Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ УВЕЛИЧЕНИЯ СТЕПЕНИ ИЗВЛЕЧЕНИЯ ЭКДИСТЕРОИДОВ И ФЛАВОНОИДОВ ИЗ РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТОВ

Изобретение относится к способу выделения биологически активных веществ из растительного сырья.

Предложенный способ позволяет увеличить степень извлечения фенольных соединений и экдистероидов как мажорных распространенных, так и минорных редких соединений из растительного сырья, что может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве, профессиональном спорте, для синтеза различных стероидных соединений.

Известен способ обработки растений водными растворами этилового спирта [1].

Недостатки этого способа: недостаточная степень извлечения экстрагируемых веществ из растений.

Известен способ воздействия ультразвука на процесс экстракции экдистероидов из растительного сырья [2], заключающийся в одновременном проведении экстракции и обработке ультразвуком и сокращении времени экстракции. Недостатки: эксперименты проведены на растениях другого семейства (Asteraceae), не изучены последствия воздействия на экстракты и организм человека.

В качестве прототипа приводится способ извлечения экдистероидов из растительного сырья [3]. Согласно данным, опубликованным в этой работе, экстракция растений проводится пятикратно в течение 12 часов (5, 3, 2, 1 и 1 час), при этом степень извлечения составляет 90%.

Недостатками прототипа являются длительность экстракции, сравнительно низкая полнота извлечения экдистероидов.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа обработки растительного сырья, увеличивающего степень извлечения экдистероидов и флавоноидов.

Поставленная задача решается тем, что в способе, включающем экстракцию растительного сырья водно-спиртовым раствором, для экстракции используют 70% водно-спиртовой раствор, полученный путем добавления в этиловый спирт омагниченной воды, для чего добавляемую в спирт воду подвергают предварительному воздействию магнитного поля напряженностью не более 0,00002 А/м.

Поскольку в проанализированной литературе не обнаружено данных по изучению действия омагниченной воды на извлечение биологически активных веществ (БАВ) из лекарственных растений, это позволяет считать техническое решение новым.

Имеются данные, что омагниченная вода и другие омагниченные жидкости оказывают оздоровительный эффект на весь организм, поскольку она активизирует клеточные мембраны и соответственно усиливает проникновение в клетку питательных веществ и вывод токсических веществ за пределы клетки. Известно достаточно широкое использование омагниченной воды в медицине и промышленности [4].

Омагниченная вода представляет собой воду, насыщенную активным атомарным кислородом. Авторами разработки омагниченной воды найдены режимы ее обработки и соответственно способы структурирования воды, при которых достигается эффект консервации питьевой воды, выраженный лечебный эффект в отношении животных, экспериментально пораженных радиацией, а также подавление развития раковых опухолей, лишение их способности деления в модельных экспериментах [5, 6].

Все проведенные на сегодня эксперименты показали высокую медико-биологическую активность омагниченной воды, полученной путем воздействия магнитного поля напряженностью не более 0,00002 А/м, и возможность целевого изменения в широких пределах характера ее воздействия на биообъекты на организменном и клеточном уровнях при чрезвычайно низких энергозатратах и стоимости используемого оборудования [5, 6].

Способ реализуется следующим образом.

Аналитическую пробу 0,6 г сырья экстрагируют трехкратно 70% водно-спиртовым раствором, полученным путем добавления в этиловый спирт омагниченной воды, для чего добавляемую в спирт воду подвергают предварительному воздействию магнитного поля напряженностью не более 0,00002 А/м, на водяной бане при 60°С. Экстракт отгоняют на ротационном испарителе при 40°C до объема 3-5 мл. Разделение концентрированного экстракта осуществляют с помощью препаративной тонкослойной хроматографии с использованием пластинки размером 20×20 см с закрепленным слоем смеси сорбентов: силикагель - оксид алюминия - гипс в системе растворителей хлороформ - этанол - ацетон (5:3:1). После хроматографирования отмечают зоны локализации 20-гидроксиэкдизона на фоне эталона. Количественно перенесенные образцы в колбы с притертыми пробками десорбируют с сорбента 10 мл 96% этанола при непрерывном встряхивании в течение 4 часов. Оптическую плотность отфильтрованного элюата определяют на спектрофотометре Shimadzu 1800 в диапазоне 240-250 нм.

