению концентрации действующих веществ и к усилению антимикробной активности состава благодаря подобранному соотношению компонентов и проявления синергизма. Способ получения состава:

Концентрированный состав, включает: катапол, фурацилин, полиэтиленгликоль-400 (ПЭГ-400), диметилсульфоксид, вода. Состав получают путем соединения всех компонентов с добавлением воды в указанных ниже соотношениях и перемешивания при комнатной температуре в течение 5-6 часов.

В результате получают концентрированный состав компонента, благодаря способности ПЭГ увеличивать растворимость действующих веществ, отличается высоким количественным содержанием компонентов, катапола и фурацилина - до 0,9%. и низким содержанием воды 6-8%. Состав стабилен, инградиенты состава не выпадают в осадок, и неютеряет своей бактерицидной и фунгицидной активности в течение длительного срока хранения (1,5 года) в отличие от водных растворов базового объекта [Патент РФ №2342833, 2009], срок хранения которых не превышает 6 месяцев.

Концентрированный состав и подобранное соотношение компонентов определяют его свойства, представлены в следующих примерах.

Пример 1. Концентрированный состав, содержащий 1 г фурацилина, 10 г 10% водного раствора катапола, 88,1 г ПЭГ-400, 0,9 г ДМСО. Состав не стабилен. В течение 2-х суток хранения появляется осадок, таблица 1.

Пример 2, 3 и 4. Составы содержат те же компоненты, что в примере 1, но при следующих концентрациях: фурацилина 0,9 г и 0,45 г; катапола 0,9 г и 0,45 г соответственно. Составы сохраняют стабильность и соответственно биологическую активность в течение 1,5 года хранения, о чем свидетельствуют данные таблицы 1.

Содержание фурацилина в составах определяли спектрофотометрически [Полюдек-Фабини Р., Бейрих Т. Органический анализ. Ленинград: Химия, 1981, 243 с.].

Таким образом, верхние границы содержания компонентов состава: катапол - 0,9% и фурацилин - 0,9% определяют стабильность состава при длительном хранении. При превышении состав становится нестабильным.

Ниже нижних границ содержания фурацилина и катапола - 0,45% (0,45 г катапола, 0,45 г фурацилина, 89 г ПЭГ-400, 0,9 г ДМСО, вода до 100 г) в составе экономически нецелесообразно.

Концентрированный состав, стабильный в указанных границах (примерах 2, 3, 4) в процессе хранения характеризуется высокой биоцидной активностью. Повышенное антимикробное действие заявленного концентрированного состава основано на следующих механизмах:

- на экспериментально установленной способности ПЭГ-400 усиливать антимикробную активность катапола и фурацилина;

- присутствие ПЭГ-400 в составе способствует увеличению чувствительности тех бактерий, которые устойчивы к действию катапола и фурацилина;

- повышенным содержанием фурацилина в концентрированном составе и в рабочих растворах благодаря способности ПЭГ-400 солюбилизировать фурацилин;

- пролонгированностью биологического действия вследствие постепенного выхода фурацилина из полимерного препарата;

- синергизме - суммарный антимикробный эффект рабочих растворов заявленного состава превышает биологическую активность, проявляемую отдельно каждым входящих в него компонентом (катапол, фурацилин);

- состав стабилен, не теряет своей биоцидной активности в течение длительного срока хранения (срок наблюдения заявленного состава составил 1,5 года).

Пример 5. Представлены данные влияния ПЭГ-400 на антимикробную активность фурацилина.

В серии экспериментов установлено, что сам ПЭГ-400 как растворитель не обладает биологической активностью, а высокая антимикробная активность фурацилина в ПЭГ-400 сохраняется в течение 1,5 года хранения состава, таблица 2.

Положительные биоцидные свойства концентрированного состава раскрываются на примерах оценки антибактериальной и фунгицидной активности его рабочих растворов.

