Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЛЕЛЬНОГО ПОЛИМОРФИЗМА CCR5 delta 32

Изобретение относится к области медицины, а именно генетике, гематологии, и может использоваться для определения аллельного полиморфизма CCR5 delta 32 при скрининговом обследовании образцов пуповинной крови, поступающих в банк пуповинной крови.

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) проникает в клетки посредством связывания гликопротеина вирусной оболочки gp 120 с мембранными рецепторами CD4 и CCR5. Одновременная экспрессия рецепторов CD4 и CCR5 встречается на T-лимфоцитах, моноцитах, макрофагах и дендритных клетках. Белок CCR5 кодируется геном CCR5, расположенным на коротком плече хромосомы 3 в позиции 21 (3p21). Существует полиморфизм CCR5 delta 32, представляющий из себя делецию 32 пар нуклеотидов в кодирующей области гена CCR5. В результате экспрессии мутантного гена в гомозиготном состоянии транслируется укороченный, функционально неактивный белок CCR5. Вследствие этого гомозиготные носители этого полиморфизма обладают практически полной резистентностью к инфицированию ВИЧ. Гомозиготными носителями делеционного аллеля являются около 1% белого населения [1, 2]. Известен успешный случай трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) периферической крови в 2007 году в Германии ВИЧ-инфицированному пациенту с острым миелоидным лейкозом от донора, гомозиготного носителя полиморфизма CCR5 delta 32 [3, 4]. Однако несмотря на успешность проведенного лечения, это был лишь единичный случай и в последующем ни одной ТГСК для лечения ВИЧ-инфекции не было проведено вследствие редкой встречаемости полиморфизма CCR5 delta 32 и строгими условиями подбора образцов костного мозга и периферической крови по системе HLA. В то же время гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) пуповинной крови с генотипом CCR5 delta 32/delta 32 могли бы со значительно большей вероятностью быть использованы для проведения трансплантации при ВИЧ-инфекции в связи со значительно менее строгими требованиями подбора образца по системе HLA [5].

В настоящее время в Российской Федерации представлено незначительное количество тест-систем для детекции мутации CCR5 delta 32. Доступные диагностические тест-системы обладают высокой стоимостью, для проведения исследований требуется наличие дорогостоящего оборудования. Кроме того, на данные диагностические тест-системы не получены сертификаты соответствия, что предполагает применение этих наборов только для научных целей и не допускает использование этих наборов в любых видах диагностических процедур. Пример - комплект реагентов «АмплиСенс CCR5del32-скрин» для определения полиморфизма CCR5 delta 32 методом пиросеквенирования.

Существуют способы определения аллельного полиморфизма CCR5 delta 32 методом аллель-специфичной ПЦР в реальном времени [5, 6].

В качестве прототипа можно рассматривать способ определения аллельного полиморфизма CCR5 delta 32, основанный на использовании метода ПЦР с рестрикционным анализом продуктов амплификации (ПЦР-ПДРФ) [7].

К недостаткам способа, выбранного нами в качестве прототипа, а также вышеуказанных аналогов, можно отнести то, что данные способы отличаются необходимостью использования дополнительных этапов анализа, реагентов и оборудования для проведения исследования, что увеличивает себестоимость метода, трудоемкость и время проведения анализа и не позволяет использовать данный метод для проведения скринингового обследования.

Техническим результатом изобретения является упрощение способа определения аллельного полиморфизма CCR5 delta 32, сокращение времени его проведения и снижение его себестоимости, что обеспечит возможность проведения скринингового обследования.

