КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ АНТИМЕТАБОЛИТ ГЛЮКОЗЫ, БУТИЛИРОВАННЫЙ ГИДРОКСИАНИЗОЛ И/ИЛИ БУТИЛИРОВАННЫЙ ГИДРОКСИТОЛУОЛ

Область техники, к которой относится изобретение

Осуществления настоящего изобретения относятся к композициям, содержащим антиметаболит глюкозы, бутилированный гидроксианизол (ВНА) и/или бутилированный гидрокситолуол (ВНТ). В частности, но не исключительно, осуществления настоящего изобретения относятся к композициям, содержащим антиметаболит глюкозы, ВНА и/или ВНТ, для животных-компаньонов.

Уровень техники

Биологические теории правильно предсказали открытие того, что ограничение приема калорий путем пищевой депривации замедляет некоторые нежелательные клеточные процессы у лабораторных животных, многие из которых связаны со старением и возрастными заболеваниями.

В частности, ограничение калорий, как было показано, последовательно увеличивает продолжительность жизни, приостанавливает возникновение и замедляет развитие опухолей, и замедляет физиологическое старение во многих системах. Действительно, исследование, которое продолжалось более семидесяти лет, показало, что ограничение калорий является пищевым вмешательством, которое устойчиво продлевает жизнь у животных. См. Weindruch and Walford, «The Retardation of Aging and Disease by Dietary Restriction», Springfield, IL: Charles C. Thomas (1988); Yu, «Modulation of Aging Processes by Dietary Restriction», Boca Raton: CRC Press (1994); и Fishbein, «Biological Effects of Dietary Restriction», Springer, New York (1991). Такие влияния ограничения калорий на продолжительность жизни и развитие опухолей были много раз сообщены, начиная с ранних исследований McKay. См. McKay et al., «The Effect of Retarded Growth Upon the Length of Lifespan and Upon Ultimate Body Size», J. Nutr., Vol.10, pp.63-79 (1935). Действительно, за два последних десятилетия, возрождение интереса к ограничению калорий в геронтологии привело к общему принятию того, что такие диетологические манипуляции замедляют физиологическое старение во многих системах. См. Weindruch and Walford, «The Retardation of Aging and Disease by Dietary Restriction», Springfield, IL: Charles C. Thomas (1988); Yu, «Modulation of Aging Processes by Dietary Restriction», Boca Raton: CRC Press (1994); Fishbein, «Biological Effects of Dietary Restriction», Springer, New York (1991) и Masoro, E.J. «Overview of Caloric Restriction and Ageing», Mech. Aging Dev., Vol.126, pp 913-922 (2005).

Снижение уровней глюкозы и инсулина натощак и повышение чувствительности к инсулину являются легко измеримыми биомаркерами ограничения калорий. Грызуны с ограничением калорий проявляют более низкие уровни глюкозы и инсулина натощак, а пиковые уровни глюкозы и инсулина, которые достигаются при глюкозной нагрузке, снижены у тех, кто испытывал ограничение калорий. См. Kalant et al., «Effect of Diet Restriction on Glucose Metabolism and Insulin Responsiveness and Aging Rats», Mech. Aging Dev., Vol.46, pp.89-104 (1988). Также известно, что гиперинсулинемия является фактором риска, связанным с некоторыми такими болезненными процессами, включая сердечное заболевание и диабет (Balkau and Eschwege, Diabetes Obes. Metab. 1 (Suppl. 1): S23-31, 1999). Сниженные уровни инсулина и температура тела являются двумя из наиболее надежных индикаторов измененного метаболического профиля (Masoro et al., J. Gerontol. Biol. Sci. 47:B202-B208, 1992); Koizumi et al., J. Nutr. 117: 361-367, 1987; Lane et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 93: 4154-4164, 1996).

Антиметаболиты глюкозы, такие как 2-дезокси-0-глюкоза, являются соединениями, родственными глюкозе. Однако, ввиду структурных различий с глюкозой, такие соединения блокируют или ингибируют определенные аспекты углеводного обмена и поэтому могут создавать эффекты, подобные эффектам ограничения калорий (Rezek et al., J. Nutr. 106:143-157, 1972). Такие антиметаболиты вызывают ряд физиологических эффектов, включая снижение массы тела, снижение уровней инсулина в плазме крови, снижение температуры тела, замедление образования и роста опухолей и повышение концентрации циркулирующих глюкокортикоидных гормонов. (Обзор см. Roth et al., Ann. NY Acad. Sci. 928: 305-315, 2001). Эти физиологические эффекты возникают в результате ингибирования углеводного обмена.

Бутилированный гидрокситолуол (ВНТ) и бутилированный гидроксианизол (ВНА) являются липофильными органическими соединениями, содержащими сопряженные ароматические циклы, которые в значительной степени придают им соответствующие антиоксидантные свойства, и фактически первый из них может быть рассмотрен как синтетический аналог витамина Е. Последний на самом деле представляет собой смесь двух изомерных органических соединений, 2-трет-бутил-4-гидроксианизола и 3-трет-бутил-4-гидроксианизола. Ни ВНТ, ни ВНА не являются природными. ВНТ получают либо путем реакции п-крезола (4-метилфенола) с изобутиленом (2-метилпропеном) или из 2,6-ди-трет-бутилфенола путем гидроксиметилирования или аминометилирования с последующим гидрогенолизом, и ВНА получают из 4-метоксифенола и изобутилена.

Как ВНТ, так и ВПА используют в качестве консервантов в пищевых продуктах, лекарственных средствах, косметике и связанных с ними продуктах ввиду их антиоксидантного действия. Как указано выше, их сопряженные ароматические циклы стабилизируют и связывают свободные радикалы, тем самым предотвращая или подавляя автоокисление ненасыщенных органических материалов. При некоторых биологических применениях, ВНТ и ВНА могут действовать как аналогично (антиоксиданты), так и синергически (ВНА как защита от повреждений мембраны, ведущих к повышенным уровням инсулина, и ВНТ как защита от повреждений мембраны, подавляющих действие инсулина). Таким образом, ВНА и ВНТ могут быть представлены для рассмотрения взаимозаменяемо, отдельно или в сочетании для применений, предлагаемых ниже. Их «первичные» эффекты могут быть, следовательно, рассмотрены как улавливание кислородных свободных радикалов, а последующие биологические применения как «вторичные» результаты этой окислительной защиты.

Не ограничиваясь теорией, считается, что ряд потенциально синергетических эффектов и полезных эффектов может возникнуть, если ВНТ и/или ВНА включены в миметические составы и композиции антиметаболита глюкозы, действующие подобно ограничению калорий. Например, считается, что ВНТ и ВНА оба могут действовать синергически с антиметаболитом глюкозы для усиления его влияния на чувствительность к инсулину, сигнализацию инсулина, циркулирование уровней инсулина и поддержание мышечной массы и функциональности мышц. Кроме того, было сообщено, что низкая доза ВНА и ВНТ может быть защитной от рака и препятствовать канцерогенезу. См. Botterweck et al., «Intake of Butylated Hydroxyanisole and Butylated Hydroxytoluene and Stomach Cancer Risk: Results from Analyses in the Netherlands Cohort Study», Food and Chemical Toxicology, 38 (2000) 599-605. Таким образом, возможно, что использование такого сочетания может уменьшить требуемые дозы каждого из антиоксидантных соединений и антиметаболита глюкозы, чтобы обеспечить ожидаемые полезные эффекты, т.к. антиметаболиты глюкозы предположительно действуют через другой анти-гликолизный механизм. Возможность использования самой низкой возможной эффективной дозы ВНТ и/или ВНА может быть желательным результатом исходя из исследований большой дозировки, безопасности и эффективности. Хотя антиметаболит глюкозы можно считать надежным и всеобъемлющим миметиком ограничения калорий, возможно, будет достигнуто улучшение его эффективности и/или экономической эффективности,. Считается, что при объединении его с усиливающими его действие агентами, такими как ВНТ и/или ВНА, которые обеспечивают аналогичные полезные эффекты, но действуют через иные метаболические механизмы, такое улучшение эффективности может быть достигнуто. Таким образом, ВНТ и/или ВНА представляют собой потенциальные агенты, которые могут быть объединены с антиметаболитом глюкозы в миметическую систему ограничения калорий, чтобы создать «грубую» и/или «тонкую» корректировку настройки метаболических эффектов и полезных эффектов для здоровья всего организма, создаваемых антиметаболитами глюкозы.