Несмотря на то, что полезные свойства отдельных компонентов заявленной концентрированной формы были известны, биологический эффект при их соединении безусловно, был заранее непредсказуем, так как не исключено химическое взаимодействие компонентов с потерей их активности.

Оценка прямой биоцидной активности заявленного состава проведена методом in vitro на 4-х тест-бактериях и 6-ти тест-грибах - патогенов растений, вызывающих наиболее вредоносные заболевания сельскохозяйственных культур [Методические указания по государственным испытаниям фунгицидов, антибиотиков и протравителей семян сельскохозяйственных культур». М., 1985, 130 с.]. Тест-патогены получены из коллекций типовых культур ВИЗР и ВНИИСХМ.

Ниже представлены примеры конкретной реализации антибактериальной и антигрибной активности рабочих растворов заявленного концентрированного состава по способности подавлять рост тест-культур бактерий и грибов, вызывающих вредоносные заболевания сельскохозяйственных культур:

Bacillus polymyxa (Prazmowski 1880) Mace 1989 - бактериальная гниль клубней картофеля;

Clavibacter michiganensis - бактериальный рак томатов;

Erwinia carotovora - черная ножка картофеля, бактериозы капусты, мягкая гниль тыквы, моркови, редиса, томата и др.;

Pseudomonas fluorescens - бактериальная гниль клубней картофеля и других овощных культур.

Грибы рода Fusarium - возбудители болезней зерновых культур: Fusa-rium culmorum, Fusarium graminearum, Bipolaris sorokiniana, Rhizoctomia solani;

Fusarium oxysporum - возбудитель фузариозного увядания томатов;

Botrytis cinerea Pers - серая гниль корнеплодов.

Изучение спектра биологической активности композиций проведено стандартными методами в соответствии с «Методическими указаниями по государственным испытаниям фунгицидов, антибиотиков и протравителей семян сельскохозяйственных культур» [М., 1985, 130 с.]. Бактерицидную активность определяли в опыте in vitro, стандартным методом, по тесту задержки роста микроорганизмов вокруг лунок, в которые помещались тестируемые растворы. Для каждого рабочего раствора измеряли радиус подавления роста тест-бактерии в мм от края лунки после 24-часовой выдержки в термостате при 28°C. Измерение диаметров грибных колоний проводили на 2-е, 5-е, и 10-е сутки культивирования. Торможение роста колоний гриба по сравнению с контролем рассчитывали по формуле Эббота в %.

Пример 6. Представленные в примере результаты изучения действия ПЭГ на антагонистическую активность фурацилина по отношению к тест-культурам показали, что ПЭГ повышает его антагонистическую активность против бактерий. Так, радиус ингибирования роста бактерии C1. Michiganensis 0,05% фурацилином увеличился с 2 мм до 4,5 мм при повышении концентрации ПЭГ с 5% до 25,0%, таблица 3. Введение в раствор ПЭГ 5% усиливает антимикробную активность фурацилина в 1,2-2 раза, составы под №4 и №5.

Пример 7. В результате влияния ПЭГ-400 на биологическую активность катапола установлено, что ПЭГ-400 также усиливает его антибактериальную активность, таблица 4. Включение 2-10% ПЭГ-400 в состав катапола повышает антимикробную активность его по отношению к бактерии Bacillus polymixa в 3-4 раза.

Таким образом, в результате изучения действия ПЭГ на антибактериальную активность катапола и фурацилина выявлена определенная закономерность. Установлено, что добавление ПЭГ к катаполу и фурацилину усиливает их антибактериальную активность и способствует увеличению чувствительности тех бактерий, которые более устойчивы к действию этих компонентов. Таким образом, бактерии исходно резистентные к фурацилину и катаполу становятся чувствительными к ним в присутствии ПЭГ-400.

Пример 8. Для проведения сравнительной оценки антибактериальной активности концентрированного состава и базового объекта были проведены специальные опыты. Положительное влияние ПЭГ-400 на антибактериальную активность концентрированного состава на примерах сравнения антимикробной активности рабочих растворов базового объекта с рабочими растворами концентрированного состава путем разведения водой, и содержащих одинаковое количество компонентов (катапола и фурацилина), представлены в таблице 5.