Содержание флавоноидов в полученном экстракте определяли спектрофотометрическим методом [7]. В мерную колбу вместимостью 25 мл помещали 1 мл экстракта, 1 мл раствора алюминия хлорида в 95% спирте и доводили объем 95% спиртом до метки. Через 40 минут измеряли оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 415 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Параллельно измеряли оптическую плотность раствора Государственного стандартного образца (ГСО) рутина, приготовленную аналогично испытуемому раствору.

Для установления влияния омагниченной воды на степень извлечения фитоэкдистероидов выбраны объекты, которые являются перспективными источниками фитоэкдистероидов - Silene frivaldszkyana, S. viridiflora, Lychnis chalcedonica. Изучен состав экдистероидов данных видов растений. Установлено, что при использовании омагниченной воды наибольшее влияние наблюдается на степень извлечения фитоэкдистероидов из корней Silene frivaldszkyana - в 1.69 раз по отношению к прототипу.

Показано, что происходит повышение степени извлечения флавоноидов во всех испытанных образцах растений при использовании омагниченной воды в качестве соэкстрагента. Однако больший показатель отмечен в L. chalcedonica (148%), тогда как в чаге и плодах боярышника этот показатель увеличился на 26-27%.

Результаты испытаний приведены в таблице 1.

Таким образом, омагниченная вода по сравнению с дистиллированной водой является лучшим экстрагентом биологически активных веществ, поскольку повышается степень извлечения флавоноидных соединений на 26-48% и экдистероидов на 24-69%.

Частный случай изобретения может быть реализован на смеси березового гриба чаги и надземной части Silene viridiflora, а также на смеси надземной части лихниса халцедонского и боярышника кроваво-красного (плодов).

Из литературы известно, что жидкий экстракт из плодов боярышника лечит функциональные расстройства сердечной деятельности, гипертонию, повышенную функцию щитовидной железы. Основным действующим началом растительного лекарственного сырья боярышников являются флавоноиды [8]. Лихнис халцедонский содержит флавоноиды и экдистероиды, оказывающие гемореологическое действие [9-11].

Кроме того, лихнис халцедонский известен в народной медицине как средство при желудочно-кишечных, женских и накожных заболеваниях. В лаборатории ВИЛР он изучен как средство, действующее на сердечно-сосудистую и центральную нервную систему, а также как эффективное средство при экспериментальном атеросклерозе [12].

Основанием для выбора растений послужили экспериментальные данные, полученные совместно с учеными НИИ фармакологии. Установлено, что Lychnis chalcedonica и Silene viridiflora обладают как гемореологической, так и противоопухолевой активностью [13].

Все рекомендуемые источники экдистероидов успешно интродуцированы в Сибирском ботаническом саду ТГУ [14, 15].

Подтверждение возможности получения данным способом заявленного технического результата - увеличения степени извлечения экдистероидов и флавоноидов из растительных объектов приводится в следующих конкретных примерах.

