СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПИГМЕНТА-МЕЛАНИНА ИЗ БАЗИДИОСПОР ТРУТОВЫХ ГРИБОВ

Предлагаемое изобретение относится к пищевой, легкой и фармацевтической промышленности и может быть использовано в производстве безалкогольных и кондитерских изделий, а также при производстве БАД и лекарственных средств.

Известен способ получения водорастворимого меланина из виноградных выжимок /Патент СССР №939446. C07G 17/00, 1982 г./, включающий предварительную обработку спиртом и ультразвуком, экстракцию измельченного сырья, очистку экстракта от взвесей центрифугированием и удаление экстрагента выпариванием до получения сухого продукта.

Известен способ получения меланина /Международная заявка № WO 2009IN00703, С12Р 21/06 2010 г./ из штамма гриба Gliocephalotrichum симплексной МТСС No:5489 путем выращивания грибов в среде культуры, уборки клеток питательной среды, извлечения и очистки меланина от питательной среды и грибковых биомасс.

Известен способ получения меланина /Патент Украины №82960 А61К 36/06; С07К 5/00, 2008 г./, предусматривающий использование гриба чага как производителя. Включает посев на пивное сусло, культивацию и стимуляцию роста. При подготовке посева для стимуляции роста грибок облучают красным светом (длина волны составляет 660 Нм) в дозе 230 МДж/см², с последующей гомогенизацией. После глубинного культивирования гриб облучают голубым светом (длина волны 488 нм) за весь период брожения.

Ближайшим аналогом является способ получения меланина из различных трутовых грибов (Сушинская Н.В., Кукулянская Т.А., Курченко В.П., Шостак Л.М. Физико-химические свойства и получение меланинов из базидиомицетов // Труды БГТУ. Cep.IV. - 2004. - Вып. XII. - С.193-197). Плодовые тела грибов, а также вегетативные формы чаги (наросты) измельчали до размеров 0,5-2 мм и сушили при температуре 40-45°С до постоянной массы. Для удаления липидов измельченное сырье обрабатывали смесью гексан-изопропанол (1:1) при соотношении субстрат - растворитель 1:10 в течение 24 ч и фильтровали через капроновую мембрану. Остатки смеси растворителей удаляли на роторном испарителе при температуре 30°С. Меланины экстрагировали из обезжиренного сырья 0,1 N NaOH при 45-50°С в течение 2 ч. Твердый остаток отделяли фильтрованием через капроновую мембрану. Полученный фильтрат подкисляли 1N HCl до рН 1,5, в результате чего меланин образовывал хлопьевидный осадок, который отделяли центрифугированием в течение 15 мин при 10000 g и растворяли в 0,1 N NaOH. Процедуру кислотного переосаждения проводили трижды, после чего полученный пигмент растворяли в 0,01 N NaOH и диализовали против воды до нейтральной pH. Полученный препарат сушили на лиофильной установке (Сушинская, 2004).

Недостатком известных способов является ограниченность высококачественного сырья (трутовых грибов) и невысокий выход пигмента (из гриба F. fomentarius выход пигмента составляет 7-8%).

Задачей предлагаемого изобретения является создание способа получения коричневого пигмента из доступного сырья - трутовиков, в частности, трутовика настоящего (Fomes fomentarius (Fr.)), с максимальным выходом пигмента при использовании жуков-грибоедов.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения пигмента меланина из базидиоспор трутовых грибов, включающего измельчение плодовых тел трутовика настоящего, экстракцию, осаждение меланина, разделение фаз фильтрацией, предварительно плодовые тела трутовых грибов заселяют жуками-грибоедами для предобработки на 20-30 дней, полученную массу обрабатывают этиловым спиртом, с последующим отделением спиртового экстракта центрифугированием и кипячением полученного при этом осадка с водой при массовом соотношении 1:20 в течение 2-х часов.

Используя прием биологического освобождения меланина из трутовых грибов жуками-грибоедами можно повысить концентрацию пигмента в субстрате. Жуки-грибоеды относятся к семейству Mycetophagidae. Жуки и их личинки преимущественно мицетофаги. Развиваются в лесной подстилке, гнилой древесине, в плодовых телах трутовых грибов. Мировая фауна включает более 20 родов и свыше 200 видов. Около 10 родов и 50 видов свойственно Северной Палеарктике. В фауне Восточной Сибири отмечено два вида, близких по эколого-биологическим особенностям / Плешанова Г.И., Плешанов А.С. Практический определитель синантропных насекомых Восточной Сибири, Иркутск, 2006. Изд-во Института географии СО РАН, 2006, - 72 с./.