Дополнительно, одним из главных признаков фенотипа ограничения калорий является увеличение чувствительности к инсулину. Эта чувствительность часто сопровождается снижением уровня инсулина в плазме, а также служит в качестве антидиабетического механизма. Кроме того, сигнальный путь инсулина (или его гомолога в низших животных моделях), как представляется, тесно связан с долголетием и реагирует на многие вмешательства, которые продлевают его для поддерживания функциональности и жизнеспособности. Манногептулоза является одним из миметических соединений ограничения калорий, которые, как было показано, понижают уровень инсулина в плазме крови и/или повышают чувствительность к инсулину у мышей, собак и других видов.

В качестве возможного дополнительного пути, Moustafa et al (1995) показали, что ВНТ, который давали крысам в течение 18 месяцев в дозе 140 мг/кг массы тела в день, повышал чувствительность к инсулину и частично уменьшал снижение, связанное с возрастом, в стимулируемом инсулином транспорте глюкозы в адипоциты. Этот положительный эффект может быть обусловлен его способностью защищать липиды клеточной мембраны от окислительных повреждений, вызванных свободными радикалами. Повреждение от свободных радикалов является хорошо известным причинным фактором в ухудшении многих функций, связанном с процессом старения. Хотя манногептулоза, как полагают, оказывает некоторую косвенную защиту от окислительного повреждения (см. WO 2008093302 A2), ее основной положительный эффект состоит в чувствительности к инсулину, что вероятно приводит в результате к ингибированию гексокиназы и гликолизу, тем самым снижая общий гликолитический поток. Интересно, Rady et al (1980) ранее показал отсутствие влияния ВНТ на гексокиназу или другие гликолитические ферменты в экстрактах мышиных легких. Таким образом, вместе взятые, приведенные выше результаты показывают, что ВНТ может действовать синергически с антиметаболитами глюкозы, чтобы защитить организм млекопитающего от возрастной потери чувствительности к инсулину, функционируя через различные, но комплементарные, молекулярные механизмы.

Также, аллоксан широко используется в как in vivo, так и в in vitro ситуациях, чтобы вызвать диабет. Аллоксан-индуцированный диабетический отклик несколько аналогичен повышенным уровням циркулирующего инсулина, обычно наблюдаемым при нормальном старении. Аллоксан оказывает отрицательное влияние на бета-клетки поджелудочной железы из-за предположительно его роли в генерации свободных радикалов, которые приводят к увеличению секреции инсулина. Maechler et al (1999) сообщили, что ВНА блокировал отрицательное влияние аллоксана при использовании культивированных клеток, секретирующих инсулин. Самым релевантным к положительному эффекту манногептулозы для снижения уровня инсулина в плазме крови является способность ВНА предотвращать аллоксан-индуцированное увеличение секреции инсулина. В то время как ВНТ, как кажется, защищает от потери чувствительности к инсулину, полезные эффекты ВНА, как кажется, состоят в его способности защитить клеточные мембраны от повреждения свободными радикалами. ВНТ может также обеспечить защиту от повышенных уровней инсулина. Таким образом, возможно, что ВНА может действовать синергически с антиметаболитом глюкозы, чтобы предотвратить повышение уровня инсулина иным, но комплементарным, механизмом.

Таким образом, антиметаболит глюкозы, ВНТ и ВНА обеспечивают аналогичные положительные эффекты, но действуют через различные молекулярные процессы и механизмы. Различные механизмы действия этих соединений показывают, что сочетание манногептулозы, ВНТ и/или ВНА может иметь синергетический эффект в организме млекопитающих, чтобы обеспечить дополнительные улучшения эффективности и действенности. Таким образом, добавление ВНТ и/или ВНА в миметические композиции на основе антиметаболита глюкозы, действующие, как ограничение калорий, как можно было бы ожидать, приведет к большей чувствительности к инсулину и лучшей защите от возрастной потери чувствительности к инсулину и/или повышению уровней циркулирующего инсулина, с одновременным возможным снижением концентрации манногептулозы, необходимой для достижения ее положительных эффектов.

Таким образом, было бы полезно обеспечить питание, такое как антиметаболит глюкозы в сочетании с ВНА и/или ВНТ, в частности для животных-компаньонов. Соответственно, осуществления относятся к такой композиции.

Сущность изобретения

Одно осуществление относится к композиции корма для домашних животных, содержащей антиметаболит глюкозы и ВНА. Антиметаболит глюкозы может содержать манногептулозу. ВНА может присутствовать в количестве от приблизительно 2 мг на кг композиции до приблизительно 140 мг на кг композиции, или от приблизительно 6 мг на кг композиции до приблизительно 80 мг на кг композиции, или от приблизительно 10 мг на кг композиции до приблизительно 60 мг на кг композиции. Антиметаболит глюкозы может присутствовать в композиции в количестве менее, чем приблизительно 5% по массе композиции. Композиция корма для домашних животных может быть влажной композицией, полувлажной композицией, сухой композицией и их комбинациями. Композиция может быть диетически сбалансированной композицией корма для домашних животных.

Другое осуществление относится к композиции корма для домашних животных, содержащей антиметаболит глюкозы и ВНТ. Антиметаболит глюкозы может содержать манногептулозу. ВНТ может присутствовать в количестве от приблизительно 2 мг на кг композиции до приблизительно 140 мг на кг композиции, или от приблизительно 6 мг на кг композиции до приблизительно 80 мг на кг композиции, или от приблизительно 10 мг на кг композиции до приблизительно 60 мг на кг композиции. Антиметаболит глюкозы может присутствовать в композиции в количестве менее, чем приблизительно 5% по массе композиции. Композиция может быть влажной композицией, полувлажной композицией, сухой композицией и их комбинациями. Композиция может быть диетически сбалансированной композицией корма для домашних животных.

Другое осуществление относится к композиции корма для домашних животных, содержащей антиметаболит глюкозы, ВНА и ВНТ. Антиметаболит глюкозы может содержать манногептулозу. ВНА и ВНТ могут присутствовать в суммарном количестве от приблизительно 2 мг на кг композиции до приблизительно 140 мг на кг композиции. Антиметаболит глюкозы может присутствовать в композиции в количестве менее, чем приблизительно 5% по массе композиции. Композиция может быть влажной композицией, полувлажной композицией, сухой композицией и их комбинациями. Композиция может быть диетически сбалансированной композицией корма для домашних животных.

Краткое описание чертежей

На чертеже изображена интегрированная амперометрическая хроматограмма, полученная при способе с антиметаболитом глюкозы.

Подробное описание изобретения

Определения

Как используют в данной заявке, подразумевают, что единственное число, если его используют в формуле или в описании данной заявки, означает один или более заявленных или описанных объектов.

Как используют в данной заявке, термины «включать», «включает» и «включающий» подразумевают как неограничивающие.

Как используют в данной заявке, термин «множество» означает более одного.

Как используют в данной заявке, термины «животное» или «домашнее животное» означают домашнее животное, включая, но не ограничиваясь приведенным, домашних собак (семейство собачьих), кошек (семейство кошачьих), лошадей, коров, хорьков, кроликов, свиней, крыс, мышей, песчанок, хомяков и тому подобное. Домашние собаки и домашние кошки являются конкретными примерами домашних животных и упоминаются в данной заявке как «животные-компаньоны». Следует понимать, что в данном описании при использовании термина «животное», «домашнее животное» или «животное-компаньон», животное, домашнее животное или животное-компаньон находится не в болезненном состоянии, если не указано иное.