Пример 1. Аналитическую пробу 0,6 г сырья, состоящего из смеси надземной части лихниса халцедонского и боярышника кроваво-красного (плодов) в соотношении 1:1, экстрагировали трехкратно 70% водно-спиртовым раствором, полученным путем добавления в этиловый спирт омагниченной воды, для чего добавляемую в спирт воду подвергают предварительному воздействию магнитного поля напряженностью не более 0,00002 А/м, на водяной бане при 60°С. Экстракт отгоняли на ротационном испарителе при 40°C до объема 3-5 мл. Разделение концентрированного экстракта осуществляли с помощью препаративной тонкослойной хроматографии с использованием пластинки размером 20×20 см с закрепленным слоем смеси сорбентов: силикагель - оксид алюминия - гипс в системе растворителей хлороформ - этанол - ацетон (5:3:1). После хроматографирования отмечали зоны локализации 20-гидроксиэкдизона на фоне эталона. Количественно перенесенные образцы в колбы с притертыми пробками десорбировали с сорбента 10 мл 95% этанола при непрерывном встряхивании в течение 4 часов. Оптическую плотность отфильтрованного элюата определяли на спектрофотометре Shimadzu 1800 в диапазоне 240-250 нм. Содержание флавоноидов в полученном экстракте определяли спектрофотометрическим методом [7], описанным выше.

Пример 2. Аналитическую пробу 0,6 г сырья, состоящего из смеси надземной части лихниса халцедонского и боярышника кроваво-красного (плодов) в соотношении 2:1, экстрагировали трехкратно 70% водно-спиртовым раствором, полученным путем добавления в этиловый спирт омагниченной воды, для чего добавляемую в спирт воду подвергают предварительному воздействию магнитного поля напряженностью не более 0,00002 А/м, на водяной бане при 60°С. Экстракт отгоняли на ротационном испарителе при 40°C до объема 3-5 мл. Разделение концентрированного экстракта осуществляли с помощью препаративной тонкослойной хроматографии с использованием пластинки размером 20×20 см с закрепленным слоем смеси сорбентов: силикагель - оксид алюминия - гипс в системе растворителей хлороформ - этанол - ацетон (5:3:1). После хроматографирования отмечали зоны локализации 20-гидроксиэкдизона на фоне эталона. Количественно перенесенные образцы в колбы с притертыми пробками десорбировали с сорбента 10 мл 95% этанола при непрерывном встряхивании в течение 4 часов. Оптическую плотность отфильтрованного элюата определяли на спектрофотометре Shimadzu 1800 в диапазоне 240-250 нм. Содержание флавоноидов в полученном экстракте определяли аналогично примеру 1.

Пример 3. Аналитическую пробу 0,6 г сырья, состоящего из смеси надземной части лихниса халцедонского и боярышника кроваво-красного (плодов) в соотношении 1:2, экстрагировали трехкратно 70% водно-спиртовым раствором, полученным путем добавления в этиловый спирт омагниченной воды, для чего добавляемую в спирт воду подвергают предварительному воздействию магнитного поля напряженностью не более 0,00002 А/м, на водяной бане при 60°С. Экстракт отгоняли на ротационном испарителе при 40°C до объема 3-5 мл. Разделение концентрированного экстракта осуществляли с помощью препаративной тонкослойной хроматографии с использованием пластинки размером 20×20 см с закрепленным слоем смеси сорбентов: силикагель - оксид алюминия - гипс в системе растворителей хлороформ - этанол - ацетон (5:3:1). После хроматографирования отмечали зоны локализации 20-гидроксиэкдизона на фоне эталона. Количественно перенесенные образцы в колбы с притертыми пробками десорбировали с сорбента 10 мл 95% этанола при непрерывном встряхивании в течение 4 часов. Оптическую плотность отфильтрованного элюата определяли на спектрофотометре Shimadzu 1800 в диапазоне 240-250 нм. Содержание флавоноидов в полученном экстракте определяли аналогично примеру 1.