Технический результат изобретения достигается тем, что способ определения аллельного полиморфизма CCR5 delta 32 заключается в выделении ДНК, проведении ПЦР, детекции продукта реакции с использованием электрофореза, при этом ДНК выделяют из криоконсервированной пуповинной крови, а при проведении ПЦР используют следующие праймеры:

F: TGTGTTTGCGTCTCTCCCA

R: CTCTTCTTCTCATTTCGACACCG,

ПЦР проводят при 94°C в течение 5 мин, затем проводят 35 циклов, каждый из которых состоит из 3-х этапов: 94°C - 30 с, 56°C - 40 с, 72°C - 40 с. После чего проводят ПЦР при 72°C - 10 мин и 15°C - 5 мин. Детекцию полиморфизма осуществляют в 8% полиакриламидном геле с применением вертикального электрофореза. Наличие специфических ДНК-фрагментов определяют после электрофоретического разделения ПЦР-амплификационной смеси и окрашивания геля бромистым этидием с помощью трансиллюминатора. Длина ПЦР фрагментов составляет 224 п.н. при нормальном варианте гена и 192 п.н. при аллельном полиморфизме CCR5 delta 32.

Способ осуществляется следующим образом:

Перед постановкой реакции криоконсервированную при -70°C пуповинную кровь в микропробирках типа Эппендорф размораживают при комнатной температуре в течение 20-40 мин. Геномную ДНК выделяют из 0,9-1,0 мл пуповинной крови с использованием коммерческих наборов Protrans (Германия) или Axygen (США). Скрининговое исследование образцов на CCR5 delta 32 аллель проводят методом ПЦР. ДНК амплифицируют в конечном объеме реакционной смеси 20 мкл. Реакционная смесь содержит 10-кратный буфер для Taq-полимеразы, 2 мМ MgCl₂, 2 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата (dNTP), прямой и обратный праймеры (по 30 нг каждого), 0,1 Ед Taq-полимеразы, 40-120 нг исследуемой геномной ДНК. Используют следующие праймеры, фланкирующие делеционный сайт:

F: TGTGTTTGCGTCTCTCCCA

R: CTCTTCTTCTCATTTCGACACCG.

ПЦР проводят в амплификаторе Biorad My Cycler Version 1.065. Условия реакции: 94°C - 5 мин; далее 94°C - 30 с, 56°C - 40 с, 72°C - 40 с в течение 35 циклов; затем 72°C - 10 мин и 15°C - 5 мин. Детекцию полиморфизма осуществляют в 8% полиакриламидном геле с применением вертикального электрофореза. Наличие специфических ДНК-фрагментов определяют после электрофоретического разделения ПЦР-амплификационной смеси и окрашивания геля бромистым этидием с помощью трансиллюминатора. Длина ПЦР фрагментов составляет 224 п.н. при нормальном варианте гена и 192 п.н. при аллельном полиморфизме CCR5 delta 32.

Электрофореграмма продуктов амплификации представлена на Фиг. 1:

1 - гетерозиготное носительство полиморфизма CCR5 delta 32;

2 - нормальный тип гена CCR5;

3 - полиморфизм CCR5 delta 32 в гомозиготном состоянии.

Существенными отличительными признаками заявляемого способа являются:

- при проведении ПЦР используют следующие праймеры:

F: TGTGTTTGCGTCTCTCCCA

R: CTCTTCTTCTCATTTCGACACCG;

- ПЦР проводят при 94°C в течение 5 мин, затем проводят 35 циклов, каждый из которых состоит из 3-х этапов: 94°C - 30 с, 56°C -40 с, 72°C - 40 с; после чего проводят ПЦР при 72°C - 10 мин и 15°C - 5 мин;

- длина ПЦР фрагментов составляет 224 п.н. при нормальном варианте гена;

- аллельный полиморфизм CCR5 delta 32 определяется при наличии ПЦР-фрагментов размером 192 п.н.

Причинно-следственная связь между существенными отличительными признаками и достигаемым результатом:

Дизайн специфичных праймеров разработан с использованием биоинформационной базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.). Подобраны оптимальные условия для прохождения ПЦР - длина праймеров, температура отжига, длина ДНК-амплификата, соотношение нуклеотидов. Произведена проверка пары праймеров на возможность образования димеров, дуплексов, шпилек. Результаты подтверждены прямым секвенированием с использованием секвенатора CEQ 8800 (Beckman Coulter, США).