Как используют в данной заявке, термины «корм для животных», «композиция корма для животных», «гранулы корма для животных», «корм для домашних животных» или «композиция корма для домашних животных», все означают композицию, предназначенную для употребления животным. Корм для домашних животных может включать, без ограничения, диетически сбалансированные композиции, подходящие для ежедневного корма, а также добавки и/или лакомства, которые могут быть или могут не быть диетически сбалансированными.

Как используют в данной заявке, термин «диетически сбалансированный» означает, что композиция, такая как корм для домашних животных, имеет известные необходимые пищевые вещества для поддержания жизни в надлежащих количествах и пропорциях за исключением дополнительной нужды в воде, исходя из рекомендаций признанных авторитетов в области питания домашних животных, включая государственные органы, такие как, но не ограничиваясь приведенным, Центр ветеринарной медицины Управления по контролю за продуктами и лекарствами Соединенных Штатов (Unites States Food and Drug Administration′s Center for Veterinarian Medicine), Ассоциация должностных лиц по контролю за кормами (American Feed Control Officials Incorporated),,.

Все дозы для приема внутрь в соответствии с настоящим изобретением приведены в расчете на килограмм массы тела животного-компаньона, если не указано иное.

Следует понимать, что каждый максимальный численный предел, указанный в настоящем описании, включает каждый нижний численный предел, как если бы такие нижние численные пределы были явным образом описаны в данной заявке. Каждый минимальный численный предел, указанный в данном описании, будет включать каждый верхний численный предел, как если бы такие верхние численные пределы были явным образом указаны в данной заявке. Каждый числовой диапазон, указанный в данном описании, будет включать каждый более узкий интервал численных значений, попадающий в такой больший числовой диапазон, как если бы такие узкие диапазоны численных значений были все явным образом указаны в данной заявке.

Все перечисления элементов, таких как, например, перечисления ингредиентов, предназначены для и должны быть интерпретированы как группы Маркуша. Таким образом, все перечисления могут быть прочитаны и интерпретированы как элементы, «выбранные из группы, состоящей из» … перечисления элементов … «и их комбинаций и смесей».

Ссылки в данной заявке являются торговыми наименованиями компонентов, включая различные ингредиенты, которые используют в осуществлениях настоящего изобретения. Авторы настоящего изобретения не намерены ограничиваться материалами под определенными торговыми наименованиями. Материалы, равноценные материалам, указанным под торговым наименованием (например, полученные из другого источника под другим именем или номером), могут быть заменены и использованы в описании, приведенном в данной заявке.

Процессы, способы, композиции и аппараты в данной заявке могут включать, состоять по существу из, или состоять из любых признаков или осуществлений изобретения, описанных в данной заявке.

При описании различных осуществлений данного раскрытия, описаны различные осуществления или индивидуальные признаки. Как должно быть очевидно специалисту в данной области техники, все комбинации таких осуществлений и признаков возможны и могут привести к предпочтительным вариантам исполнениям изобретения. Хотя различные осуществления и индивидуальные признаки изобретения были проиллюстрированы и описаны, различные другие изменения и модификации могут быть выполнены без отступления от сущности и объема изобретения. Как также будет очевидно, все комбинации осуществлений и признаков, раскрытые в предшествующем описании, возможны и могут привести к предпочтительным вариантам исполнения изобретения.

Осуществления настоящего изобретения

Осуществления настоящего изобретения относятся к композициям, содержащим ВНА и/или ВНТ и компонент антиметаболита глюкозы, выбранный из группы, состоящей из 2-дезокси-D-глюкозы; 5-тио-D-глюкозы; 3-О-метилглюкозы; 1,5-ангидро-D-глюцитола; 2,5-ангидро-D-глюцитола; 2,5-ангидро-D-маннитола; манногептулозы; и их смесей и комбинаций. Не имея желания быть связанными теорией, данные компоненты принимают как антиметаболиты глюкозы. В другом осуществлении, компоненты могут присутствовать в указанных композициях посредством компонента растительного материала, такого как авокадо, или другого обогащенного источника манногептулозы, такого как люцерна, инжир, примула и т.д.

Антиметаболиты глюкозы

Компоненты антиметаболитов глюкозы, как описано в данной заявке, включают 2-дезокси-D-глюкозу, 5-тио-D-глюкозу, 3-О-метилглюкозу, ангидросахара, включая 1,5-ангидро-D-глюцитол, 2,5-ангидро-О-глюцитол и 2,5-ангидро-D-маннитол, манногептулозу, и их смеси и комбинации. Манногептулоза является одним конкретным антиметаболитом глюкозы. В одном осуществлении, манногептулоза может присутствовать в указанных композициях в качестве компонента растительного материала, такого как авокадо, экстракт авокадо, мука из плодов авокадо, концентрат авокадо или другие обогащенные источники манногептулозы. Неограничивающие примеры обогащенных источников манногептулозы включают люцерну, инжир или примулу. Растительный материал может включать плоды, семена (или косточки), ветви, листья или любые другие части соответствующих растений или их комбинации.

Авокадо (также обычно называют аллигаторовой грушей, по-испански - Aguacate или Paha) содержит чрезвычайно обогащенные источники манногептулозы, а также родственные сахара и другие углеводы. Авокадо представляет собой субтропическое вечнозеленое плодовое дерево, растущее наиболее успешно в районах Калифорнии, Флориды, Гавайев, Гватемалы, Мексики, Вест-Индии, Южной Африки и Азии.

Виды авокадо, включают, например, Persea Americana и Persea nubigena, включая все сорта культурного растения в указанных иллюстративных видах. Сорта культурного растения могут включать ′Anaheim′, ′Bacon′, ′Creamhart′, ′Duke′, Tuerte′, ′Gamer′, ′Gwen′, ′Hass′, ′Jim′, ′Lula′, ′Lyon′, ′Mexicola Grande′, ′Murrieta Green′, ′Nabal′, ′Pinkerton′, ′Queen′, ′Puebla′, ′Reed′, ′Rincon′, ′Ryan′, ′Spinks′, ′Тора Тора′, ′Whitsell′, ′Wurtz′ и ′Zutano′. Плоды авокадо являются особенно предпочтительным для использования в настоящем изобретении, они могут содержать косточку или у них может быть удалена косточка или, по меньшей мере, частично удалена. Плоды Persea Americana являются особо предпочтительными для применения в данной заявке, а также плод сортов культурного растения, которые дают большие плоды (например, приблизительно 12 унций или более, если плод зрелый), таких как Anaheim, Creamhart, Fuerte, Hass, Lula, Lyon, Murrieta Green, Nabal, Queen, Puebla, Reed, Ryan и Spinks.

Растительный материал из люцерны, инжира или примулы также, как сообщают, обеспечивает относительно высокие уровни манногептулозы. Люцерну также называют Medicago sativa. Может быть также использован инжир или Ficus carica (включая фикус клубковатый или сикомор античный, например), а также примула, или Primula officinalis.