Пример 4. Аналитическую пробу 0,6 г сырья, состоящего из смеси надземной части смолевки зеленоцветковой и березового гриба чаги в соотношении 1:1, экстрагировали трехкратно 70% водно-спиртовым раствором, полученным путем добавления в этиловый спирт омагниченной воды, для чего добавляемую в спирт воду подвергают предварительному воздействию магнитного поля напряженностью не более 0,00002 А/м, на водяной бане при 60°С. Экстракт отгоняли на ротационном испарителе при 40°C до объема 3-5 мл. Разделение концентрированного экстракта осуществляли с помощью препаративной тонкослойной хроматографии с использованием пластинки размером 20×20 см с закрепленным слоем смеси сорбентов: силикагель - оксид алюминия - гипс в системе растворителей хлороформ - этанол - ацетон (5:3:1). После хроматографирования отмечали зоны локализации 20-гидроксиэкдизона на фоне эталона. Количественно перенесенные образцы в колбы с притертыми пробками десорбировали с сорбента 10 мл 95% этанола при непрерывном встряхивании в течение 4 часов. Оптическую плотность отфильтрованного элюата определяли на спектрофотометре Shimadzu 1800 в диапазоне 240-250 нм. Содержание флавоноидов в полученном экстракте определяли спектрофотометрическим методом [7], описанным выше.

Пример 5. Аналитическую пробу 0,6 г сырья, состоящего из смеси надземной части смолевки зеленоцветковой и березового гриба чаги в соотношении 2:1, экстрагировали трехкратно 70% водно-спиртовым раствором, полученным путем добавления в этиловый спирт омагниченной воды, для чего добавляемую в спирт воду подвергают предварительному воздействию магнитного поля напряженностью не более 0,00002 А/м, на водяной бане при 60°С. Экстракт отгоняли на ротационном испарителе при 40°C до объема 3-5 мл. Разделение концентрированного экстракта осуществляли с помощью препаративной тонкослойной хроматографии с использованием пластинки размером 20×20 см с закрепленным слоем смеси сорбентов: силикагель - оксид алюминия - гипс в системе растворителей хлороформ - этанол - ацетон (5:3:1). После хроматографирования отмечали зоны локализации 20-гидроксиэкдизона на фоне эталона. Количественно перенесенные образцы в колбы с притертыми пробками десорбировали с сорбента 10 мл 95% этанола при непрерывном встряхивании в течение 4 часов. Оптическую плотность отфильтрованного элюата определяли на спектрофотометре Shimadzu 1800 в диапазоне 240-250 нм. Содержание флавоноидов в полученном экстракте определяли аналогично примеру 1.

Пример 6. Аналитическую пробу 0,6 г сырья, состоящего из смеси надземной части смолевки зеленоцветковой и березового гриба чаги в соотношении 1:2, экстрагировали трехкратно 70% водно-спиртовым раствором, полученным путем добавления в этиловый спирт омагниченной воды, для чего добавляемую в спирт воду подвергают предварительному воздействию магнитного поля напряженностью не более 0,00002 А/м, на водяной бане при 60°С. Экстракт отгоняли на ротационном испарителе при 40°C до объема 3-5 мл. Разделение концентрированного экстракта осуществляли с помощью препаративной тонкослойной хроматографии с использованием пластинки размером 20×20 см с закрепленным слоем смеси сорбентов: силикагель - оксид алюминия - гипс в системе растворителей хлороформ - этанол - ацетон (5:3:1). После хроматографирования отмечали зоны локализации 20-гидроксиэкдизона на фоне эталона. Количественно перенесенные образцы в колбы с притертыми пробками десорбировали с сорбента 10 мл 95% этанола при непрерывном встряхивании в течение 4 часов. Оптическую плотность отфильтрованного элюата определяли на спектрофотометре Shimadzu 1800 в диапазоне 240-250 нм. Содержание флавоноидов в полученном экстракте определяли аналогично примеру 1.

Как следует из данных, приведенных в таблицах 2 и 3, содержание флавоноидов и экдистероидов больше в смесях с соотношением компонентов 2:1. Следует отметить, что уровень флавоноидов в исследуемых смесях при оптимальном соотношении плодов боярышника кроваво-красного и надземной части Lychnis chalcedonica выше в 8 раз, а в смеси березового гриба чаги и надземной части Silene viridiflora в 3.4 раза по сравнению с соответственными фармакопейными видами чагой (0.31%) и боярышником (0.22%), экстрагируемыми 70% этанолом, разбавленным дистиллированной водой. Кроме того, состав комплексов дополнительно обогащен биологически активными веществами - экдистероидами, обладающими гемореологическим и противоопухолевым действием, способными проявлять синергетический эффект.