Способ осуществляется следующим образом

В качестве сырья используют трутовики, в частности трутовик настоящий F. fomentarius (трутовик настоящий как наиболее часто встречающийся в сибирских лесах). Трутовики используются после переработки (питания) жуками-грибоедами (Mycetophagus ischischerini Rit). Жуки-грибоеды, поедая мицелий в плодовом теле трутовика, не используют базидиоспоры, находящиеся в коричневом гименофоре, в то же время разрыхляют его. В гименофоре грибов и базидиоспорах сосредоточено наибольшее количество пигмента меланина. Перерабатывая мицелий и разрыхляя гименофор, жуки-грибоеды высвобождают пигмент из внутренних структур плодового тела. Находящийся меланин в мицелии плодового тела также не усваивается жуками и сосредотачивается в экскрементах, тем самым увеличивает общую концентрацию пигмента. В итоге после переработки плодовых тел трутовика жуками-грибоедами получается сыпучий коричневый порошок, состоящий из мелких фрагментов мицелия, гименофора, базидиоспор и зерноподобных экскрементов жуков-грибоедов. Обогащенный меланином порошок после обработки этиловым спиртом и горячей водой экстрагируют раствором щелочи. Экстракт обрабатывают соляной кислотой. Пигмент меланин после переосаждения очищают методом диализа в постоянно меняющемся потоке в течение 48 часов и сушат. Очищенный препарат пигмент меланин по внешнему виду порошок темно-коричневого цвета без вкуса и запаха. Предельная растворимость в воде составляет 95%. Он растворим также в слабощелочном растворе и не растворим в органических растворителях.

Пример 1. Получение меланина без предварительной обработки.

Берут навеску измельченных плодовых тел трутовика настоящего, например 20 г, и в течение 5 часов обрабатывают 200 мл этилового спирта. Спиртовой экстракт отделяют центрифугированием. Осадок кипятят при соотношении 1:20 исходного субстрата - воды в течение 2 часов. После центрифугирования осадок экстрагируют 0,5 N раствором NaOH в течение 24 часов при температуре 25-28°С. Щелочной экстракт обрабатывают соляной кислотой. Осадок после центрифугирования растворяют 0,1 N раствором NaOH. Переосаждение соляной кислотой проводят трижды, после чего раствор нейтрализуют до рН 7,0, диализуют в постоянно меняющемся потоке воды в течение 48 часов. Выход пигмента-биополимера составляет 1,58 г из 20 г трутовиков или 7,9%. Концентрация парамагнитных центров (ПМЦ) - 3,6·1016 спин/г.

Пример 2. Получение меланина с предварительной обработкой плодовых тел с признаками заселения жуками-грибоедами (из плодовых тел высыпаются мелкие фрагменты и экскременты жуков) и целых без признаков заселения, помещают в картонные или стеклянные контейнеры на 20-30 дней. Жуки, питаясь, разрушают плодовые тела с образованием порошкообразной сыпучей массы коричневого цвета, состоящей из мелких фрагментов мицелия, гименофора, базидиоспор и экскрементов жуков-грибоедов. Полученную массу, из расчета 20 г, течение 5 часов обрабатывают 200 мл этилового спирта. Спиртовой экстракт отделяют центрифугированием. Осадок кипятят при соотношении 1:20 исходного субстрата - воды в течение 2 часов. После центрифугирования осадок экстрагируют 0,5 N раствором NaOH в течение 24 часов при температуре 25-28°С. Щелочной экстракт обрабатывают соляной кислотой. Осадок после центрифугирования растворяют 0,1 N раствором NaOH. Переосаждение соляной кислотой проводят трижды, после чего раствор нейтрализуют до рН 7,0, диализуют в постоянно меняющемся потоке воды в течение 48 часов. Выход пигмента-биополимера составляет 2,65 г из 20 г порошкообразной массы трутовиков или 13,25%. Концентрация парамагнитных центров (ПМЦ) - 5,1·1017 спин/г.

Инфракрасные (ИК-) спектры меланина из трутовиков зарегистрированы по стандартной методике (суспензия в вазелиновом масле) на Фурье ИК-спектрометре IP 8-66 (фирмы Broker) в области 400-4000 см¹ с разрешением 1 см¹ и погрешностью определения интенсивности 1% /Огарков Б.Н. Mycota - основа многих биотехнологий, Иркутск, 2011/.

Из примеров видно, что предварительная обработка повышает выход меланина и концентрацию ПМЦ, что значительно увеличивает качество препарата.

Предлагаемый способ получения пигмента меланина из доступного растительного сырья с повышенным выходом качественного меланина при использовании биологических особенностей жуков-грибоедов, упрощающих технологию получения продукта.

Пигмент можно использовать в качестве пищевого красителя, БАД к пище, основы для производства лекарственных препаратов, фармакологии и в других областях.