Было открыто, что конкретные уровни компонента, выбранного из 2-дезокси-D-глюкозы; 5-тио-D-глюкозы; 3-О-метилглюкозы; 1,5-ангидро-D-глюцитола; 2,5-ангидро-D-глюцитола; 2,5-ангидро-D-маннитола; манногептулозы; и их смесей и комбинаций, могут быть использованы в данной заявке. В частности, было найдено, что относительно низкие уровни, а также относительно высокие дозы компонента, являясь полезными, могут обеспечивать менее, чем оптимальную эффективность для желательных целей. Дозировка будет зависеть от используемого компонента антиметаболита глюкозы, и будет варьироваться в зависимости от размера и состояния животного-компаньона, которому антиметаболит глюкозы должен быть введен. Дозировка в диапазоне от приблизительно 0,0001 или приблизительно 0,001 грамм/кг до приблизительно 1 г/кг может быть полезной в некоторых осуществлениях. Как используют в данной заявке, если используют дозировку в мг/кг, то «мг» относится к уровню компонента, такого как манногептулоза, а «кг» относится к килограммам массы тела животного-компаньона, такого как собака или кот. Дозировка в нижнем диапазоне также может быть приемлемой при использовании 2-дезокси-D-глюкозы у крупных животных. Более высокие дозы, особенно соединений, таких как 5-тио-D-глюкоза или 2,5-ангидро-D-маннитол, также могут быть легко переносимыми. В одном осуществлении, дозировка компонента, который дают животному-компаньону на ежедневной основе, может составлять от приблизительно 0,1, 0,5, 1, 2 или 5 мг/кг до приблизительно 15, 20, 50, 100, 150 или 200 мг/кг, и все комбинации этих диапазонов, при этом «мг» относится к уровню компонента, и «кг» относится к килограммам массы тела животного-компаньона. В одном осуществлении, дозировка для животного-компаньона, на ежедневной основе, может составлять от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 15 мг/кг, от приблизительно 2 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг или от приблизительно 2 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг. В одном осуществлении, дозировка для животного-компаньона, на ежедневной основе, может составлять от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 1,5 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 2 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, или приблизительно 2 мг/кг. В определенных осуществлениях, такие количества могут преобразовываться в композиции, содержащие менее, чем приблизительно 5%, или менее, чем приблизительно 2%, или от приблизительно 0,0001% до приблизительно 0,5%, или от приблизительно 0,1% до приблизительно 10%, или от приблизительно 0,1% до приблизительно 5%, компонента, все по массе композиции. Все диапазоны между ними предусмотрены. Уровень компонента может быть определен специалистом в данной области техники на основании различных факторов, например, формы композиции (например, сухая композиция, полувлажная композиция, влажная композиция или добавка, либо любая другая форма, или их смеси). Специалист в данной области техники сможет использовать предпочтительные дозировки и определять оптимальный уровень компонентов в данной композиции.

Аналогичным образом, может быть обеспечено общее количество дозы компонента на ежедневной основе, предоставляемое животному-компаньону. Такая суточная доза может составлять от приблизительно 0,1 мг в день до приблизительно 1000 мг в день. Такие суточные дозы могут зависеть от размера животного-компаньона, которое потребляет композицию. Например, в одном осуществлении, крупные животные-компаньоны могут потреблять больше, чем мелкие животные-компаньоны. Естественно, это согласуется с дозировкой, описанной в данной заявке в отношении дозирования количества на массу животного-компаньона. Таким образом, в одном осуществлении, по мере увеличения животного-компаньона в размерах большее количество композиции может быть введено.

Соответственно, в одном осуществлении, такая суточная доза может соответствовать дозировке на ежедневной основе на массу животного-компаньона, как описано в данной заявке. В частности, суточные дозы могут варьироваться, в некоторых осуществлениях, от приблизительно 0,1 мг в день до приблизительно 1000 мг в день, или даже больше, в зависимости от размера животного-компаньона и суточных доз, как описано выше. В других вариантах, суточная доза может составлять от приблизительно 1 мг в день до приблизительно 500 мг в день, или от приблизительно 1 мг в день до приблизительно 200 мг в день, или от приблизительно 1 мг в день до приблизительно 100 мг в день, или от приблизительно 5 мг день в день до приблизительно 100 мг в день, или от приблизительно 5 мг в день до приблизительно 80 мг в день, или от приблизительно 10 мг в день до приблизительно 50 мг в день, или приблизительно 40 мг в день. Все диапазоны между ними также предусмотрены.

Аналогично, если экстракт или муку грубого помола из растительных материалов используют в композициях в данной заявке, уровни экстракта или муки грубого помола могут зависеть от уровня эффективного компонента в таком экстракте или муке грубого помола. В настоящем изобретении были найдены экстракты и/или мука грубого помола, которые содержат от приблизительно 0,5% до приблизительно 99% компонента антиметаболита глюкозы, альтернативно от приблизительно 0,5% до приблизительно 75% компонента антиметаболита глюкозы, альтернативно от приблизительно 0,5% до приблизительно 50% компонента антиметаболита глюкозы, альтернативно от приблизительно 0,5% до приблизительно 25% компонента антиметаболита глюкозы, все по массе экстракта или муки грубого помола. В данном изобретении были найдены экстракты и/или мука грубого помола, в которых компонент антиметаболита глюкозы может составлять от приблизительно 0,5, 1, 2, 5 или 10% до приблизительно 15, 25, 50 или 75% по массе экстракта и/или муки грубого помола.

ВНА и ВНТ

Как описано, композиция осуществлений в соответствии с настоящим изобретением может содержать ВНА и/или ВНТ. ВНА и ВНТ представляют собой синтетические антиоксиданты, которые могут быть добавлены к жиру и жирным продуктам, чтобы предотвратить окислительное ухудшение их качества. Поскольку они являются синтетическими и не встречаются в природе, композиции в соответствии с настоящим изобретением, которые относятся к осуществлениям, содержат синтетический ВНА и/или ВНТ.

В одном осуществлении композиции в соответствии с настоящим изобретением, включен только ВНА (ВНТ исключен). В других осуществлениях, как ВНА, так и ВНТ включены в композиции в соответствии с настоящим изобретением.

ВНА и/или ВНТ могут присутствовать в композиции через любое количество источников. В одном осуществлении, ВНА и/или ВНТ могут быть включены добавлением через жир во время составления композиции. ВНА и/или ВНТ обычно можно использовать в качестве пищевых добавок в жире, чтобы предотвратить или уменьшить окисление. В других осуществлениях ВНА и/или ВНТ могут быть добавлены в композиции в данной заявке путем добавления других носителей.

Композиция может содержать различные количества ВНА и/или ВНТ. Каждый из них рассмотрен следующим образом.

В одном осуществлении, ВНА может быть включен в композиции в данной заявке по количеству рациона. Таким образом, общее количество ВНА в композициях может составлять в одном осуществлении от приблизительно 2 до приблизительно 140 мг/кг рациона. В других осуществлениях, общее количество ВНА может присутствовать в количестве от приблизительно 3 до приблизительно 120 мг/кг рациона, или от приблизительно 4 до приблизительно 100 мг/кг рациона, или от приблизительно 5 до приблизительно 90 мг/кг рациона, или от приблизительно 6 до приблизительно 80 мг/кг рациона. В одном осуществлении, общее количество ВНА может присутствовать в количестве от приблизительно 10 до приблизительно 30 мг/кг рациона.

ВНА может быть включен в композиции в данной заявке по количеству, введенному животному в день. Таким образом, общее количество ВНА, введенное животному в день, может составлять в одном осуществлении от приблизительно 0,12 до приблизительно 210 мг/день. В других осуществлениях, общее количество ВНА, введенное животному в день, может составлять от приблизительно 0,13 до приблизительно 200 мг/день, или от приблизительно 0,14 до приблизительно 180 мг/день, или от приблизительно 0,15 до приблизительно 160 мг/день, или от приблизительно 0,16 до приблизительно 140 мг/день, или от приблизительно 0,2 до приблизительно 120 мг/день. В одном осуществлении, общее количество ВНА, введенное животному в день, может составлять от приблизительно 1 до приблизительно 20 мг/день.

ВНА может быть включен в композиции в данной заявке по количеству, введенному животному в день на массу тела животного. Таким образом, общее количество ВНА, введенное животному в день на массу тела животного, может составлять в одном осуществлении от приблизительно 0,04 до приблизительно 3,6 мг/день.кг массы тела. В других осуществлениях, общее количество ВНА, введенное животному в день на массу тела животного может составлять от приблизительно 0,06 до приблизительно 3 мг/день.кг массы тела, или от приблизительно 0,08 до приблизительно 2,5 мг/день.кг массы тела, или от приблизительно 0,08 до приблизительно 2,25 мг/день.кг массы тела, или от приблизительно 0,1 до приблизительно 2 мг/день.кг массы тела. В одном осуществлении, общее количество ВНА, введенное животному в день на массу тела животного может составлять от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,6 мг/день.кг массы тела.