При сравнении антимикробной активности рабочих растворов, полученных из концентрированного состава и содержащих ПЭГ, с растворами базового объекта, установлено, что ПЭГ-400, не только не уменьшает биологическую активность растворов, а даже усиливает их антибактериальные свойства. Например, радиус подавления роста бактерии Cl. Michiganensis, характеризующий антимикробную активность состава под №7* как базового объекта, составляет 9,5 мм, а для такого же состава 8, полученного из концентрированного состава, он равен 10,5 мм, таблица 5.

Для понимания сущности изобретения создана серия рабочих растворов путем разведения концентрированного состава водой в 4-10 раз и проведена оценка полученных рабочих составов на бактерицидную и фунгицидную активность.

Пример 9. Показывает высокую антибактериальную активность рабочих растворов концентрированного состава по отношению к бактериям Erwinia carotovora и Cl. michiganensis. Причем антибактериальная активность составов превышает активность каждого из компонентов в отдельности, что свидетельствует о проявлении синергизма. Так ингибирующая активность состава 1 по отношению к Erwinia carotovora составляет 12 мм и превышает сумму активностей катапола 0,1% - 2,5 мм и 0,1% фурацилина - 7,0 мм на 2,5 мм, таблица 6.

Пример 10. Демонстрирует антимикробную активность рабочих растворов концентрированного состава по отношению к бактериям Bacillus polymixa и Pseudomonas fluorescens 1571, таблица 7. Результаты изучения свидетельствуют о том, что наибольшей бактерицидной активностью обладают также составы 0 и 1. Антимикробная активность этих составов по отношению к этой бактерии превышает активность каждого из компонентов в отдельности (катапол и фурацилин), что подтверждает синергизм их действия. Так, в составе 1, радиус ингибирования отдельно у катапола и фурацилина в сумме составляет 5,0 мм + 6,0 мм = 11 мм, на 2 мм меньше по сравнению с их композицией - 13 мм.

Пример 11. В примере представлены данные специального опыта по сравнительной оценке фунгицидной активности рабочих растворов, полученных из концентрированного состава, с рабочими растворами базового объекта. Оценка была проведена методом лунок, который позволяет испытывать разведенные рабочие растворы [Билай В.И. Методы экспериментальной микологии, Наукова думка, 1982, с. 275], таблица 8.

Установлено, что фунгицидная активность рабочих растворов, полученных из концентрированного состава (составы Д и Б), по способности сдерживать рост мицелия тест-грибов на порядок превышает активность рабочих растворов базового объекта, таблица 8.

Пример 12. Демонстрирует фунгицидную активность рабочих растворов из концентрированного состава по отношению к грибу Fusarium oxysporum. Составы 1 и 3 сдерживают рост гриба на 68,8-100% на 10 сутки культивирования, таблица 9.

Пример 13. Показывает высокую фунгицидную активность рабочих растворов концентрированного состава 0,1 и 3 по отношению к грибу F. culmorum, вызывающему фузариозную корневую гниль пшеницы, ячменя, таблица 6. На 10-е сутки культивирования составы 0, 1, 3 ингибируют рост мицелия гриба на 83,5-100%, таблица 10.

Пример 14. Свидетельствует также о высокой фунгицидной активности рабочих растворов концентрированного состава 0,1 и 3 по отношению к грибу F. grameniarum, возбудителю корневой гнили зерновых культур. Заявленные составы 0, 1 полностью подавляют рост мицелия гриба в течение 5 суток культивирования, а на 10-е сутки сдерживают рост гриба на 91,1-100%. Фунгицидная активность состава на 10-е сутки составляет 82,3%, таблица 11.