Пример конкретного выполнения способа:

Пример 1

Амплификация проводилась в объеме 18 мкл. Состав реакционной смеси: 14,5 мкл бидистиллированной воды, 2 мкл буфера для полимеразы (Taq буфер, 10-кратный, pH 8.6, без Mg2+), 1,2 мкл 25 мМ MgCl_2, 2 мкл смеси прямого и обратного праймеров (50 нг каждого праймера), 0,4 мкл смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов (10 mM dNTP), 0,1 мкл Taq-полимеразы (1 единица активности), 2 мкл анализируемой геномной ДНК (40-120 нг). ПЦР проводилась в амплификаторе Biorad My Cycler Version 1.065. Условия реакции: 94°C - 5 мин; далее 94°C - 30 с, 56°C - 40 с, 72°C - 40 с в течение 35 циклов; затем 72°C - 10 мин и 15°C - 5 мин. Детекция полиморфизма осуществлялась в 8% полиакриламидном геле с применением вертикального электрофореза. Наличие специфических ДНК-фрагментов определяли после электрофоретического разделения ПЦР-амплификационной смеси и окрашивания геля бромистым этидием с помощью трансиллюминатора. Длина ПЦР фрагментов составляла 224 п. н. при нормальном варианте гена и 192 п.н. при аллельном полиморфизме CCR5 delta 32.

Длины фрагментов, получаемые при генотипировании аллельного полиморфизма:

В процессе скринингового исследования детекции аллельного полиморфизма CCR5 delta32 обследовано 2960 образцов пуповинной крови общественного регистра. В результате исследования выявлен 31 образец с генотипом CCR5 delta 32/delta 32, что составило 1,05%. В 534 образцах аллельный полиморфизм CCR5 delta 32 присутствовал в гетерозиготном состоянии (18,04%).

Таким образом, заявляемый способ определения аллельного полиморфизма CCR5 delta 32 методом ПЦР по сравнению с прототипом снижает трудоемкость и сокращает время проведения исследования, уменьшает себестоимость анализа за счет отсутствия дополнительного этапа исследования (этапа рестрикционного анализа продуктов амплификации), при этом не возникает необходимости в приобретении дополнительных реагентов, в частности дорогостоящей рестриктазы. Данный метод может быть использован для проведения скринингового обследования на носительство аллельного полиморфизма CCR5 delta 32.

Источники информации

1. Deng, Н. Identification of a major co-receptor for primary isolates of HIV-1 / H. Deng, R. Liu, W. Ellmeier [et al.] // Nature. - 1996. - Vol. 381. - P. 661-666.

2. Dragic, T. HIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor CC-CKR-5 / T. Dragic, V. Litwin, G.P. Allaway [et al.] // Nature. - 1996. - Vol. 381. - P. 667-673.

3. Hutter, G. Long-Term Control of HIV by CCR5 Delta32/Delta32 Stem-Cell Transplantation / G. Hutter, D. Nowak, M. Mossner // N. Engl. J. Med. - 2009. - Vol. 360. - P. 692-698.

4. Alters, K. Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Δ32/Δ32 stem cell transplantation / K. Allers, G. Hütter, J. Hofmann // Blood. - 2011. - Vol. 117, №10. - P. 2791-2799.

5. Petz, L.D. Hematopoietic Cell Transplantation with Cord Blood for Cure of HIV Infections / L.D. Petz, I. Redei, Y. Bryson [et al.] // Biol. Blood Marrow Transplant. - 2013. - Vol. 19, №3. - P. 393-397.

6. Кофиади И.А. Распределение аллелей генов CCR5, CCR2 и SDF1, ассоциированных с устойчивостью к ВИЧ-инфекции, в Российских популяциях / И.А. Кофиади, Д.В. Ребриков, Д.Ю. Трофимов [и др.] // Доклады академии наук. - 2007. - Т. 415, №6. - С. 842-845.

7. Патент RU 2249619 C2, 23.04.2003 г. Способ одновременного определения мутаций CCR5del32 и CCR5M303 в гене CCR5 человека, обуславливающих генетическую устойчивость обследуемых к инфицированию вирусом иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ1). Рахманалиев Э.Р., Апрятин С.А., Николаева И.А., Климов Е.А., Сулимова Г.Е., Сидорович И.Г