В одном осуществлении, ВНТ может быть включен в композиции в данной заявке по количеству рациона. Таким образом, общее количество ВНТ в композициях может составлять в одном осуществлении от приблизительно 2 до приблизительно 140 мг/кг рациона. В других осуществлениях, общее количество ВНТ может присутствовать в количестве от приблизительно 3 до приблизительно 120 мг/кг рациона, или от приблизительно 4 до приблизительно 100 мг/кг рациона, или от приблизительно 5 до приблизительно 90 мг/кг рациона, или от приблизительно 6 до приблизительно 80 мг/кг рациона. В одном осуществлении, общее количество ВНТ может присутствовать в количестве от приблизительно 10 до приблизительно 30 мг/кг рациона.

ВНТ может быть включен в композиции в данной заявке по количеству, введенному животному в день. Таким образом, общее количество ВНТ, введенное животному в день, может составлять в одном осуществлении от приблизительно 0,12 до приблизительно 210 мг/день. В других осуществлениях, общее количество ВНТ, введенное животному в день, может составлять от приблизительно 0,13 до приблизительно 200 мг/день, или от приблизительно 0,14 до приблизительно 180 мг/день, или от приблизительно 0,15 до приблизительно 160 мг/день, или от приблизительно 0,16 до приблизительно 140 мг/день, или от приблизительно 0,2 до приблизительно 120 мг/день. В одном осуществлении, общее количество ВНТ, введенное животному в день, может составлять от приблизительно 1 до приблизительно 20 мг/день.

ВНТ может быть включен в композиции в данной заявке по количеству, введенному животному в день на массу тела животного. Таким образом, общее количество ВНТ, введенное животному в день на массу тела животного, может составлять в одном осуществлении от приблизительно 0,04 до приблизительно 3,6 мг/день.кг массы тела. В других осуществлениях, общее количество ВНТ, введенное животному в день на массу тела животного, может составлять от приблизительно 0,06 до приблизительно 3 мг/день.кг массы тела, или от приблизительно 0,08 до приблизительно 2,5 мг/день.кг массы тела, или от приблизительно 0,08 до приблизительно 2,25 мг/день.кг массы тела, или от приблизительно 0,1 до приблизительно 2 мг/день.кг массы тела. В одном осуществлении, общее количество ВНТ, введенное животному в день на массу тела животного, может составлять от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,6 мг/день/юг массы тела.

Как описано, в одном осуществлении может присутствовать только ВНА (ВНТ исключен) в композициях в соответствии с настоящим изобретением. То есть, ВНА может присутствовать, но не ВНТ, в композициях в соответствии с настоящим изобретением. В других осуществлениях, как ВНА, так и ВНТ включены в композиции в соответствии с настоящим изобретением.

Как описано, в одном осуществлении, может присутствовать только ВНТ (ВНА исключен) в композициях в соответствии с настоящим изобретением. То есть, ВНТ может присутствовать, но не ВНА, в композициях в соответствии с настоящим изобретением. В других осуществлениях, как ВНА. так и ВНТ включены в композиции в соответствии с настоящим изобретением.

Любое сочетание ВНА и ВНТ может быть включено в композиции в данной заявке по количеству рациона. Таким образом, общее количество ВНА и ВНТ в композициях может составлять в одном осуществлении от приблизительно 2 до приблизительно 140 мг/кг рациона. В других осуществлениях, общее количество ВНА и ВНТ может присутствовать в количестве от приблизительно 3 до приблизительно 120 мг/кг рациона, или от приблизительно 4 до приблизительно 100 мг/кг рациона, или от приблизительно 5 до приблизительно 90 мг/кг рациона, или от приблизительно 6 до приблизительно 80 мг/кг рациона. В одном осуществлении, общее количество ВНА и ВНТ может присутствовать в количестве от приблизительно 10 до приблизительно 30 мг/кг рациона.

Любое сочетание ВНА и ВНТ может быть включено в композиции в данной заявке по количеству, введенному животному в день. Таким образом, общее количество ВНА и ВНТ, введенное животному в день, может составлять в одном осуществлении от приблизительно 0,12 до приблизительно 210 мг/день. В других осуществлениях, общее количество ВНА и ВНТ, введенное животному в день, может составлять от приблизительно 0,13 до приблизительно 200 мг/день, или от приблизительно 0,14 до приблизительно 180 мг/день, или от приблизительно 0,15 до приблизительно 160 мг/день, или от приблизительно 0,16 до приблизительно 140 мг/день, или от приблизительно 0,2 до приблизительно 120 мг/день. В одном осуществлении, общее количество ВНА и ВНТ, введенное животному в день, может составлять от приблизительно 1 до приблизительно 20 мг/день.

Любое сочетание ВНА и ВНТ может быть включено в композиции в данной заявке по количеству, введенному животному в день на массу тела животного. Таким образом, общее количество ВНА и ВНТ, введенное животному в день на массу тела животного может составлять в одном осуществлении от приблизительно 0,04 до приблизительно 3,6 мг/день.кг массы тела. В других осуществлениях, общее количество ВНА и ВНТ, введенное животному в день на массу тела животного может составлять от приблизительно 0,06 до приблизительно 3 мг/день.кг массы тела, или от приблизительно 0,08 до приблизительно 2,5 мг/день.кг массы тела, или от приблизительно 0,08 до приблизительно 2,25 мг/день.кг массы тела, или от приблизительно 0,1 до приблизительно 2 мг/день.кг массы тела. В одном осуществлении, общее количество ВНА и ВНТ, введенное животному в день на массу тела животного может составлять от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,6 мг/день.кг массы тела.

В одном осуществлении, соотношение ВНА и ВНТ может быть приблизительно 1:1. В других осуществлениях, любое соотношение может быть использовано, например, 0:1 или 1:0.

Композиции

Соответственно, осуществления настоящего изобретения направлены на композицию, предназначенную для проглатывания животным-компаньоном и которая содержит антиметаболит глюкозы и ВНА и/или ВНТ, как описано в данной заявке. Композиции включают продукты, предназначенные для удовлетворения необходимых потребностей в корме, а также лакомства (например, печенье) или другие пищевые добавки Необязательно, композиция в данной заявке может быть сухой композицией (например, гранулы), полувлажной композицией, влажной композицией или любой их смесью. Альтернативно или дополнительно, композиция является добавкой, такой как соус, питьевая вода, йогурт, порошок, суспензия, жевательная резинка, лакомство (например, печенье) или любой другой формой поставки.

Кроме того, в одном осуществлении композиция может быть диетически сбалансированной, например гранулы корма для домашних животных. В другом осуществлении, композиция не является диетически сбалансированной, например, добавка, лакомство или другая форма поставки для домашнего животного. Диетически сбалансированные корма для домашних животных и добавки, а также способы их производства, хорошо известны в данной области техники.

Композиции, используемые в данной заявке, могут необязательно содержать один или более дополнительных компонентов. Другие компоненты являются полезными для включения в композиции, используемые в данной заявке, но являются необязательными для целей настоящего изобретения. В одном осуществлении, композиции могут содержать, в пересчете на сухое вещество, от приблизительно 10% до приблизительно 90% общего белка, альтернативно от приблизительно 20% до приблизительно 50% общего белка, альтернативно от приблизительно 20% до приблизительно 40% общего белка, по массе композиции, или альтернативно от приблизительно 20% до приблизительно 35% неочищенного белка, по массе композиции. Материал общего белка может содержать белки на растительной основе, такие как соевые бобы, зерновые (кукуруза, пшеница и т.д.), хлопковое масло и арахис, или белки на животной основе, такие как казеин, альбумин и мясной белок. Неограничивающие примеры мясного белка, используемые в данной заявке, включают источник белка, выбранный из группы, включающей говядину, свинину, баранину, птицу, рыбу и их смеси.