Пример 15. Показывает, что рабочие растворы концентрированного состава эффективно подавляют мицелиальный рост гриба Bipolaris sorokiniana, вызывающего гельминтоспориозную корневую гниль пшеницы. Исследуемые составы 0, 1, 3 в диапазоне концентраций 0,05-0,2% для катапола и 0,05-0,2% для фурацилина ингибирует рост гриба на 80,0-100% на 10-е сутки культивирования, таблица 12.

Пример 16. Данные эксперимента, представленные в таблице свидетельствуют о высокой биоцидной активности рабочих растворов концентрированного состава по отношению к грибу Botrytis cinerea, которые в концентрации катапола от 0,05 до 0,2% и фурацилина - 0,05-0,2% подавляет рост мицелия гриба на 86,7-100% (составы 0, 1, 3) в течение 10 суток культивирования, таблица 13.

Пример 17. Демонстрирует высокую фунгицидную активность концентрированного состава по отношению к грибу R. solani. Составы 0, 1 и 3 с концентрацией катапола 0,05 до 0,2% и содержанием фурацилина 0,05-0,2% сдерживают рост мицелия гриба на 86,0-100% в течение 10 суток культивирования гриба, таблица 14.

Пример 18. Показывает, что высокая биоцидная активность концентрированного состава сохраняется в течение 1,5 лет хранения, таблица 15. Концентрированный состав хранили в течение 1,5 года, а затем провели сравнительную оценку антибактериальной активности рабочих растворов до и после хранения концентрированного состава.

Концентрированный состав на основе фурацилина и катапола и ПЭГ-400 для предпосевной обработки семян и посадочного материала растений обеспечивает высокий защитный эффект против широкого круга грибковых и бактериальных болезней, включая устойчивые формы к действию этих компонентов.

Состав стабилен и обладает усиленной антибактериальной, фунгицидной активностью и сохраняет ее при длительном хранении. Экономически выгоден при применении, транспортировки и хранении. Биологическая эффективность рабочего раствора концентрированного состава значительно превышает на 10-100% эффективность базового состава - рабочего раствора на основе фурацилина и катапола в зависимости от возбудителей болезней.

Литература

1. Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов разрешенных к применению на территории РФ. - М. 2006 г. С. 131, 132, 134;

2. Лебединцева О.В., Тютерев С.Л. Стратегия и тактика использования защитно-стимулирующих составов для обработки семян сельскохозяйственных культур. Агрохимия, 1994, №10, С. 67-80.

3. С.Ш. Рашидова и др. Водорастворимые полимеры для семеноведения. Тезисы докладов III Всесоюзной конференции. Иркутск, 1987, С. 165.

4. Афиногенов Г.Е., Панарин Е.Ф. Антимикробные полимеры, Санкт-Петербург: Гиппократ, 1993, 263 с.

5. Панарин Е.Ф., Кочеткова И.С., Тютерев С.Л., Лебединцева О.В., Выцкий В.А. Способ предпосевной обработки семян. Патент РФ №2133568, 1999.

6. Тютерев С.Л., Панарин Е.Ф., Попова Э.В, Кочеткова И.С, Азанова В.В., Воробьев Н.И. Состав для предпосевной обработки семян овощных культур и клубней картофеля от бактериальных болезней. Патент РФ №2342833, 2009.

7. Кондратьева Т.С, Иванова Л.А., Ю.И. Зеликсон, Н.А. Куприна, Т.В. Денисова. Технология лекарственных форм. М. «Медицина», 1991, С. 214.

8. Пестициды и агрохимикаты Украины: Практический справочник для специалистов сельского хозяйства. Днепропетровск: Арт-Пресс, 2006. 319 с.

9. Красильников А.П. «Справочник по антисептикам», Минск, «Высшая школа», 1995, С. 126.

10. Полюдек-Фабини Р., Бейрих Т. Органический анализ, Ленинград: Химия, 1981, 243 с.

11. Методические указания по государственным испытаниям фунгицидов, антибиотиков и протравителей семян сельскохозяйственных культур. М., 1985, 130 с.

12. Билай В.И. Методы экспериментальной микологии. Наукова думка, 1982, С. 275.