Таким образом, разработан способ обработки растительного сырья, увеличивающий степень извлечения экдистероидов и флавоноидов.

Использованная литература

1. Зибарева Л.Н., Еремина В.И., Иванова Н.А. Новые экдистероидоносные виды рода Silene L. и динамика содержания в них экдистерона // Раст. ресурсы. - 1997. - Т. 33, вып.3. - С.73-76).

2. Зибарева Л.Н., Еремина В.И. Патент №2472519. Заявка №2011132760. Приоритет 03.08.2011. Срок действия патента 03.08.2031. Способ увеличения степени извлечения экдистероидов из растительных объектов. Зарегистрировано в Госреестре 20.01.2013.

3. Маматханов А.У., Шамсутдинов М. - Р.И., Шакиров Т.Т. Получение экдистерона / Химия природных соединений. 1983. №5. С.601-605.

4. Кузнецова С.Ю. Магнитные свойства воды // Материалы конф. «Успехи современного естествознания». - 2010. - №10 - стр.49-51.

5. Солодилов А.И. Способ обработки вещества магнитным полем и

устройство для его осуществления. Патент РФ 2155081. Дата публикации 27.08.2000.

6. Солодилов А.И. Способ катализа реакций. Патент РФ 2162736. Дата публикации 25.04.2000.

7. Государственная Фармакопея изд. XI, вып.2, С.323.

8. Акопов И.Э. Важнейшие отечественные лекарственные растения и их применение. Изд-во «Медицина», 1986, 567 с.

9. Плотников М.Б., Алиев О.И., Васильев А.С. , Маслов М.Ю., Зибарева Л.Н., Дмитрук С.Е., Калинкина Г.И. Гемореологические эффекты экстрактов Lychnis chalcedonica L. // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2000. - Т. 63. - N.2. - С.54-56.

10. Плотников М.Б., Алиев О.И., Васильев А.С. , Маслов М.Ю., Зибарева Л.Н. Гемореологическое средство и способ его получения. Патент 2138284, МКИ А61К 35/78. - №.98114435/14; Заявлено 14.07.98; Опубл. 27.09.99, Бюл. №.27. Приоритет 14.07.98.

11. Зибарева Л.Н., Алиев О.И., Колтунов А.А., Плотников М.Б. Гемореологическое средство. Патент 2160592, МКИ А61К 31/575, А61Р 7/00, 7/02. №.96118150/14; Заявлено 11.09.1996; Опубл. 20.12.2000, Бюл. №. 35. Приоритет 11.09.1996.

12. Турова А.Д. и др. Влияние некоторых сапонинов на сердечнососудистую систему в норме и при холестериновом атеросклерозе // Тез. докл. XI Всесоюз. конф. фармаколог. - М., 1965. - С.19.

13. Шилова Н.В., Зибарева Л.Н., Зуева Е.П., Амосова Е.Н., Разина Т.Г., Еремина В.И. Скрининговая оценка противоопухолевых свойств некоторых видов семейства Гвоздичных // Материалы междунар. научной конф. "Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности", Томск, 2000. - С.201-202.

14. Зибарева Л.Н. Фитоэкдистероиды растений семейства Caryophyllaceae. 2012. 195 с. ISBN 978-3-8473-1785-2. Издательство Lambert (Германия).

15. Зибарева Л.Н., Лафон Р., Дайнен Л. Влияние экологических условий Зап. Сибири на аккумулирование экдистероидов в растениях, интродуцированных из ботанических садов Западной Европы. // Сборник статей. Актуальные проблемы экологии и природопользования Сибири в глобальном контексте. Томск, 2007. С.132-135.