Дополнительно, композиции могут содержать, в пересчете на сухое вещество, от приблизительно 5% до приблизительно 40% жира, альтернативно от приблизительно 10% до приблизительно 35% жира, по массе композиции.

Осуществления изобретения, относящиеся к композициям в соответствии с настоящим изобретением, могут дополнительно содержать источник углеводов. В одном осуществлении, композиции могут содержать от приблизительно 35%, по массе композиции, до приблизительно 50%, по массе композиции, источника углеводов. В других осуществлениях, композиция может содержать от приблизительно 35% до приблизительно 45%, по массе композиции или от приблизительно 40% до 50%, по массе композиции, источника углеводов. Зерна или зерновые, такие как рис, кукуруза, майло, сорго, ячмень, пшеница и тому подобное, являются иллюстративными источниками углеводов.

Композиции также могут содержать другие вещества, такие как, по не ограничиваясь приведенным, сухая сыворотка и другие молочные побочные продукты, свекловичный жом, целлюлоза, волокна, рыбий жир, льняное масло, витамины, минералы, ароматизаторы, антиоксиданты и таурин.

Композиции также могут содержать другие необязательные ингредиенты. Необязательные ингредиенты могут включать пробиотические компоненты (бифидобактерии и/или Lactobacillus) и пребиотические (фруктоолигосахариды) компоненты. Примеры и количества пробиотических компонентов и пребиотических компонентов, которые могут быть включены, раскрыты в публикации США №2005/0158294, например. Другие необязательные ингредиенты, которые могут быть включены, представляют собой омега-6 и омега-3 жирные кислоты, карнитин, гексаметафосфат, глюкозамин, хондроитинсульфат, каротиноиды, включая бета-каротин, витамин Е и лютеин, и те ингредиенты, которые приведены в Таблице 1 ниже.

Примеры

Следующие примеры приведены для иллюстрации осуществлений настоящего изобретения и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом.

Получение муки из плодов авокадо, содержащей манногептулозу

Свежие авокадо (Lula variety) получали от Fresh King Incorporated (Homestead, FL). Авокадо вручную разделяли, вынимали и отбрасывали косточки. Оставшуюся кожицу и мякоть размалывали при помощи устройства Hobart Commercial Food Preparation (серийный номер 11-10410235), используя сито 1214. Размолотое авокадо затем переносили в сушилку Edwards Freeze (Super Modulyo Model, Crawely, Sussex, England). Лиофильную сушилку устанавливали при -20°C в течение первых 24 часов, -5°C в течение последующих 24 часов и 5°C в течение последних 72 часов. После удаления из лиофильной сушилки, муку размалывали в порошок при помощи мельницы Straub (модель 4Е, Philadelphia, РА). Муку из плодов авокадо анализировали и было обнаружено, что она содержит приблизительно 10,35% манногептулозы, по массе муки. Необходимо отметить, что количество манногептулозы, обнаруженной в авокадо, варьируется в зависимости от определенного вида и состояния зрелости.

Получение экстракта авокадо

Экстракт авокадо, содержащий повышенные уровни манногептулозы, получают в соответствии со следующим необязательным процессом, и используют в композициях в соответствии с осуществлениями настоящего изобретения.

Обеспечивают цельные плоды авокадо (приблизительно 900 килограмм). Плоды разрезают и удаляют косточку, частично или полностью, обеспечивая приблизительно 225 килограмм половинок авокадо с удаленными косточками. Сырые авокадо погружают в дезинтегратор, после некоторого перемешивания дополнительно добавляют воду (приблизительно 3000 килограмм) и CELLUBRIX (коммерчески доступный от Novozymes A/S) (приблизительно 1 литр). Смесь дополнительно перемешивают и одновременно нагревают до приблизительно 66°C. После окончания загрузки, добавляют еще CELLUBRIX (приблизительно 1 литр) и всю смесь выдерживают при перемешивании в течение приблизительно 12 часов при контролируемом pH приблизительно 5,5. Температуру затем дополнительно повышают до приблизительно 80°C и потом выдерживают в течение, по меньшей мере, приблизительно 2 часов. Полученную в результате переваренную растительную смесь затем фильтруют при 80°C с получением углеводного экстракта в качестве фильтрата. Углеводный экстракт потом упаривают в упрощенной системе рециркуляции при 80°C, под вакуумом, с получением углеводного экстракта, имеющего от приблизительно 10% до приблизительно 20% твердых веществ и pH приблизительно 5,5. Затем экстракт дополнительно концентрируют, используя сушилку Refractance Window, с обеспечением приблизительно 100 кг экстракта в виде кристаллов или порошка (выход приблизительно 11% углеводного экстракта, исходя из исходной массы цельных плодов авокадо, который соответствует выходу от приблизительно 0,25% до приблизительно 4,5% манногептулозы, исходя из исходной массы цельных плодов авокадо). Следует отметить, что количество манногептулозы, найденное в авокадо, варьируется в зависимости от конкретного вида и степени зрелости плода. Экстракт может быть использован в композициях в соответствии с осуществлениями настоящего изобретения.

Гранулы

Таблица 1 иллюстрирует две композиции в виде гранул, имеющие следующие компоненты в примерных указанных количествах, которые получают с использованием процессов, которые являются стандартными в данной области техники, включая экструзию, и которые могут давать собакам и/или кошкам в качестве ежедневного корма:

Применение

Восемьдесят (n=80) лабрадоров были рандомизированы по возрасту, полу и одному помету, чтобы получать либо полное и диетически сбалансированное контрольное питание, аналогичное Eukanuba^® Senior Large Breed, либо экспериментальное питание, которое идентично контрольному питанию, кроме включения манногептулозы, ВНА и ВНТ, как описано ниже. Собаки были разделены на две группы исследования.

Исследование 1: всего 39 старших лабрадоров-ретривер могут кормить диетически сбалансированной композицией, обеспечивающей манногептулозу в количестве 0 или приблизительно 2 мг/кг массы тела собаки и ВНА и ВНТ в количестве от 0 мг на кг рациона до приблизительно 12 мг на кг рациона, соответственно. Средний возраст собак (12 кастрированных самцов, 27 стерилизованных самок) в начале 4-летнего исследования составлял 6,7 лет с диапазоном от 5,1 до 8,2 лет для самых молодых и самых старых собак в группе, соответственно. Контрольную композицию могут давать в качестве диетически сбалансированной композиции, и она не содержала манногептулозы (0 мг/кг), ВНА и ВНТ (0 мг на кг рациона), экстракта авокадо, муки из плодов авокадо или концентрата авокадо. Тестируемая композиция может быть диетически сбалансированной контрольной композицией, полученной с применением экстракта авокадо, муки из плодов авокадо или концентрата авокадо, чтобы обеспечить манногептулозу в дозе приблизительно 2 мг/кг массы тела собаки, и ВНА и ВНТ в количестве приблизительно 12 мг на кг рациона. Старшим собакам могут давать по половине их суточного рациона в 07:30 и 14:30 каждый день. Собак могут кормить для поддержания массы тела и показателя конституции (BCS) в пределах 2-4 баллов. Если должны были быть внесены пищевые коррективы, они были бы сделаны на ежеквартальной основе. Всех собак могут не кормить в течение ночи, и утренние блюда могут удерживать, пока не отберут кровь для всех иммунных измерений. Воду давали неограниченно.

Исследование 2: Всего 41 молодых лабрадоров-ретривер могут кормить диетически сбалансированной композицией, обеспечивающей манногептулозу в количестве 0 или приблизительно 2 мг/кг массы тела собаки и ВНА в количестве 0 мг на кг рациона или приблизительно 24 мг на кг рациона, соответственно. Средний возраст собак (12 кастрированных самцов, 29 стерилизованных самок) в начале 36-месячного исследования составлял 4,0 года с диапазоном от 2,0 до 6,1 лет для самых молодых и старых собак в группе, соответственно. Контрольную композицию могут давать в качестве диетически сбалансированной композиции (Eukanuba^® Senior Maintenance Formula), и она не содержала манногептулозы (0 мг/кг), ВНА и ВНТ (0 мкг на г рациона), экстракта авокадо, муки из плодов авокадо или концентрата авокадо. Тестируемая композиция может быть диетически сбалансированной контрольной композицией, полученной с применением экстракта авокадо, муки из плодов авокадо или концентрата авокадо, чтобы обеспечить манногептулозу в дозе приблизительно 2 мг/кг массы тела собаки и ВНА в количестве приблизительно 24 мг на кг рациона. Молодым собакам могут давать по половине их суточного рациона в 07:30 и 14:30 каждый день. Собак могут кормить для поддержания массы тела и показателя конституции (BCS) в пределах 2-4 баллов. Если должны были быть внесены пищевые коррективы, они были бы сделаны на ежеквартальной основе. Однако, всех собак могут не кормить в течение ночи и утренние блюда могут удерживать, пока не отберут кровь для всех иммунных измерений. Воду давали неограниченно.

Способы

Антиметаболит глюкозы, такой как манногептулоза, может быть измерен в корме для домашних животных или добавке следующим образом. Процедура (используйте только деионизированную воду):

Взвесьте приблизительно 0,1 г корма/ингредиента в 15 мл пластиковую центрифужную пробирку.

Добавьте 10 мл воды в пробирку и встряхивайте в течение 5 минут.

Центрифугируйте пробирку при максимальной скорости (2440 г) в течение 5 минут.

Поместите некоторое количество надосадочной жидкости в 0,2 мкм нейлоновый центрифужный фильтр и вращайте при максимальной скорости (14000 g) в течение 5 минут. Проба готова для впрыскивания.

Подготовьте углеводный стандарт концентрацией 10 мкг/мл путем растворения 10 мг каждого углевода в 1 л воды.

Подготовьте углеводный стандарт концентрацией 1 мкг/мл путем растворения 100 мкл раствора концентрацией 10 мкг/мл в 900 мкл воды.

Подготовьте углеводный стандарт концентрацией 0,1 мкг/мл путем растворения 10 мкл раствора концентрацией 10 мкг/мл в 990 мкл воды.

Условия ионообменной хроматографии: очистка элюента: Ionpac АТС-3 (Dionex P/N 059661), Boratetrap (Dionex P/N 047078). Колонка: CarboPac PA20 (Dionex P/N 060142), 2 мм Aminotrap предколонка (Dionex P/N 046122). Температура колонки: 30°C

ПРОКАЧКА

Скорость: 0,4 мл/мин

Элюенты: А = Вода, В = 0,2 М NaOH, D = 1 М NaOH

Примечание: может быть необходимым регенерировать колонку перед применением путем 30-60 минутного промывания 1 М NaOH, с последующим 30-60 минутным промыванием раствором, содержащим 95% воды и 5% 0,2 М NaOH. Следуйте рекомендованной процедуре от Dionex для подготовки элюентов.

АВТОМАТИЧЕСКИЙ ОТБОР ПРОБЫ

Объем впрыскивания: 10 мкл на весь процесс

ИНТЕГРИРОВАННАЯ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКАЯ ХРОМАТОГРАММА

ПРИМЕЧАНИЕ: количественно определите все пики с использованием площадей пиков. Пример интегрированной амперометрической хроматограммы можно увидеть на Фигуре.

Ссылки:

1. Shaw, Р.Е.; Wilson, C.W.; Knight, R.J. J. Agric. Food Chem. 1980, 28, 379-382.

2. Dionex CarboPac20 документ №031844-01.

ВНА и/или ВНТ

Экстрагируйте неочищенный жир, как описано в официальном методе АОАС 954.02 с использованием кислотного гидролиза и определите ВНА и/или ВНТ официальным методом АОАС 983.15: Phenolic Antioxidants in Oils, Fats, and Butter Oil, следующим образом.

Поместите пробу массой приблизительно 2 г, точно взвешенную, измельченную, хорошо перемешанную в Mojonnier пробирку для экстракции жира, добавьте 2 мл спирта, чтобы предотвратить образование комков при добавлении кислоты, и встряхните, чтобы увлажнить все частицы. Добавьте 10 мл HCl (25+11), хорошо перемешайте и установите пробирку на 30-40 мин на водяную баню при 70°-80°C, часто встряхивая. Охладите до комнатной температуры и добавьте спирт, пока уровень жидкости не поднимется в суженную часть Mojonnier пробирки.

Добавьте 25 мл эфира, закройте пробкой из стекла, неопрена или резиновой пробкой хорошего качества, тщательно очищенной спиртом, и энергично встряхивайте 1 мин. Осторожно сбросьте давление, чтобы растворитель не был потерян. Смойте прилипший растворитель и жир с пробки обратно в экстракционную пробирку несколькими мл повторно перегнанного петролейного эфира (температура кипения <60°C).

Добавьте 25 мл повторно перегнанного петролейного эфира, закройте пробкой и энергично встряхивайте 1 мин. Дайте постоять, пока верхний слой жидкости не станет практически прозрачным или центрифугируйте 20 мин при приблизительно 600 оборотах в минуту. Пропустите столько раствора жира в эфире, сколько это возможно, через фильтр, состоящий из хлопкового тампона, упакованного достаточно прочно в горлышко воронки, чтобы эфир мог свободно вытекать в 150 мл стакан, содержащий несколько стеклянных шариков. Промойте кромку пробирки несколькими мл петролейного эфира. Повторно экстрагируйте жидкость, оставшуюся в пробирке, дважды, каждый раз только 15 мл каждого эфира, встряхивая 1 мин после добавления каждого эфира. Вылейте прозрачный раствор эфира через фильтр в тот же самый стакан, что и раньше, и промойте края пробирки, пробку, воронку, и конец горлышка воронки несколькими мл смеси 2 эфиров (1+1).

Выпаривайте медленно на паровой бане при слабом потоке воздуха или N₂. Продолжайте нагревание на паровой бане в течение 15 мин после окончания испарения растворителя, затем охладите до комнатной температуры.

Повторно растворите сухой жирный остаток в четырех порциях по 10 мл этилового эфира, фильтруя каждую порцию через небольшой хлопковый тампон в 100 мл стакан, содержащий несколько стеклянных шариков, которые были предварительно высушены в течение 30 минут при 100°C, охладите до комнатной температуры в эксикаторе и взвесьте сразу. Используйте пятую 10 мл порцию эфира для полоскания хлопка и воронки. Выпарите эфир на паровой бане, высушивайте 90 мин при 100°C, охладите до комнатной температуры в эксикаторе и взвесьте сразу. Скорректируйте этот вес путем холостого определения с используемыми реагентами.

Описанный выше экстрагированный жир впоследствии используют для анализа ВНА/ВНТ следующим образом.

A. Содержание ВНА и/или ВНТ в корме можно измерить с помощью официального метода АОАС 983.15: Phenolic Antioxidants in Oils, Fats, and Butter Oil, следующим образом.

B. Аппарат:

a. Градиентный жидкостный хроматограф. С 10 мВ рекордером или интегратором для электронного измерения высот пиков, 10 мкл петлевым инжекционным клапаном и детектором для измерения коэффициента поглощения при 280 нм. Типичные условия эксплуатации: чувствительность детектора 0,05 AUFS; температура окружающей среды; скорость потока 2,0 мл/мин.

b. Колонка для жидкостной хроматографии. Заполненная С18-связанным сферическим кремнеземом или эквивалентом. При желании используйте защитную колонку.

c. Стеклянная посуда. Сполосните всю стеклянную посуду последовательно CHCl₃, ацетоном и метанолом,, и высушите потоком N₂.

C. Реагенты:

a. Растворители. Ацетонитрил, 2-пропанол и гексан. Класс: дистиллированные в стекле.

b. Подвижная фаза. (1) 5% уксусная кислота в Н₂О - класс: для жидкостной хроматографии. (2) ацетонитрил-метанол (1+1, об/об) - класс: для жидкостной хроматографии.

Запустите линейный градиент, от 30% (2) в (1) до 100% (2), в течение 10 мин с фиксацией до элюирования предыдущего антиоксиданта (DG). Только для тестового раствора, увеличьте скорость потока до 4 мл/мин при 100% (2) в течение 6 мин или до элюирования неполярных липидов. Для тестовых растворов и стандартов, вернитесь к 30% (об/об) (2) в (1) в течение 1 мин. при 2 мл/мин, и дайте базовой линии и давлению стабилизироваться (приблизительно 6 минут). Запустите холостой градиент растворителя (без инжекции), чтобы гарантировать, что никаким пикам не мешает присутствие каких-либо антиоксидантов. Для устранения или уменьшения пиков, связанных с растворителем (1), примененным для элюирования, замените входной фильтр на предварительно промытый твердофазный С18 экстракционный картридж и используйте встроенный фильтр. Если малые интерферирующие пики не будут устранены, вычтите высоту пика или помехи градиента из пиков соответствующего стандартного или тестового раствора.

c. Антиоксиданты. ВНА (смесь 2- и 3-ВНА), ВНТ

d. Стандартные растворы. Подготовьте в смеси 2-пропанола и ацетонитрила (1+1, об/об): (1) Стандартный исходный раствор - 1 мг/мл. Точно взвесьте приблизительно 50 мг с точностью до 0,1 мг каждого антиоксиданта и загрузите в одну 50 мл мерную колбу. Растворите, разбавьте до объема и перемешайте. (2) Рабочий стандартный раствор - 0,01 мг/мл. Внесите пипеткой 1 мл стандартного исходного раствора в 100 мл мерную колбу, разбавьте до объема и перемешайте.

e. Экстракционные растворители. (1) Насыщенный гексан. Насыщайте приблизительно 300 мл гексана в делительной воронке, добавляя ацетонитрил до тех пор, пока после встряхивания в течение 2 мин. не будут сохраняться 2 слоя. Отбросьте ацетонитрильный нижний слой. (2) Насыщенный ацетонитрил. Насыщайте приблизительно 300 мл ацетонитрила в делительной воронке, добавляя гексан до тех пор,, пока после встряхивания в течение 2 мин. не будут сохраняться 2 слоя Удалите и отбросьте гексановый верхний слой.

D. Определение.

а. Экстракция. Точно взвесьте с точностью до 0,01 г 50 мл стакан, содержащий приблизительно 5,5 г жидкости или сливочного масла или приблизительно 3,0 г свиного сала или шортенинга (сжиженного в массе с использованием водяной бани при 60°C или печи, и подвергнутого вращательному перемешиванию или встряхиванию, чтобы обеспечить однородность). Декантируйте пробу, насколько это возможно, в 125 мл делительную воронку, содержащую 20 мл (22,5 мл для свиного сала или шортенинга) насыщенного гексана. Взвесьте повторно стакан для определения массы пробы. Подвергните вращательному перемешиванию для смешивания пробы с гексаном и экстрагируйте тремя порциями по 50 мл насыщенного ацетонитрила. Если образуются эмульсии, выдерживайте делительную воронку под горячей водопроводной водой 5-10 с. Соберите экстракты в 250 мл делительную воронку, и оставьте соединенные экстракты медленно стекать в 250 или 500 мл круглодонную колбу, чтобы помочь удалению капель гексан-масло. (Примечание: в этом пункте 150 мл ацетонитрильного экстракта может храниться в течение ночи в холодильнике).

Упаривайте до 3-4 мл, с использованием флэш-испарителя на водяной бане с температурой ≤40°C, в течение 10 мин. Используя одноразовую пипетку, перенесите смесь капель ацетонитрила и масла в 10 мл мерный цилиндр с притертой пробкой. Промойте колбу небольшими порциями ненасыщенного ацетонитрила. По мере того, как промывная жидкость собирается на дне колбы, пипеткой отбирайте ее в цилиндр, пока не соберется 5 мл. Промойте пипетку через верх и продолжайте промывать колбу небольшими порциями 2-пропанола, перенося промывные воды в цилиндр, пока 10 мл не соберется. Перемешайте содержимое цилиндра.

b. Хроматография. Используя петлевой инжекционный клапан, впрысните 10 мкл тестового экстракта и элюируйте по программе градиента растворителя для тестовых экстрактов, С(b). До и после каждого из 3-4 тестовых впрыскиваний, или чаще, если различия между высотами стандартных пиков оказываются >5%, впрысните 10 мкл рабочего стандартного раствора антиоксиданта (10 мкл/мл) и элюируйте программой градиента растворителя для стандартов, С, (b). Для анализируемых пиков, которые зашкаливают или превышают стандарт более, чем втрое, количественно разбавляйте тестовые экстракты 2-пропанол-ацетонитрилом (1+1) и повторно впрыскивайте. Идентифицируйте пики путем сравнения с временем удерживания стандарта.

Для определения холостого реагента, возьмите 25 мл насыщенного гексана и выполните экстракцию, (а), начиная с «…экстрагируют тремя порциями по 50 мл насыщенного ацетонитрила». Впрысните 10 мкл экстракта холостого реагента и элюируйте по программе градиента растворителя для аналитов. Холостой реагент не должен иметь никаких пиков, мешающих определению антиоксиданта.

Используйте электронно определенные высоты пиков, или измерьте высоту пика с точностью до 0,1 мм, используя градиентную хроматограмму холостого реагента в качестве руководства, чтобы следовать базовой линии. Определите высоты пиков антиоксидантов и средние стандартные высоты пиков антиоксидантов (из дублированных инжекций до и после тестовой инжекции, с поправкой на холостой градиент).

Е. Расчеты:

Рассчитайте концентрацию антиоксиданта следующим образом:

Антиоксидант, мкг/г=(R_x/R_s)×(C_s/W_x)×D

где R_x и R_s являются высотами пиков пробы и стандарта, соответственно; C_s является концентрацией стандарта, мкг/мл; W_x является массой пробы, г/мл, в неразбавленном 10 мл тестовом экстракте; и D является фактором разбавления, если впрыснутый раствор разбавлен.

Размеры и значения, описанные в данной заявке, не должны быть истолкованы как строго ограниченные точными численными значениями, которые указаны. Вместо этого, если не указано иное, каждый такой размер предназначен для обозначения как процитированного значения, так и функционально эквивалентного диапазона, охватывающего данное значение. Например, размер, описанный как «40 мм», предназначен для обозначения «приблизительно 40 мм».

Каждый документ, процитированный в данной заявке, включая любые перекрестные ссылки или родственные патенты или заявки, включен в данную заявку путем ссылки во всей ее полноте, если нет выраженных исключений или иных ограничений. Цитирование любого документа не должно быть истолковано как допущение того, что он представляет собой уровень техники в отношении любого изобретения, раскрытого или заявленного в данной заявке, или что он отдельно или в любой комбинации с любой другой ссылкой или ссылками, описывает, предполагает, или раскрывает любое такое изобретение. Дополнительно в случае, когда любое значение или определение термина в данном документе противоречит какому-либо значению или определению в документе, включенном путем ссылки, значение или определение, присвоенные этому же термину в данном письменном документе будут определяющими.

В то время как конкретные осуществления в соответствии с настоящим изобретением были проиллюстрированы и описаны, специалистам в данной области техники будет очевидно, что различные другие изменения и модификации могут быть выполнены, не выходя за суть и объем настоящего изобретения. Поэтому формула настоящего изобретения, которая прилагается, предназначена для охватывания всех таких изменений и модификаций, которые входят в объем настоящего изобретения.